Technologické aspekty biosensorů nmanipulace se vzorkem – průtočné techniky [USEMAP] Průtočné uspořádání ntechniky používájící pro transport vzorku nebo pomocných reagentů tok nosné kapaliny umožňují zrychlení a automatizaci analytických postupů a prosazují se výrazně i v kombinaci s biosensory jako specifickými detektory nvariantou velmi blízkou biosensoru je použití průtočného bioreaktoru (enzymového či imunochemického) ve spojení s klasickým detektorem (fyzikálním převodníkem) nprůtoková injekční analýza (FIA), sekvenční injekční analýza (SIA) a mikrodialýza [USEMAP] FIA nnástřik vzorku do toku nosného média a jeho naředění – disperze ndisperzní faktor D je dán poměrem původní koncentrace vzorku a maxima koncentrace v zóně procházející detektorem, D = C0/Cmax nvelikost D se může u různých aplikací značně lišit, ale vždy musí být u daného případu dosažena vysoká reprodukovatelnost D n n nFIA systém je tvořen pumpou P, vedením pro nosné médium C (carrier) a eventuální pomocný reagent R npo nástřiku vzorku S (sample) pomocí injekčního ventilu V se obě větve spojí, smíchají v míchací smyčce MC (mixing coil) a nakonec prochází detektorem D do odpadu W (waste) [USEMAP] Pumpa nje nejčastěji peristaltická, základem je krokový motor, ten otáčí diskem, který má na obvodu několik otočných válečků - rolerů. Ty při svém pohybu tlačí na pružnou hadičku, a tak vytlačují kapalinu –je vhodné, aby pumpa měla více kanálů (2 až 4) –výsledný tok je mírně pulzující (odvalování rolerů), hladký tok se dosáhne buď zvýšením otáček pumpy (alespoň 30 rpm) nebo větším počtem rolerů (minimum 2, běžně 4 až 10) –hadičky jsou ze silikonu, tygonu (průhledné PVC) nebo jiných odolnějších materiálů –průměr hadičky spolu s rychlostí otáček určuje průtok, různé hadičky umožňují různé průtoky v jednotlivých kanálech pumpy –delší životnost hadiček se dosáhne promazáním otáčivého systému silikonovým olejem, současně se zmenší i pulzy a ohřev hadiček n nbezpulzní tok dosahují lineární pístové pumpy, (drahé) nprůtoky (flow rate) jsou kolem 0.1 až 5 ml/min, lineární rychlost toku je závislá na průměru trubiček npokud je potřeba pracovat s organickým rozpouštědlem, které narušují hadičky v pumpě, je možné použít uzavřenou láhev naplněnou organickou fází, která se vytlačuje do systému vodou přitékající z pumpy – – – – [USEMAP] FIA součásti npro vedení kapalin se používají hadičky o vnitřním průměru 0.5 až 1 mm, materiálem je polypropylen, teflon, PVC nebo silikonová guma nspojky pro smísení dvou toků mohou být ve tvaru Y, T nebo W nspojovací komponenty zahrnují šroubovací konektory pro spojování trubiček navzájem nebo s ventily či detektory nreakční a míchací smyčky jsou poměrně variabilní; např. ohebné trubičky délky 100 až 1000 mm se hustě navinou do spirály na nosné tyčce průměru 2 až 40 mm, dá využít se i gravitace při proudění ve svislé spirále, jinou možností je náhodně "zauzlovaná" trubička (knitted coil) npoužívají se také různé kolonky naplněné kuličkami, podle průměrů kolonky a jednotlivé kuličky se dostane řada možností od řetězce kuliček (single string glass beads) až po homogenní náplně nlabyrintové komůrky v plastu nmíchané komůrky umožňují vysoké disperzní poměry n [USEMAP] Ventily npro nástřik vzorku, k tomuto účelu se používá 6-cestný dvoupolohový ventil se smyčkou, změnou polohy se smyčka zařadí do hlavního toku média, nástřik se nejjednodušeji provádí ručně nmateriálem je nerez v kombinaci s teflonem nuplatňují se elektricky ovládané ventily solenoidní, s krokovým motorem nebo pneumatické - úplná automatizace průtočného systému [USEMAP] ndůležitá je poloha detektoru vzhledem k proudícímu médiu: nnejběžnější varianta (A) je detektor paralelně s tokem média (wall embeded) ndetektor umístěný v ústí trubičky (B, end on sensor) je často využíván při elektrochemické detekci, je to vlastně jedno nebo více vodivých uhlíkových vláken nkaskádové uspořádání (C) nwall jet cela (D) n n nsignál může být buď maximum nebo plocha píku odpovídající zóně vzorku prošlé detektorem nve druhém případě je zkreslena informace o průběhu gradientu koncentrace Umístění detektoru A B C D det. [USEMAP] FIA mody nsingle line - pro použití ve spojení se zejména biokatalytickými biosensory stačí pouze jednolinkové uspořádání nnástřik vzorku ventilem V může být automatizován přidáním druhé pomocné pumpy nčasto není třeba ani přidávat žádné pomocné reagenty a nosným médiem je vhodný pufr - specifickým detektorem je pak vlastní biosensoru nobměnou může být použití namísto míchací smyčky enzymového reaktoru ve spojení s nespecifickým detektorem, toto uspořádání je výhodné pro enzymy s malou specifickou aktivitou, navíc je životnost bioreaktoru oproti enzymové vrstvě mnohonásobně vyšší nje možné použít odlišné podmínky pro biochemickou reakci (např. potřeba pufru blízkého pH optimu enzymu) a pro vlastní detekci (zvýšení pH pro detekci amoniaku), pro kterou se upraví podmínky přimísením vhodného pufru za výstup bioreaktoru [USEMAP] FIA mody ntwo-line viz dříve nmerging zones - realizovatelné pouze s jednou pumpou jsou, kdy se dvěma ventily nastřikují zóna vzorku a zóna reagentu do dvou linií nosného média, které se poté smíchají; při drahém reagentu (NADH), vyžaduje synchronizaci obou ventilů nreverse FIA – „dostupný“ vzorek se nasává přímo do jedné linie kontinuálně, do druhé se může nastřikovat reagent nzone sampling používá opakovaný nástřik nejprve vzorku a pak jeho naředěné zóny. Časování obou ventilů je rozhodující faktor, lze dosáhnout naředění až 1000x nsample splitting - zóna nastříknutého vzorku se částečně odvádí pryč, kritické místo (*) existuje mezi body odvětvení (divresion) - zóny se vzorkem a místa napojení druhé linie (merging), je zde nízká rychlost průtoku, která má podstatný vliv na dosažené zředění C R P D W W S zone sampling sample splitting S W * C C P D W [USEMAP] FIA mody nhydrodynamic injection - dávkování vzorku bez použití ventilu je nanesení vzorku pomocí dvou pump npři kombinaci P1 zapnutá, P2 vypnutá (P1 on, P2 off) pracuje systém v obvyklém uspořádání npři přepnutí pump (P1 off, P2 on) se nasaje zóna vzorku do smyčky mezi body a, b, přitom je zablokován zpětný tok zavedením výstupu z detektoru do odpadu přes pumpu P1, ta při zastavení tuto linii i další linie uzavře, takže P2 nasává vzorek nkonečně při návratu do výchozího stavu (P1 on, P2 off) se zachycená zóna vzorku pohybuje dále v systému npřesnost dávkování je dána časováním obou pump R C P1 D W hydrodynamic injection W S P2 a b [USEMAP] Naředění v komůrce nzvětšování disperzního faktoru nběžnými postupy (rychlost průtoku, průměr trubiček, objem vzorku, délka míchací kolony) lze ovlivňovat D v rámci jednoho řádu (cca 3 až 20) ndosažení vyššího naředění je možné použitím míchací komůrky (mixing chamber) nnosné médium se vzorkem se nechá protékat rozšířeným místem, případně vybaveným elektromagnetickým mícháním nnevýhodou je záznam ve tvaru nízkého a širokého píku, který zpomaluje měření pasívní aktivní (s míchadlem) plochy píků stejné ale "ocásek" (tail) [USEMAP] FIA titrace nvzorek se nastříkne do linie s míchací komůrkou, a poté se měří plocha píku odpovídající jedné barvě (acidobazického, …) indikátoru ndoba do odbarvení pak určuje spotřebu činidla potřebnou k dosažení bodu ekvivalence C R+I P D W S t1 t2 t3 [USEMAP] FIA splitted flow nvýhodné může být rozdělení zóny vzorku na dvě linie (splitted flow), jedna se např. nechá projít enzymovým reaktorem, před detektorem se obě větve spojí, na záznamu se objeví dvě maxima nstanovení