Elektrochemické převodníky •elektrochemický měřící systém tvoří nejméně dvě elektrody - pracovní (měřící) a referentní •imobilizací biorekogniční vrstvy vzniká bioelektroda, nejčastěji se jedná o enzymovou elektrodu •potenciometrické / amperometrické / konduktometrické [USEMAP] Referentní elektrody •slouží jako srovnávací bod k měření nebo nastavení potenciálu pracovních elektrod •potenciál je přesně definovaný a pokud možno časově stálý [USEMAP] Referentní elektrody •miniaturní Ag/AgCl •u biosensorů často kompromis •pouze stříbro (drátek, ploška, …), občas potaženo AgCl [USEMAP] Pomocné elektrody •tvořeny z dobrého vodiče s dostatečnou plochou a elektrochemicky neaktivní •platina (drátek, plíšku, síťka), uhlíková tyčinka, mnohdy stačí i nerezový drát [USEMAP] •Pracovní elektrody pro biosensory zahrnují velmi širokou škálu materiálů i konfigurací: ušlechtilé kovy (Pt, Au), skelný uhlík, grafit a nejrůznější kompozitní směsi, grafen, vodivé polymery, organické vodivé soli •rozsah pracovního potenciálu je třeba volit tak, aby nedošlo k elektrochemickému rozkladu materiálu elektrody nebo k interferenčním reakcím (rozklad vody nebo jiných složek pracovního roztoku, redukce rozpuštěného kyslíku) •důležitá je příprava povrchu elektrody před vlastním měřením nebo imobilizací biomolekul •provádí se leštění povrchu brusnými prášky (diamantový nebo oxid hlinitý), následuje opláchnutí a případně ozvučení ultrazvukem •někdy je třeba odstranit povrchové nečistoty (oxidy kovů) buď pomocí kyselin nebo anodizací [USEMAP] Examples of classic electrodes [USEMAP] Uhlíkové pastové elektrody (CPE) •carbon paste electrode •směs vodivého grafitového prášku a spojovací kapaliny (olej, polymer) •snadná příprava a regenerace povrchu [USEMAP] Pomůcky •cely – míchané, průtočné •stojany •míchací systémy, temperace •Faradayova klec pro stínění •leštící zařízení •propojovací vodiče a konektory [USEMAP] Potenciometrické bioelektrody •základem potenciometrie je změna potenciálu vyvolaná akumulací náboje na rozhraní elektrody s roztokem A - A - A - A - K + K + npřevodníkem je iontově selektivní elektroda (ISE) v kombinaci s enzymovou vrstvou nrozsah měřitelných koncentrací je dán ISE: 10 mM až 0.1 M, pro konečné biosensory typicky 0.1 až 10 mM nodezva je logaritmická (změna potenciálu ∆E přímo úměrná log c) nměří se potenciál pracovní elektrody proti referentní elektrodě - ta musí být kvalitní (časově stálá), přitom v systému neteče proud - je třeba měřící přístroj s velkým vstupním odporem (operační zesilovač) [USEMAP] Potenciometrické enzymové elektrody potenciál ISE pro sledovaný iont (aktivita ai ) v přítomnosti rušivého iontu (aktivita aj ) nskleněná elektroda - H+ - měření pH, běžně dostupná npevné ISE (solid state) - tenká vrstva iontového vodiče: monokrystal nebo směs krystalů, precipitát; homogenní nebo heterogenní (mnohonásobně levnější, vlastní materiál dispergován v inertní matrici (PVC, silikon, ...) nna bázi oxidů kovů pro měření pH: MxOy + 2y(e- + H+) ———® xM + yH2O nebo dva oxidační stavy: 2MOy + 2H+ +2e- ———® (2y-1)M2O + H2O antimonová elektroda Sb/Sb2O3, dále Ir/IrO2 nebo Pd/PdO2 [USEMAP] ISE •ukázka NH3 a CO2 ISE Crytur [USEMAP] Příklady potenciometrických enzymových elektrod •pH : penicilin (penicilinasa), acetylcholin (cholinesterasa), esterasy, nukleové kyseliny (nukleasy) •NH3 / NH4+ : močovina (ureasa), aminokyseliny (oxidační deaminace - glutamát DH, oxidasa L- / D-aminokyselin; α,γ-eliminace amoniaku – L-methionin γ-lyáza), nitrát a nitrit (bakterie) •CO2 : močovina (ureasa), aminokyseliny (lysin dekarboxylasa, tyrosin dekarboxylasa), laktát (laktát monooxygenasa - dekarboxylující oxidasa) •I- : potenciometrická detekce peroxidu vodíku v přítomnosti peroxidasy •F- : peroxid vodíku (peroxidasa - oxidace fluorofenolu) •CN- : amygdalin (β-glukosidasa) • [USEMAP] Polovodičové sensory •výhodou jsou miniaturní rozměry, masová produkce a tudíž nízká cena ve srovnání s klasickými ISE. •základním konstrukčním materiálem je křemík. Jeho vodivost je velmi nízká, avšak přídavkem vhodných stopových příměsí – dopováním - lze jeho vodivost zvýšit - získá se polovodič •podmínkou vodivosti je možnost volného pohybu elektronů u křemíku je základní valenční hladina EV plně obsazena, ale elektrony se na ní nemohou pohybovat. Na vodivostní hladině EC je místo pro pohyb, ale nejsou zde elektrony. Kinetická energie elektronů na EV je za běžných podmínek kolem 0.04 eV, takže nemohou přeskočit na vodivostní hladinu EC 1.1 eV EC EV energetické hladiny elektronů u čistého křemíku (nevodivý) [USEMAP] •zvýšení vodivosti se dosáhne dopováním - atomy z V. (P, As, negativní - n) nebo ze III. (B, Al, pozitivní - p) skupiny periodické tabulky •tak při n dopování se vytvoří donorová hladina elektronů ED těsně pod vodivostní hladinou, takže přenos elektronů z ED na EC je snadný •opačně působí přidání atomů s volnými pozice elektronů (díry, pozitivní dopování), vytvoří se tak akceptorová hladina EA EC EV energetické hladiny elektronů po přidání příměsí e- e- ED EA U polovodičových materiálů se pak hladina, na které je pravděpodobnost obsazení elektrony 50%, nazývá Fermiho (EF). Nachází se mezi EV a EC, její poloha odpovídá množství dopujících atomů. [USEMAP] ISFET ion-sensitive field effect transistor N- N- G gate S source D drain Křemík P- izolace - epoxy pryskyřice R e f Membrána SiO2 schéma zapojení ISFETu VG VD [USEMAP] •odpor mezi S (source) a D (drain) se změní, když se na hradlo G (gate) přivede napětí (změní se elektrické pole) •povrch ISFETu mimo S a D pokryt oxidem křemičitým, oblast hradla G (gate) je potažena selektivní membránou, která je v kontaktu s okolním roztokem •ostatní části jsou izolovány epoxypryskyřicí •potenciál hradla se určuje vzhledem k referentní elektrodě. •jako iontově-selektivní membrány lze použít řadu materiálů •solid-state membrány pro sledování změn pH, materiál Si3N4, Al2O3, Ta2O5 •odezva ISFETů je logaritmická (52-59 mV/pH), masová produkce •polymerní membrány mohou být např. valinomycin/PVC pro stanovení draslíku •heterogenní membrány •tvoří AgCl, AgI, AgCN krystalky v PNF (polyfluorovaný fosfazin). •při výrobě ISFETů se používá litografie • •Jiří Janata – jeden z průkopníků •(University of Georgia, Atlanta) • • [USEMAP] ISFETy [USEMAP] LAPS biosensory •konstrukčně jednodušší než ISFETy, možné připojení kontaktů ze strany, která není v kontaktu s roztokem •základem křemíkový čip potažený vrstvami oxidu křemičitého a nitridu křemíku •povrch rozdělen na několik aktivních oblastí pomocí další vrstvy SiO2, celý čip má pouze jeden kontakt •v neosvětleném stavu neaktivní •pokud se z druhé strany osvětlí (IR LED, při 940 nm pronikne světlo do křemíku 50 nm hluboko), dojde k lokální aktivaci a získá se signál odpovídající změnám pH v aktivované („adresované”) zóně •výhodou jednoduché vícekanálové měření • [USEMAP] LAPS potenciostat LAPS struktura pracovní roztok se substrátem biomembrána výměnný páskový sensor s biovrstvou přítlak LEDky pro “adresování” LAPS biosensor Threshold „light addressable potentiometric sensor“ referenční a pomocná electroda [USEMAP] Cytosensor •Cytosensor microphysiometer (Molecular Devices) se používá pro testování toxicity nebo fyziologických účinků léčiv. Do komůrek se imobilizují buňky (bakteriální nebo tkáňová kultura - fibroblasty, keratinocyty, rakovinné buňky, 104 až 106). •Při mírném průtoku médía se část buněk zachytí na povrch a v přítomnosti substrátu vyvolávají určitou změnu pH, která je úměrná metabolické aktivitě; např. respirací glukózy