Enzymy •bílkoviny velké 10 až 100 kDa (typicky), fungují jako biokatalyzátory –každá metabolická reakce má svůj enzym… •jednoduché (polypeptidový řetězec) •složené (holoenzymy) z apoenzymu (bílkovina) a kofaktoru •kofaktor – ion kovu, nebo koenzym, nepeptidová složka •koenzym – prosthetická skupina nebo kosubstrát [USEMAP] •dvojí charakter: –z hlediska látek, se kterými enzym reaguje (nazývají se substráty) –z hlediska reakce, kterou enzym katalyzuje •žádný ze substrátů přitom nereaguje postranními neproduktivními reakcemi •vznikají pouze specifické produkty •molekulární rozpoznávání na bázi strukturní komplementarity •aktivní místo – část molekuly enzymu, kam se váže substrát a probíhá tam katalytická reakce •vazebné místo a katalytické místo (aktivní centrum) Specifita [USEMAP] Třídy enzymů 1.oxidoreduktasy 2. 2.transferasy 3. 3.hydrolasy 4. 4.lyasy 5. 5.isomerasy 6. 6.ligasy [USEMAP] §enzymy – bílkoviny s aktivním místem, v němž je substrát přeměňován na produkt(y): k1 k2 E + S ES E + P k-1 §Michaelisova konstanta Km = (k-1+k2)/k1 §rychlost přeměny substrátu: v = vmax[S]/(Km+[S]) § saturační závislost – kalibrace je lineární pokud platí [S] << Km pak v = vmax/Km[S] • Enzymové sensory [USEMAP] Měření koncentrace substrátu •Stanovovaná látka je imobilizovaným enzymem konvertována •na produkty detekovatelné vhodným převodníkem •Obvykle je možné pro daný analyt navrhnout více konfigurací •biosensoru • •Přehled: §Sacharidy §Alkoholy, fenoly §Karboxylové kyseliny, aminokyseliny §Dusíkaté sloučeniny • [USEMAP] Sacharidy •glukosa §důležité měření v klinické praxi (normální hladina v krvi 5 mM, v moči 1 mM) – potřebný rozsah 0.1 až 20 mM § §glukosa oxidasa (β-D-glukosa : O2 1-oxidoreduktasa, EC 1.1.3.4, GOD), je běžně dostupná z plísní Aspergillus niger nebo Penicillinum notatum. GOD je dimer se dvěma FAD kovalentně vázanými na podjednotky, obsahuje asi 16% glykosylových zbytků, molekulová hmotnost je 160 kDa, specifická aktivita komerčních preparátů přesahuje 200 IU/mg a je velmi stabilní. §PQQ-dependentní glukosa dehydrogenasa z bakterie Acinetobacter calcoaceticus (EC 1.1.99.17, PQQ značí koenzym pyrolochinolinochinon); snadno přenáší elektrony na mediátory (ferrocen), a má velmi vysoké číslo přeměny - poskytuje nejvyšší signál. GOD (podjednotka, FAD červeně) [USEMAP] Biosensory pro diabetiky §v oblasti klinické biochemické analýzy zůstává stále středem zájmu měření hladiny glukosy u diabetiků § §diabetes mellitus (cukrovka) a s ním spojené komplikace tvoří v dnešní době velký sociální problém §kromě běžných poruch souvisejících s diabetem, jako je hyperglykemie, metabolická acidóza a glykosurie, se u diabetiků vyskytují i další komplikace, které výrazně ovlivňují kvalitu života pacientůregulace je však u diabetiků porušena a musí se docílit vnějším podáváním insulinu §dávkování však vyžaduje znalost aktuální hladiny glukosy, takže pacienti jsou nuceni několikrát denně sami měřit glykemii §velmi dobré uplatnění biosensorů [USEMAP] Diabetes mellitus („cukrovka“) §klinicky definován jako chronické, endokrinní a metabolické onemocnění, vznikající v důsledku nedostatečného působení insulinu §existují dva typy tohoto