dvou reagentů vedle sebe - např. sacharosa a glukosa ve vzorku: detektor je biosensor s GOD, v bioreaktoru je imobilizována invertasa s mutarotasou; první pík odpovídá volné glukose, druhý pak navíc glukose vzniklé v reaktoru ze sacharosy C P D W S bioreaktor zpoždění v bioreaktoru [USEMAP] FIA stopped flow nzastavení toku (stopped flow) v době, kdy je zóna vzorku v detektoru, může poskytnout cenné informace o dějích v detektoru (biosensoru) npodle tvaru záznamu lze usuzovat na reakční průběh tok zastaven neúplná reakce kompletní reakce rozklad produktu či spotřeba analytu [USEMAP] FIA imuno nprůtočné techniky dnes stále více pronikají také do oblasti imunochemických stanovení, kde přináší zrychlení analýz a zlepšení reprodukovatelnosti výsledků díky opakované regeneraci téhož imunospecifického nosiče nčasto je používán velice komplikovaný systém, nejjednodušší varianta sestává ze dvou pump a ventilů průtočný imunoreaktor D W W W C on R off nasávání vzorku, nanesení na kolonu S D W W W C off R on eluce imunokomplexu, detekce [USEMAP] Lab-On-Chip koncept nsystém integrovaný na čipu – průtočné kanálky (nižší verze na bázi plastového mikrofluidního modulu; ve vyšších verzích na bázi křemíku i mikropumpy, ventily, detektory, …) nsystém zaměřený na jedinou konkrétní aplikaci, změny měřícího protokolu často vyžadují nákladné úpravy čipu npři poruše libovolné části čipu je třeba výměna celého modulu n nalternativa – „programovatelný“ měřící systém n [USEMAP] SIA Sequential Injection Analysis nrobustní, jednoduchá a všestranná technika založená na programovatelném toku látek npřesné odměření mikrolitrových objemů a jejich následné mikrofluidní zpracování použitím reverzního, zastaveného nebo urychleného toku umožňuje návrh stanovení prostřednictvím počítače ve formě „software“ nroztoky prochází kanálky monolitické mikrofluidní struktury, namontované na multikanálový přepínací ventil – koncept Lab-On-Valve n n [USEMAP] SIA / LOV nřízená „syringe“ pumpa pro sekvenční transport roztoků přes ventil do zadržovací smyčky, a z ní pak do průtočné mikrocely (optovláknová detekce) ntypické objemy při stanovení jsou 5 až 25 µl vzorek, reagent 25 to 50 µl a 100 až 200 µl nosný pufr [USEMAP] SIA / LOV nprůtočná cela integrovaná v LOV umožňuje měření absorbance (A, příp. s delší optickou dráhou B) a fluorescence (C) nproměnná konfigurace tvořená přívodními trubičkami, optickými vlákny a zarážkami A B C PMT LED nebo laser lampa detektor [USEMAP] LOV aplikace nenzymová stanovení substratů a inhibitorů nměření enzymové aktivity n„bioligand interaction assays“ (BIA) naffinitní chromatografie nionexová chromatografie nspojení s biosensory n n n nukázka měření koncentrace glukosy pomocí GDH/NAD+ n [USEMAP] Bead injection npoužití průsvitných mikročástic jako vyměnitelného nosiče biorekogniční komponenty nsloupec částic přesně naplní prostor průtočné cely, vazba komplementárních biomolekul se detekuje spektroskopicky (např. v UV pro bílkoviny, při jiných vlnových délkách pro různé kofaktory, …) nkuličky jsou v cele drženy mechanicky pomocí vhodné zarážky s otvorem menším než průměr částice, po měření (nebo po výrazném poklesu vazebné kapacity se obrácením směru průtoku z cely jednoduše vypláchnou nvyšší citlivost než jednoduché průtočné stanovení – akumulace analytu na mikročásticích [USEMAP] CE Capillary electrophoresis npohyb roztoků vyvolán elektroosmotickou silou ndole srovnání profilů fluorescenčních barviv při toku vyvolaném mechanicky nebo elektroosmoticky nelektrokinetické „zaostření“ zóny vzorku nukázka čipu pro CE separace [USEMAP] CE a spol. na čipu nminiaturizace – kombinace s dalšími technikami (PCR, biosensory ...) – ChipShop Text Description automatically generated with medium confidence [USEMAP]