vzniká kyselina mléčná a oxid uhličitý. •Po přídavku testované látky se pak zaznamená odezva jako časová změna dpH/dt. Na konci pokusu se rychlým průtokem buňky z komůrek vypláchnou a lze začít další cyklus. •Vhodné účinek růstových regulátorů, hormonů, lymfokinů, virů nebo virostatik. křemík (P nebo N) ( [USEMAP] Amperometrické sensory •založeny na heterogenním přenosu elektronů mezi elektrodou a redoxním párem molekul •poskytují jako signál proud, který je úměrný koncentraci analytu. Proud I se obvykle měří při konstantním napětí (potenciál E) pracovní elektrody •velikost proudu prošlá za daný čas t v systému udává náboj Q, který odpovídá molárnímu množství látky přeměněné na elektrodách: Q = I t = n F m / Mr F = 96487 C/mol značí Faradayovu konstantu •k elektrochemické oxidaci látek dochází na anodě (I > 0), redukční děje (I < 0) probíhají na katodě •směr proudu je totožný se směrem toku pozitivních ekvivalentů (nábojů) Xred Xox e- [USEMAP] Amperometrické měření •je možné provádět v dvou- nebo tříelektrodovém uspořádání; •pro první systém se napětí na pracovní elektrodě W (working) nastavuje proti pomocné elektrodě A (auxiliary, resp. counter) •v tříelektrodovém uspořádání se navíc použije referenční elektroda R, vůči které se nastavuje potenciál pracovní A V - + A V - + Aux Work Ref 2-E 3-E [USEMAP] Potenciostat •zařízení, které udržuje konstantní potenciál pracovní elektrody vůči referentní nezávisle na procházejícím proudu _ + _ + _ + _ + Uout = RMI rozsah - RM I Uin příklad konstrukce potenciostatu nzpracování měřených signálů lze provádět pomocí zapisovače, nebo lépe použitím počítače vybaveného analogově-digitálním převodníkem (A/D); pomocí digitálně-analogového převodníku (D/A) lze řídit pracovní napětí. [USEMAP] Potenciostat •moderní digitální konstrukce - analogový obvod řízený A/D (sběr dat) a D/A (nastavení excitačního potenciálu) převodníky nobr. - mikroprocesorem řízený osmikanálový potenciostat, výstup dat na externí počítač přes RS232 rozhraní [USEMAP] Měřící techniky •dle časového průběhu potenciálu na pracovní elektrodě •nejjednodušší je amperometrie •chronoamperometrie umožňuje získat informace o přechodných elektrodových jevech po skokové změně potenciálu •pulsní amperometrie zvyšuje podíl signálu vůči šumu •lineární a zejména cyklická voltametrie mají důležitou úlohu při vývoji amperometrických biosensorů •pulsní voltametrické techniky již vyžadují poměrně drahé přístrojové vybavení, i když potřebné pulsy lze relativně snadno generovat pomocí počítače s D/A převodníkem. č as E Amperometrie chronoamp . pulsní Voltametrie lineární cyklická normální square diferenciální pulsní wave pulsní Techniky založené na měření proudu [USEMAP] Amperometrické techniky •závislost potenciálu E v čase t: • •amperometrie chronoamperometrie pulzní amperometrie • • • E t I t vzorek vzorek akumulace produktu = lepší citlivost lepší signál/šum [USEMAP] Voltametrie •užitečné zejména při vývoji enzymových elektrod - optimalizace •pulzní voltammetrické techniky normal square differencial pulse wave pulse E t I t linear sweep I t cyclic (CV) I E [USEMAP] Elektrochemické měřící zařízení •„laboratorní verze“ •enzymová elektroda v míchané nádobce •potenciostat s LCD a zapisovačem •jednoúčelový systém •… ~ 1990 [USEMAP] Analyzátory •Metrohm Polarecord •EGG PAR 173 •EGG PAR 263 •Autolab • [USEMAP] Amperometrické detektory •ABD (Universal Sensors) •ADLC2 (Lab. Přístroje) •… ~ 1995 [USEMAP] Ruční systémy •PalmSens •Univ. Florence •MEB (MU) •iStat • •… ~ 2000 [USEMAP] Kapesní systémy [USEMAP] Plugin systémy •Emstats (Palm Instruments) •Microflow system (BVT Technologies) • •připojte k USB portu ... • (nebo k Bluetooth) •… ~ 2020 [USEMAP] Konektory… •opravdu různorodé (trochu to uživateli