onemocnění: 1. typ neboli inzulín-dependentní diabetes mellitus (IDDM, četnost 3 až 7 případů na tisíc osob) je charakterizován sníženou nebo prakticky chybící produkcí inzulínu, takže pacienti ho musí denně přijímat v injekčních dávkách 2. typ je inzulín-independentní diabetes mellitus (NIDDM), pacienti na vlastní nebo injekčně podaný inzulín nereagují (rezistence) §vznik a vývoj komplikací při tomto onemocnění je velmi těsně spjat s porušenou regulací hladiny krevní glukosy [USEMAP] Regulace hladiny glukosy §za normálních okolností je koncentrace glukosy v krvi udrožována mezi 4.4 a 6.6 mM pomocí zpětné vazby §nárůst koncentrace glukosy po jídle stimuluje rychlé uvnolnění insulinu, který umožní vstup glukosy dovnitř buněk a současně zabrání její tvorbě v játrech [USEMAP] Biosensory pro diabetiky §první osobní glukometr na bázi výměnného elektrochemického biosensoru představila firma MediSense §ExacTech - velikost psacího pera do kterého se zasunovaly měřící pásky na jedno použití §Companion - formát karty §MediSense nyní patří do skupiny Abbott Laboratories, současný její glukometr je distribuován pod názvem Precision QID §proti předchozím verzím potřebuje nyní pro analýzu pouze 5 mikrolitrů krve, takže pacient je méně zatěžován. [USEMAP] Biosensory pro diabetiky •elektrochemické sensory §Elite (pro analýzu stačí 3 mikrolitry krve) vyrábí japonské firmy Matsushita a Kyoto Daiichi Kagaku, distribuje Bayer §Accu-Chek Advantage (Boehringer Mannheim) na rozdíl od ostatních nevyužívá k výrobě biosensorů sítotisk, ale originální vícevrstvou laminátovou technologii •reflektometrické systémy §Encore (Bayer), §One Touch (existuje ve verzích Basic a Profile), vyrábí firma LifeScan patřící pod Johnson & Johnson) §Accu-Chek (verze Instant a Easy, Boehringer). [USEMAP] Srovnání formátu biosensorů [USEMAP] Testování glukometrů §srovnání údajů z biosensoru se skutečnou koncentrací §rozložení výsledků v hodnotící síti §Parkes error grid analysis (EGA), ISO 15197:2013, zavedl už Clark v 1987 § §A v rámci 20% chyby §B mimo 20%, ale nebude následkem nevhodná léčba §C povede ke zbytečné léčbě §D nebezpečné výsledky – selhání odhalení hyper- nebo hypoglykemie §E zcela naopak - zamění se hyper- a hypoglykemie [USEMAP] Hlavní cíl do budoucna §implantovatelný glukosový biosensor pro měření in vivo §přímé řízení pumpy dávkující kontinuálně insulin podle okamžité potřeby pacienta §výsledky vývoje prováděného paralelně asi na desítce různých pracovišť v celém světě nadějné - po implantaci fungují biosensory až 100 dnů §problémy jsou zejména se spolehlivostí a dostatečně dlouhou operační stabilitou. [USEMAP] Současný stav §“nastřelení“ sensoru §připojení vysílací jednotky §inzulínová pumpa § § §kontinuální subkutánní infuze inzulinu §kontinuální monitorování glykemie §terapeutická edukace § §= předpoklady pro optimální substituci inzulinu u osob s DM1 a suplementaci inzulinu u osob s DM2 § § §Obrázky – Rudolf Chlup IMGP8850 [USEMAP] Monosacharidy •galaktosa §monosacharid, potenciálně toxická při poruchách odbourávání; hladina v séru normálně pod 0.25 mM §galaktosa oxidasa (EC 1.1.3.9, kuproprotein), má afinitu k oběma anomerům •fruktosa §alternativní sladidlo v potravinářství §fruktosa dehydrogenasa - membránově vázaná, přenos elektronů prostřednictvím cytochromů •kyselina askorbová (vitamin C) §v potravinách, ovoci, a mnoha vitaminových preparátech §askorbát oxidasa (EC 1.10.3.3, kuproprotein) [USEMAP] Disacharidy •sacharosa §disacharid, potravinářstvi, cukrovarnictví §multienzymové stanovení: hydrolyzuje se invertasou (EC 3.2.1.26) na α anomer glukosy a fruktosu, poté se pomocí mutarotasy (EC 5.1.3.3) urychluje ustavení rovnováhy mezi oběma anomery glukosy (spontánně tento proces probíhá pomalu) a nakonec se β anomer glukosy oxiduje glukosa oxidasou •laktosa (β-D-galaktosyl-4-O-glukosa) §mléčný cukr (0.3 až 0.6 mM v lidském a 0.25 až 0.28 mM v kravském mléku), analýza v potravinářství - určení sušeného mléka v produktech §hydrolýza β-galaktosidasou (EC 3.2.1.23) poskytuje oba monosacharidy, pak se použije buď galaktosa- nebo glukosa oxidasa •maltosa §hydrolýza maltasou (EC 3.2.1.20), poté se měří vzniklá glukosa • [USEMAP] Polysacharidy •škrob (spojení glukosových molekul α-1,4) §funguje jako zásobní polysarcharid, stanovení se provádí v obilí, rýži a bramborách §nejprve hydrolýza glukoamylasou (= amyloglukosidasa, exo-1,4-α-glukosidasa, EC 3.2.1.3), navíc lze přidat i α-amylasu (1,4- α-D-glukan-glukanohydrolasa, EC 3.2.1.1), která produkuje maltosu a dextriny délky 4 až 12 glukózových jednotek); nakonec se použije glukosa oxidasa §problémem je velikost molekuly škrobu, je vhodnější provést hydrolysu v enzymovém reaktoru než imobilizovat hydrolytické enzymy v biokatalytické vrstvě na povrchu převodníku • [USEMAP] Alkoholy •ethanol §v alkoholických nápojích, v klinické praxi a kontrola řidičů §alkohol oxidasa (EC 1.1.3.13, Pichia pastoris) •cholesterol §klinické praxe, v potravinách (tuky) §cholesterol oxidasa (EC 1.1.3.6, produkuje peroxid vodíku) účinkuje na volný cholesterol; pro stanovení formy vázané v esterech se přidá cholesterol esterhydrolasa (EC 3.1.1.13) •cholin §při studiu nervové funkce (neuromediátor) §cholin oxidasa (EC 1.1.3.17, z Alcaligenes sp.) produkuje betain a dvě molekuly peroxidu vodíku [USEMAP] Fenoly §stanovení fenolů má značný význam v průmyslových odpadních vodách a v některých potravinách (oleje) §tyrosinasa (fenol oxidasa nebo polyfenol oxidasa, EC 1.14.18.1) je kuproprotein izolovaný z žampionů, nebo používaný přímo jako tkáňový řez houby §působí na fenol, jednoduché substituované fenoly, katechol, chlorfenoly, oxidace jde přes katechol na o-chinon, který spontánně polymeruje (tmavnutí enzymových vrstev) §dalším enzymem je lakasa (EC 1.10.3.2, izoluje se z houby Polyporus versicolor, kuproprotein) působí zejmén na hydrochinon a p-difenoly §některé kmeny Pseudomonas jsou schopné fenoly metabolizovat (mikrobiální sensory) [USEMAP] Karboxylové kyseliny •kyselina mléčná (L-laktát) §v klinické medicíně (stanovení koncentrace v séru slouží pro rozlišení příčin acidóz, normální hladina je 2.7 mM) §ve sportovní medicíně slouží jako ukazatel pro hodnocení trénovanosti (nárůst koncentrace nastává jako reakce na fyzickou zátěž) §v potravinářském průmyslu vzniká při mléčném kvašení - jogurty, víno §L-laktát dehydrogenasa (EC 1.1.1.27, u