zkomplikovat) [USEMAP] Měření kyslíku a H2O2 •Clarkův sensor Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCl elektroda elektrolyt membrána propustná pro O2 Elektrodová redukce kyslíku (-750 mV) je čtyřelektronový proces: O2 + 2 H2O + 2 e- H2O2 + 2 OH- H2O2 + 2 e- 2 OH- Elektrodová oxidace peroxidu vodíku (> 600 mV): 2 H2O2 2 H2O + O2 + 2 e- + 2 H+ výhodou sensoru je prakticky absolutní specifita pouze ke kyslíku - rušivé látky nemohou projít předřazenou membránou. Konstrukce elektrody pro stanovení peroxidu vodíku je podobná kyslíkové s tím rozdílem, že není použita plynopropustná membána a používá se pozitivní polarizace, při které nastává anodická oxidace peroxidu [USEMAP] Kyslíkový sensor (ne elektroda) [USEMAP] Enzymové elektrody s oxidasami •tyto enzymy oxidují molekulu substrátu (analytu) za účasti kyslíku, přitom vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: substrát + O2 produkt + H2O2 • substrát + O2 produkt + H2O •detekce peroxidu je obecně citlivější (nulová výchozí hladina) noxidace peroxidu vodíku je spojená s nebezpečím interference ze strany jiných oxidabilních látek, např. v séru mohou vadit kyseliny askorbová a močová či paracetamol nspecifita se dá zlepšit předřazením kontrolní membrány, která omezí přístup interferujících látek [USEMAP] Přehled oxidas [USEMAP] Enzymové elektrody s dehydrogenasami •největší skupinou oxidoreduktas jsou dehydrogenasy (existuje přes 250 NAD+ a 150 NADP+ dependentních enzymů), analyticky významné druhy jsou shrnuty v tabulce •katalyzující redoxní reakce s účastí NAD(P)+ / NAD(P)H: Přehled dehydrogenas substrát + NAD(P) + + 2 e - + H + produkt + NAD(P)H [USEMAP] Detekce NAD(P)H •elektrochemická detekce NADH je možná amperometrickou reoxidací vznikajícího NADH (E° -560 mV/SCE); přímá oxidace vyžaduje vysoký potenciál (přes 1 V na uhlíku), nastává dimerizace a adsorpce produktů na povrch elektrody •reoxidace se může provést lépe prostřednictvím modifikujících látek (E° -200 až -50 mV) vázaných na povrchu elektrody •nejčastěji se používají fenaziny, fenoxaziny a fenothiaziny, oxidace nastává již kolem 0 V/SCE •lze užít také hexakyanoželezitan nebo TTF.TCNQ •průběh reakce je homogenní - vzniká charge transfer komplex CT, po rozpadu je pak reoxidován mediátor, přitom E > E° •lze pracovat při nižším potenciálu [USEMAP] Přenos elektronů z biomolekul •přímý přenos elektronů pro konstrukci biosensorů je tento proces atraktivní - zjednodušil by konstrukci; bohužel, přímý přenos elektronů z biomolekul na elektrody byl pozorován u malých redoxních bílkovin (cytochromy c a b, azurin, ferredoxin) a některých enzymů (lakáza, peroxidáza). • substrát Eox e- produkt Ered npřímý reversibilní přenos elektronů z biomolekuly (bílkovina, nukleová kyselina) je obvykle ztížen řadou faktorů. nv bílkovinách se sice vyskytuje celá řada redoxně aktivních skupin (disulfidické můstky, Fe-S skupiny, flaviny, hem, řada iontů kovů), ale nachází se obvykle uvnitř molekuly nkontakt redoxní skupiny s povrchem elektrody je možný pouze pro určitým způsobem orientované molekuly, coý výrazně snižuje proudové odezvy. Velikost molekuly zase vede k velmi pomalé difúzi. nnavíc se biomolekuly často adsorbují pevně na povrch elektrod a dochází tím současně k jejich denaturaci. [USEMAP] Přenos elektronů z biomolekul •pro usnadnění výměny elektronů mezi enzymy a elektrodou se používají nízkomolekulární redoxní látky – mediátory •použití mediátorů urychluje a obvykle vůbec umožňuje výměnu elektronů mezi aktivním centrem enzymu a elektrodou. substrát Eox Mred e- produkt Ered Mox nreaguje s biokomponentou a elektrodou ndostatečně rychlý přenos elektronů (měla by být známa stechiometrie a počet přenášených elektronů) nstabilní formy (redukovaná i oxidovaná) za podmínek použití nneúčastní se postranních reakcí (např. s kyslíkem) nvhodný redoxní potenciál (větší rozdíl redoxních potenciálů E° mezi enzymem a mediátorem sice zvětší užitečný proud, současně však naroste také šum, nebezpečí interferencí a doba ustalování pozadí) nbez vlivu pH na průběh redoxní reakce nnetoxický (např. pro aplikace in vivo) nvhodný k imobilisaci (nerozpustný či snadno adsorbovatelný) n Požadavky na mediátor [USEMAP] Mediátory [USEMAP] Použití mediátorů přímý přenos v roztoku v micelách v elektrodě kovalentně na 3D-polymerní navázaný na elektrodě mediátor enzym [USEMAP] Biosensor pro glukosu Enzymová elektroda na jedno použití Měřící jednotka [USEMAP] Konduktometrie •střídavé napětí (sinusoidální vlnění) se přivádí na dvouelektrodový systém •neuplatní se faradaické procesy, konc. polarizace, nabíjení dvoj-vrstvy •mimo velikosti napětí Vm (běžně kolem 100 mV) lze měnit i frekvenci f (ω=2πf "spektroskopie") •studuje se odezva systému (elektrody a prostředí mezi nimi), měří se proud i a jeho fázový posun θ. nImpedance nImpedance Z je vektorová veličina charakterisující chování systému v přítomnosti střídavého napětí. Jako komplexní veličina má velikost |Z| a úhel θ, nebo složky reálnou R (resistance) a imaginární X (reaktance). Platí pro ni následující vztahy: n n Z = R + jX tgθ = –X/R |Z| = (R2+X2)1/2 |Z| = Vm/im [USEMAP] Konduktometrické biosensory •sledování změn vodivosti při biochemických reakcích vyžaduje produkci či spotřebu iontů nebo změny velikosti nabitých částic. Produkce iontů je spojena s účinkem hydrolas a amidas, změna velikosti nabitých částic probíhá u reakcí fosfatas, sulfatas či nukleas. Velmi pohodlně tak lze např. provádět stanovení neutrálních lipidů, které po naštěpení lipasou poskytují ionty. Klasickým příkladem je však reakce ureasy při stanovení močoviny: NH2CONH2 + 3 H2O ¾® 2 NH4+ + HCO3- + OH- •problémem je vlastní vodivost pracovního prostředí (použití málo vodivých pufrů - organické, např. imidazol); také změnu vodivosti vyvolanou samotným přídavkem vzorku je třeba odlišit, je žádoucí zanedbat změny vodivosti v celém roztoku a sledovat především těsné okolí elektrod s imobilisovanými enzymy (vlastní signál v důsledku bioreakce), proto se výhodně používá diferenční uspořádání. [USEMAP] Konduktometrické převodníky ukázka dvojitého konduktometrického převodníku (sítotisk, rozměry 7 x 25 mm) [USEMAP] „Interdigitated“ elektrody (IDE) nprstovité elektrody n Bodeho vs. Nyquistův výnos [USEMAP] Optické převodníky •zdroje světla: •lasery •světloemitující diody (LED) •výbojky (pro UV oblast - Xe) •lampy (halogenové, deuteriové) •detektory pro měření intenzity světla: •fotonásobiče - jsou nejcitivější, nevýhodou je potřeba vysokého napětí •fotodiody „avalanche“ - o něco méně citlivé, větší šum •obyčejné fotodiody (1000x méně než fotonásobiče), vykazují větší šum (malý vnitřní odpor), velmi levné, mechanicky stabilní a vhodné zejména pro přenosná zařízení •fotodiodová pole - DAD „diode array detector“ - lineární řada fotodiod vedle sebe (100 - 2000), profil intenzity v závislosti na úhlu dopadu (spektrum) •CCD resp. CMOS prvky (videokamery) - plošný profil intenzity, „image“ techniky • [USEMAP] Princip laseru •Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (zesilování pomocí stimulované emise) •světlo ve formě úzkého svazku, je polarizované, koherentní a monochromatické •složky: aktivní prostřední, rezonátor, zdroj energie •funkce: zdrojem energie je do aktivního média pumpována energie, vybudí elektrony, ty při pádu na nižší energetickou hladinu vyzáří fotony •fotony následně vrážejí do dalších elektronů, zase je vybudí = zesilování toku fotonů, jestliže tok dopadne na zrcadlo s odrazivostí 100% je zpátky odražen do zesilovacího procesu, nebo narazí na polopropustné