savců, ze svalu) má jako koenzym NAD+, pro analýzu biosensory se prakticky nepoužívá §další dehydrogenasou laktátu je cytochrom b2 (EC 1.1.2.3, izoluje se z kvasinek nebo se používají přímo kvasinky), jeho akceptorem je ferrikyanid a další mediátory §nejběžnější je dnes L-laktát oxidasa (EC 1.1.3.2, LOD, z bakterie Pediococcus), flavoprotein produkující peroxid vodíku §L-laktát monooxygenasa (EC 1.13.12.4) produkuje acetát a oxid uhličitý a používala se spíše dříve před objevením LOD. §při mléčném kvašení může vznikat i D-forma laktátu, její stanovení se provádí pomocí D-laktát dehydrogenasy (NAD+dependentní). [USEMAP] •kyselina jablečná (malát) §v ovoci a ve víně (hodnocení kvality), potřebný enzym je malát dehydrogenasa (NAD+, EC 1.1.1.37) •kyselina šťavelová (oxalát) §v moči při hyperoxalurii; oxalát oxidasa (EC 1.2.3.4) katalyzuje reakci (COOH)2 + O2 ——→ 2 CO2 + H2O2 •kyselina isocitronová §produktem při fermentační výrobě kyseliny citronové, ke stanovení slouží isocitrát dehydrogenasa (EC 1.1.1.42, NADP+) •kyselina močová (urát) §v klinické praxi - hematologické poruchy (v séru 0.14 až 0.4 mM). Enzym urikasa (urát oxidasa, EC 1.7.3.3, obsahuje měď) ji oxiduje na allantoin: H N N N N O O O H H H H N N O O N N H 2 O H H Urikasa + O 2 + H 2 O + CO 2 + H 2 O 2 [USEMAP] •mastné kyseliny §analyzují se v krvi, v potravinách indikují denaturaci tukových (olejových) složek §stanovení je dvouenzymové: acyl-CoA synthasa v přítomnosti ATP a CoA převede mastnou kyselinu na příslušný acyl-CoA, na který účinkuje acyl-CoA oxidasa (EC 1.3.3.6, oxidací vzniká dvojná vazba a současně se produkuje peroxid vodíku) •……. •kyselina siřičitá §obsah se kontroluje ve víně §její oxidace je možná pomocí sulfit oxidasy (EC 1.8.3.1) produkující H2O2 [USEMAP] Aminokyseliny §lze stanovit jako sumu (v potravinách) pomocí oxidasy L-aminokyselin (EC 1.4.3.2), obdobný enzym existuje také pro D-aminokyseliny (EC 1.4.3.3), může se uplatnit při oxidaci glycinu •lyzin §jako esenciální faktor přidáván do krmných směsí §lyzin-a-oxidasa (EC 1.4.3.14, dekarboxylující, z Trichoderma viridae) §lyzin dekarboxylasa (EC 4.1.1.18, z E. coli, Bacterium cadaveris) produkuje CO2 a kadaverin, ten lze následně stanovit diaminoxidasou (z hrachu, EC 1.4.3.6) •kyselina glutamová §je součástí polévkových koření a sojové omáčky §glutamát oxidasa (EC 1.4.3.11, flavoprotein) produkuje z glutamátu NH3, CO2, α-oxoglutarát a H2O2 §glutamát dehydrogenasa [L-glutamát:NAD(P)+ oxidoreduktasa (deaminující), z jater] se uplatňovala zejména dříve před objevením oxidasy [USEMAP] Dusíkaté sloučeniny •močovina §v krvi normální hladina 3.6 až 9 mM, indikátor funkce ledvin, ureasa (EC 3.5.1.5) je vůči močovině absolutně specifická •kreatin, kreatinin §enzymy potřebné pro stanovení kreatininu a kreatinu: E1 kreatinin iminohydrolasa (EC 3.5.4.21) E2 kreatinin amidohydrolasa (kreatinasa, EC 3.5.2.10) E3 kreatin amidinohydrolasa (EC 3.5.3.3) E4 sarkosin oxidasa (EC 1.5.3.1) [USEMAP] Purinové base (čerstvost rybího masa) •ATP • ¯ ATPasa •ADP + Pi • ¯ myokinasa •AMP + Pi • ¯ AMP deaminasa •IMP + NH3 • ¯ 5´‑nukleotidasa •inosin + Pi • ¯ nukleosid fosforylasa •hypoxanthin + ribosa‑1‑Pi • ¯ xanthin OD •xanthin • ¯ xanthin OD •kyselina močová Při kažení masa probíhá enzymová autolýza tkáně a dochází k postupnému hydrolytickému rozkladu ATP, v konečné fázi se oxiduje až na kyselinu močovou. Tím nastávají změny kvality a chuti masa. Pro postižení stupně tohoto procesu byl vyvinut čtyřkanálový biosensor: 1) xanthin oxidasa (XOD, EC 1.2.3.2) 2) XOD + nukleosid fosforylasa (NP, EC 2.4.2.1) 3) jako 2 + 5´-nukleotidasa (NT, EC 3.1.3.5) 4) jako 3 + AMP deaminasa (AD, EC 3.5.4.6) Tak lze postupně určit hladiny všech metabolitů v tkáni, přitom se navíc dopočítá obsah ATP / ADP (jejich výchozí množství je obvykle víceméně konstantní a známé). Vypočítá se procentuální podíl xanthinu a hypoxanthinu k sumě všech metabolitů - tzv. faktor čerstvosti K. Podle jeho velikosti se pak rybí maso klasifikuje jako velmi čerstvé (K < 10%), čerstvé (K < 40%) a kazící se (K > 40%) [USEMAP] Penicilin §stanovován v průběhu fermentační výroby. Pro stanovení jsou vhodné dva enzymy, β-laktamasa (penicilinasa, EC 3.5.2.6) a penicilinamidasa (EC 3.5.1.11); oba se spojují s pH sensory [USEMAP] Měření enzymových aktivit §produkt reakce měřeného enzymu slouží jako substrát indikačního enzymu imobilizovaného v biokatalytické vrstvě §oproti klasickým fotometrickým postupům u biosensorů často nevadí zákal nebo zbarvení analyzovaného vzorku. §Laktát dehydrogenasa se měří v klinické praxi (normálně v séru 63 až 155 IU/l u mužů, 62 až 131 IU/l u žen), nárůstá při hepatitidě nebo infarktu. Substrátem je laktát, sleduje se produkce pyruvátu pomocí sensoru s pyruvát oxidázou. §α-Amylasa se měří v séru (normálně 60 až 150 U/l), narůstá při akutní pankreatitidě. Stanovení je možné buď použitím maltopentaózy jako substrátu a biosensoru s glukóza oxidá-zou, nebo může být substrátem škrob a pro detekci navíc slouží také glukoamyláza. §Transaminasy indikují funkci jater a objevují se i při infarkt. ALT (normálně v séru 5 až 24 U/l), AST (5 až 20 U/l), při patologických stavech (hepatitida, alkoholismus) je možné pozorovat nárůst až 100 až 1000x. Pro ALT jsou substráty alanin a a﷓oxoglutarát, detekuje se vznikající pyruvát nebo glutamát. Pro AST jsou substráty aspartát a a﷓oxalacetát a měří se vzniklý glutamát. §Arginasa je snadno stanovitelná pomocí močovinového biosensoru (ureáza / amoni-ak), substrátem je arginin. § [USEMAP] Měření enzymových aktivit §aktivity stanovitelné pomocí glukózového biosensoru (glukóza oxidáza / peroxid vodíku) zahrnují například následující enzymy (v závorce je uveden potřebný substrát): alkalická / kyselá fosfatáza, β-glukosidáza (glukóza-6-fosfát), glukoamyláza (maltóza), invertáza (sacharóza), trehaláza (α, α'-trehalóza). §aktivity stanovitelné pomocí fenolového biosensoru (tyrosináza / kyslík) zahrnují: alkalická / kyselá fosfatáza (fenylfosfát), β-galaktosidáza (fenyl- β-D-galaktosid), β-glukosidáza (fenyl-β-D-glukosid), β-glukuronidáza (fenyl-β-D-glukuronid). § [USEMAP] Měření inhibice enzymů §pro bioanalytické aplikace je možné využít reakce enzymů s inhibitory - ty snižují aktivitu imobilizovaného indikačního enzymu §měření inhibitorů je obvykle velmi citlivé, jedna molekula analytu zablokuje jednu molekulu enzymu, který následně přestane konvertovat mnoho molekul substrátu §určitá forma zesilovacího mechanismu §klasifikace inhibicí: ireverzibilní (nevratné) reverzibilní kompetitivní (parciální / plná) nekompetitivní akompetitivní směsné [USEMAP] Určení typu inhibice §kalibrační křivky pro substrát, vždy při určité konstantní koncentraci inhibitoru §výnos v dvojnásobných logaritmických koordinátách - typické vzájemné polohy závislostí log [subs] log Sign ál r = 1 + [inh]/Ki bez inhibitoru r = 1 2 3 1 2 5 1 3 7 kompetitivní akompetitivní nekompetitivní [USEMAP] Měření inhibice enzymů §Inkubační postup 1. výchozí signál 2. inkubace se vzorkem 3. promytí sensoru 4. zbytkový signál §Kontinuální měření 1. odezva na substrát, 2. ustavení ustáleného stavu 3. přídavek vzorku 4. měření poklesu signálu • inkubace se vzorkem S S S DI dI/dt Iss vzorek [USEMAP] Inhibice alkalické fosfatasy §theophyllin účinkuje jako stimulátor centrální nervové soustavy, používá se v klinické praxi jako bronchodilatátor k respirační stimulaci §terapeutickou hladinu v krvi (10 až 20 mg/l) je třeba sledovat, aby se zabránilo předávkování §inhibice je při použití p-aminofenylfosfátu (PAPP) akompetitivní §jako pufr lze použít tris nebo diethanolamin, mez detekce kolem 5 µM § § § § § §anorganický fosfát Pi je stanovován mimo jiné v životním prostředí -znečištění vodních toků (podporuje nadměrný růst řas a sinic) §stanovení se provádí s glukosa-6-fosfátem jako substrátem, jeho hydrolýza ALP je inhibována volným fosfátem kompetitivně §vnikající glukosa se může stanovit pomocí glukosa oxidasy imobilizované ve stejné vrstvě jako ALP; mez detekce je kolem 10 µM [USEMAP] Inhibice cholinesterasy §enzym účinkuje v nervové soustavě při přenosu vzruchů §organofosfáty pesticidy (insekticidy dichlorvos, actelic, …) bojové otravné látky (sarin, soman, tabun, VX) R alkyl, aryl; R’ alkyloxy, aryloxy, subst. amin; X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl, fosfodiester; Z = O nebo S §karbamáty pesticidy (carbofuran, carbaryl, aldicarb, …) R,R’ H, alkyl, aryl; X odcházející skupina - CN, F, p-nitrofenyl §používané enzymy: acetylcholinesterasa (AChE, EC 3.1.1.7) a butyrylcholinesterasa (BChE, EC 3.1.1.8); AChE se získává nejčastěji z elektrického úhoře nebo z membrán erythrocytů, BChE zejména z koňského séra §rekombinantní ChE - lepší inhibiční vlastnosti úpravou aktivního místa P X R O R ' Z O C X N R R ' [USEMAP] Kinetika inhibice ChE §volný enzym EH tvoří komplex s inhibitorem PX který rozpadem poskytuje fosforylovaný enzym EP (fosforyluje resp. karbamoyluje se hydroxyl serinového zbytku v aktivním místě cholinesterasy) §oxofosforové sloučeniny jsou obecně mnohem silnější než analogické thiofosfáty, z těch vznikají oxidací (bromová voda, peroxid vodíku) • §první krok charakterizuje rovnovážná konstanta KD = k1/k-[1], druhý pak rychlostní konstanta k2; v praxi se však nejčastěji používá bimolekulární inhibiční konstanta ki = k2/KD §Při inkubačním způsobu měření platí pro signál Y biosensorů: ΔlnY = ki[PX]t, odezva je tedy určována jednak koncentrací a jednak inhibičními účinky dané látky §pokud není známý druh pesticidu před vlastní analysou, lze stanovit parametr