zrcadlo, které paprsek propustí ven •aktivní prostředí - oddělené kvantové energetické hladiny elektronů •plyn nebo směs plynů (plynové lasery) •monokrystal - hladiny vznikají dopováním (pevnolátkové) •polovodič s p-n přechodem (u diodových laserů) •polovodičové multivrstvy – jsou základem kvantových kaskádních laserů •přechod elektronů z vyššího do nižšího stavu při současném vyzáření fotonu: •spontánní emise (při nízkém stupni obsazení vyšší hladiny) •stimulovaná emise (generace laserového záření) - je třeba čerpáním dosáhnout tzv. populační inverze, kdy vyšší hladina je obsazena více elektrony než nižší [USEMAP] He-Ne laser [USEMAP] Lasery • [USEMAP] Fotonásobič •PMT, Photo Multiplier Tube •citlivá el. součástka k registraci slabého záření • •princip: •záření dopadající na fotokatodu z ní uvolní několik primárních elektronů •v el. poli jsou tyto elektrony urychlovány k dalším elektrodám (dynodám), na každé z nich uvolní další sekundární elektrony •vzniká stále silnější proud elektronů, který vyvolá v měřicích obvodech fotonásobiče elektrický impulz •kanálová konstrukce [USEMAP] Další fotodetektory •Fotorezistor •princip - vnitřní fotoelektrický jev, nelineární, pomalý (závisí na osvětlení), snižuje odpor s rostoucím ozářením •monokrystal polovodiče nebo polykrystalická tenká vrstva (CdS) nanesená na nosné destičce, dva kontakty, hermetické pouzdro zaručujícím přístup záření •Fotodioda •PN a PIN, foton vstupující do polovodiče s dostatečnou energií může být absorpován, přičemž vzniklý volný elektron a díra vytváří v polovodiči napětí (fotovoltaický jev) nebo zvětšují jeho vodivost (fotovodivostní jev) •lavinové (avalanche) PIN fotodiody - vykazují vlastní zesílení. Toto zesílení fotoproudu je způsobeno přiložením napětí, které urychluje dopadajícími fotony vzniklé nosiče náboje natolik, že při srážce s mřížkou krystalu polovodiče dojde k vyražení dalších (sekundárních) elektronů •Fototranzistor •místo báze dopadá světlo, zesílení 10 až 100x [USEMAP] CCD detektor AvaSpec Focussing mirror Detector Collimating mirror Grating Slit, mode stripper SMA connector [USEMAP] Porovnání detekčních elementů Detector TAOS 102 HAM256 HAM1024 SONY2048 Type Photo diode array CMOS linear array CMOS linear array CCD linear array # Pixels, pitch 102, 85 µm 256, 25 µm 1024, 25 µm 2048, 14 µm pixel width/height 77 x 85 µm 25 x 500 µm 25 x 500 µm 14 x 56 µm Sensitivity (HL2000, 8 µm fiber) 3400 counts @ 5ms int. time (AvaSpec-102) 3000 counts @ 100 ms int. time 3000 counts @ 200 ms int. time 13000 counts @ 2ms int. time Peak wavelength 750 nm 500 nm 500 nm 500 nm Signal/Noise 1000:1 10.000 :1 10.000 :1 1000 :1 Dark noise Ca. 11 counts Ca. 22 counts Wavelength range 360-1100 nm 200-1000 nm 200-1000 nm 200*-1100 nm Frequency 2 MHz 330 kHz 330 kHz 2 MHz [USEMAP] Optické převodníky •pomocné prvky •zrcadla (normální, polopropustná), hranoly •mřížky, filtry •štěrbiny, závěrky •polarizátory, depolarizátory •lampy (halogenové, deuteriové) •světlovodné prvky •planární (vrstvy) •cylindrické (optická vlákna) • • •přesná výroba, nákladné • [USEMAP] Optická vlákna šíření paprsku ve světlovodu jádro (core) - index lomu n1 plášť (cladding) - n2, n2> If [USEMAP] Měřící konfigurace •při tzv. intrinsic sensing optický vodič neslouží jen pasivně pro vedení světla, ale chemické změny v těsném okolí světlovodu se sledují na základě vyvolaných změněných podmínek pro vedení uvnitř světlovodu Při vedení světla uvnitř světlovodu dochází k interferenci mezi dopadajícím a odraženým světelným paprskem a tím vzniká elektromagnetické stojaté vlnění kolmé k odrážejícímu povrchu (tlumená vlna, evanescent wave) V tenkém světlovodu připadá na jednotku délky mnohem více odrazů. Světlo se začíná šířit pouze v určitých diskrétních