anticholinesterasová toxicita [USEMAP] Variabilita ChE biosensorů [USEMAP] Příklad odezvy i = 0 50 nA 1 min 10 min vzorek brambor (šťáva) 10 min vzorek brambor (šťáva) + 120 ppb propoxur S ΔY §inhibice ChE biosensoru = rychlá charakterizace vzorků zelenin a ovoce na místě odběru, rozsáhlý předběžný screening §podezřelé vzorky znovu analyzovány v laboratořích (GC, HPLC, MS, …). [USEMAP] BioNA • Biochemical Nerve Agent Detector kontrolní jednotka měřící blok §osobní detektor nervově paralytických látek ve vzduchu §detekované látky: typ “G” and “V”, limit detekce ve vzduchu: 1 ng/L §rychlost odezvy: 30 s (15 s pro 10 ng/L) §hmotnost: 500 g rozměry: 120 x 80 x 35 mm §signalizace alarmu: vizuálně / akusticky [USEMAP] Další inhibice §tyrosinasa je použitelná pro celé spektrum různých inhibitorů: kyselina benzoová byla dříve používána jako konservační činidlo, kyselina salicylová vzniká odbouráváním kyseliny acetylsalicylové (aspirin); celá řada substituovaných thiomočovin vzniká z glukosinolátů, způsobují nepříjemné chuťové vlastnosti pokrutin z produkce řepkového oleje §ureasa je velmi citlivá na inhibici, kterou působí různé těžké kovy, konstrukčně může jít o potenciometrické enzymové elektrody §fotosystém z thylakoidů chloroplastů špenátu nebo fotosyntetických mikroorganismů (Rhodobacter) se využívá k detekci řady látek používaných jako herbicidy v zemědělstvi: triaziny, karbamáty, fenylmočoviny, nitrofenol aj. § [USEMAP] •fotosystém z thylakoidů chloroplastů špenátu nebo fotosyntetických mikroorganismů (Rhodobacter) se využívá k detekci řady látek používaných jako herbicidy v zemědělstvi: triaziny, karbamáty, fenylmočoviny, nitrofenol aj diphenylcarbazid (donor e - ) PQH 2 PQ PS II h n light DCIP umělý akceptor excitace I t light / dark vzorek [USEMAP] Biochemické zesilovací systémy §u obvyklých reakcí poskytuje jedna molekula analytu jednu „jednotku“ měřeného signálu; cílem zesílení (amplifikace) je získat z 1 jednotky analytu (např. 1 molekula) G jednotek signálu (např. G elektronů) a dosáhnout tak podstatného zvýšení citlivosti stanovení parametr G pak vystupuje jako zesilovací (amplifikační) faktor § § § A B E1 Substrát Produkt D C E2 §molekula analytu nastartuje jednu nebo i několik cyklicky probíhajících reakcí, přitom neustále přechází mezi dvěma formami (Substrát, Produkt), které jsou přeměňovány dvěma komplementárními enzymy E1 a E2 (nejjednodušší možnost je kombinace substrát oxidasa a substrát dehydrogenasa) §reakčního cyklu se dále účastní pomocné látky A a C a vystupují z něj látky B a D; v nepřítomnosti A nebo C recyklace neprobíhá, jejich přídavek tedy vlastně recyklaci „zapíná“ [USEMAP] §amplifikační faktor G lze určit pomocí závislosti na parametrech enzymů Ki=Vmax,i/KM,i, tloušťce biovrstvy L a difúzním koeficientu recyklované látky uvnitř vrstvy D §klasickým použitím zesilovacího systému v biosensorech je vysoce citlivé stanovení laktátu laktát oxidasou a laktát dehydrogenasou imobilizovanými v jediné biokatalytické vrstvě §pro systém LOD / LDH bylo dosaženo G převyšující 4000, mez detekce pro laktát (nebo pyruvát) činila 1 nM §laktátový systém může být využit také pro citlivou detekci enzymů