modech, daných pouze určitými úhly dopadu. Mody lze určit na základě průměru světlovodu, indexů lomu a vlnové délky světla. Za těchto podmínek se mimo jiné zachovává fázová koherence laserového paprsku. [USEMAP] Exponenciální vlna •elektromagnetická vlna se šíří do okolí mimo světlovod, přitom její intenzita klesá exponenciálně se vzdáleností od rozhraní („exponenciální vlna“) •na vnějším povrchu světlovodu může docházet k interakcím s přítomnými látkami •energetické profily exponenciální vlny jsou pro tři základní mody ukázány na obrázku •pro vyšší mody narůstá podíl „vnější energie“ a zvětšuje se penetrační hloubka. mod: 0 1 2 z E [USEMAP] Enzymové optody •Přímé typy - opticky měřená látka (nejčastěji fluorofor) se přímo vyskytuje v biokatalytické reakci. •NADH - poměrně „slabý“ fluofor (Φf = 0.02), extinkční a emisní maxima jsou při 350 a 450 nm. Biorekogničním elementem jsou dehydrogenasy imobilisované před koncem optického vlákna. Aby se i koenzym dal zachytit v systému biosensoru, používá se jeho konjugát s polyethylenglykolem, který neprochází dialysační membránou. Výhodná je konstrukce sensoru pro alkohol, kde je vzorek oddělen mikroporézní teflonovou membránou, NADH se nachází ve vnitřním roztoku sensoru. •Existuje řada pokusů využít fluorescenci flavinových koenzymů (FADH2, FMNH2) vázaných pevně v molekule mnoha oxidas. Při vyšší koncentraci substrátu se zpomaluje zpětná oxidace redukované formy kyslíkem a intensita „vnitřní“ (intrinsic) fluorescence redukovaného koenzymu narůstá. Výhodou je reversibilita takového systém •U sensorů využívajících celé buňky se sleduje vnitřní fluorescence NADH (je úměrná metabolické aktivitě). •Chlorofylové optické sensory se konstruují pro detekci toxicity působené látkami inhibujícími fotosystém u rostlin. • [USEMAP] Enzymové optody •Nepřímé („mediované“, extrinsic) optické biosensory využívaji optické indikátory. Nejčastější jsou optické sensory pro měření kyslíku a pH. •sledování kyslíku využívá zhášení fluorescence indikační molekuly, pokles intensity fluorescence je dán Stern-Volmerovým vztahem: • • • •Indikátor se obvykle nachází v silikonové vrstvě před čelem optického vlákna. Nejčastěji se používá kyselina pyrenmáselná (pyrenebutyric acid, PBA), excitace při 350 až 400 nm; další možnosti jsou perylen a dekacyklen, organokovové komplexy ruthenia lze výhodně excitovat při 460 nm, takže jako zdroj může sloužit modrá LED. npH změny lze sledovat pomocí acidobasických indikátorů. Z fluorescenčních lze použít např. 1-hydroxypyren-3,6,8-trisulfonovou kyselinu (HPTS, pH přechod 5 až 8) nebo 4-methyl-umbelliferon. Absobčních indikátorů je celá řada, kresolová zeleň a bromthymolová modř. [USEMAP] Optoda pro kyslík •Mettler-Toledo [USEMAP] Luminiscence •je to emise světla z molekuly v excitovaném stavu, který vznikl jako důsledek chemických reakcí •kvantový výtěžek luminiscence odpovídá podílu počtu vyzářených fotonů a excitovaných molekul, u přírodních systémů může dosahovat až 90% •intenzita I vyzařovaného světla je závislá na čase, v určitém okamžiku prochází maximem (tmax) vztah mezi luminiscencí a látkovým množstvím analytu se určí kalibrací • aktivace rozpad [USEMAP] Chemiluminiscence •účinnost luminiscence závisí na chemickém výtěžku reakce poskytující aktivovaný meziprodukt (B*), podílu excitovaných molekul a konečně na fluorescenčním výtěžku (ten by se měl blížit 1) •aktivovaný meziprodukt je výhodnější v singletovém stavu; delší životnost tripletového stavu zvyšuje pravděpodobnost„zhasnutí“ ve vedlejší reakci. •pro citlivou detekci peroxidu vodíku se používá luminol (5-amino-2,3-dihydroftalazin-1,4-dion); intensita světla je úměrná koncentraci H2O2, jako katalyzátor se může uplatnit ferrikyanid, hemin nebo v neutrálním prostředí peroxidasa, v nevodném prostředí vyvolá luminiscenci jen kyslík a báze •celkový výtěžek je pouze 0.01 (špatná fluorescence) • [USEMAP] Bioluminiscence •emise světla při (bio)chemické reakci v živém organismu (cca 1000 druhů) se účastní enzymy luciferasy; tyto enzymy štěpí substrát luciferin (různé druhy dle organismu), přičemž dochází k emisi světla •světluška (firefly, Photinus pyralis) luciferasa (EC 1.13.12.7) oxiduje příslušný luciferin za účasti ATP, emise při 560 nm, výtěžek asi 0.88 (!): [USEMAP] nmořské bakterie (Vibrio fischeri, V. harveyi, Photobact. phosphoreum) luciferasa (EC 1.14.14.3) až 5% obsahu buňky, oxiduje aldehydy (>C8, dekanal, tetradekanal); v buňce obsahují i NAD(P)H:FMN oxidoreduktasu: n n n n ncož umožňuje napojení na dehydrogenasy - spolu s bakt. luciferasou jsou imobilisovány na konec optického vlákn [USEMAP] Aplikace bioluminiscence •citlivá detekce ATP - 10–12 M, stanovení biomasy •stanovení s účastí ATP (kreatin kinasa, ATPasa, pyruvát kinasa, ...) •specifická detekce druhu mikroorganismů pomocí bakteriofágů nesoucích lux gen (z Vibria, u světlušek luc geny) •citlivá detekce těžkých kovů (rtuť, arsen): genový konjugát mer-lux (mer je promotor aktivovaný Hg) je vpraven do plasmidů v E. coli, v přítomnosti rtuti se aktivuje, proběhne exprese luciferasy a následuje luminiscence, citlivost 200 nM rtuti •stanovení Ca2+ - působí rozpad a luminiscenci fotoproteinu (peroxoforma luciferinu vázáná v komplexu s luciferasou, Aequorea) [USEMAP] Zhodnocení optod •Výhody: není třeba referentní prvek imobilizovaná fáze nemusí být ve fyzikálním kontaktu s optickým systémem (snadná výměna biovrstvy) stabilní kalibrace (zvláště při použití dvou vlnových délek) současně mohou reagovat na několik analytů (různé reagenty, různé vlnové délky) - vysoká hus-tota přenosu informací nemají vliv interference elektromagnetické povahy (lze provádět měření na velké vzdálenosti) při použití v živém organismu nehrozí elektrický šok (při zkratu) •Nevýhody: není reference při měření intenzity světla (svítivost zdroje kolísá), proto je třeba kalibrace ve dvou bodech dynamický rozsah je omezený (pro pH 2 až 6 řádů, elektrochemicky 12!) odezvy jsou často pomalé dlouhodobá stabilita je limitována vyčerpáním indikátoru (fotorozklad, raději "svítit" méně intenzivně) vadí světlo z okolí • [USEMAP] Kalorimetrické biosensory •využívají změny teploty v průběhu enzymových reakcí (některé typické příklady jsou uvedeny v tabulce). Při konstrukci biosensorů to je spíše okrajová záležitost, ale existují některé analyty, pro které mohou být kalorimetrické převodníky zvláště výhodné. Meze detekce bývají do 10 µM, rozlišení 0.001 °C; vývoj tepla při biochemických reakcích (–kJ/mol): •Katalasa GOD Hexokinasa Laktát DH Ureasa Urikasa •H2O2 glukosa glukosa pyruvát močovina kys. močová •100 80 28 62 61 49 • •pokud vlastní reakce s analytem neuvolňuje teplo, lze zařadit následný krok uvolňující teplo: oxidasa ¾¾® H2O2 ¾¾® kataláza hydrolasy ¾¾® anion + H+ ¾¾® hydratace na H3O+ •hydratační teplo protonu činí v Tris pufru ΔH = –48 kJ/mol, ve fosfátu je ΔH = –4.7 kJ/mol •recyklační pochody umožňují produkci tepla několikanásobně zvýšit [USEMAP] Termistor •převodníkem je obvykle termistor, jeho odpor R závisí na teplotě T: 1/T = a + b ln R + c (ln R)2 •často se pracuje v průtočném sytému s enzymovým reaktorem tepelně izolovaným od okolí •použití diferenciálního uspořádání umožňuje pracovat při teplotě místnosti •měření odporu termistoru se provádí pomocí Wheatstoneova můstku •jiný převodník může být termočlánek (CMOS) Výhodou je, že nevadí částice ve vzorku, interferující látky nebo zbarvení. Někdy také jiné metody mohou být dost těžkopádné, např. stanovení triglyceridů lipázou se sleduje kalorimetricky velmi výhodně [USEMAP]