produkujících pyruvát, např. alanin aminotransferázy O 2 H 2 O 2 LOD laktát pyruvát LDH NAD + NADH [USEMAP] Vícenásobná recyklace §několikanásobný recyklační systém pro citlivou detekci ATP / ADP byl sestaven z enzymů HK hexokinasa, PK pyruvát kinasa, LOD, LDH a Cat, katalasa §cykly byly propojeny pomocí pyruvátu, postupným "zapínáním" jednotlivých cyklů byly zlepšovány parametry stanovení glukosa-6-P glukosa HK Cat ADP ATP H 2 O 2 O 2 PK LOD PEP pyruvát laktát LDH NADH NAD + Enzym G cmin HK 1 60 µM +PEP PK 30 2 µM +NADH LOD/LDH 1700 10 nM [USEMAP] Další recyklace §zajímavý jednoenzymový recyklační systém využívající různé aktivity jediného enzymu (laktát dehydrogenasa) pro obě větve cyklu §další kombinace jsou např.: glutamát oxidasa / dehydrogenasa (glutamát ev. amoniak); alkohol oxidasa / dehydrogenasa (alkohol); glutamát oxidasa / alanin aminotransferasa (a-oxoglutarát, glutamát); lakasa / cyto-chrom b2 (benzochinon); laktát monooxygenasa / malát dehydrogenasa (malát, oxaloacetát, AST) §chemická recyklace byla na poli biosensorů použita ke zcitlivění detekce kyseliny askorbové pomocí kyslíkové elektrody s askorbát oxidasou, zpětná redukce kyseliny dehydroaskorbové probíhala v přítomnosti cysteinu §jako příklad elektrochemické recyklace lze uvést tyrosi-názový biosensor. Postup se používá pro stanovení feno-lu, který po oxidaci tyrosinasou poskytne recyklující py-rokatechol. Obdobné schema je využitelné pro lakázu a recyklující pár hydrochinon / benzochinon § glyoxylát oxalát LDH NAD + NADH LDH laktát pyruvát O 2 tyrosinasa pyrokatechol o-chinon l 2e - -300 mV [USEMAP] Recyklace fosfátu maltosa a -D-glukosa maltosa fosforylasa P i glukosa-1- fosfát fosfatasa mutarotasa b -D-glukosa glukosa oxidasa O 2 glukonolakton + H 2 O 2 [USEMAP] Eliminace interferencí §při analýze reálných vzorků se přítomné interferující složky konvertují (váží) vedle vlastního analytu a ruší stanovení na různých funkčních stupních biosensoru §eliminací by se veškeré interferující látky měly odstranit nebo převést na nerušící produkty - tohoto efektu se dosáhne předřazením eliminačního systému vlastnímu biosensoru § § převodník biorekogniční vrstva antiinterferenční vrstva analyt rušivé látky [USEMAP] §kyselina askorbová může rušit v séru, pokud je konečnou fází amperometrická oxidace peroxidu vodíku, může být eliminována předřazením biomembrány s askorbát oxidasou (neprodukuje peroxid vodíku) jinou možností je použití ferrikyanidu ve spojení s lakasou (bez lakasy by vadil vzniklý ferrokyanid) další možností je předřadit vhodnou antiinterferenční vrstvu přímo vlastnímu převodníku - pro askorbát přichází do úvahy použít negativně nabitou membránu, např. velmi hustou acetylcelulosu lze provést elektrooxidaci askorbátu před příchodem do biokatalytické vrstvy: Příklady §amoniak je často detekovaným produktem enzymových reakcí, ale současně může být přítomen volný ve vzorku (sérum, moč), lze ho odstranit pomocí glutamát dehydrogenasy: Lakasa 2[Fe(CN)] 6 4- + 1/2O 2 + 2H + 2 [Fe(CN)] 6 3- + H 2 O askorbát + 2[Fe(CN)] 6 3- dehydroaskorb át + 2 [Fe(CN)] 6 4- NH 3 + H + + NADH + α - glutarát L- glutamát + NAD + GDH [USEMAP] §glukosa ve volném stavu bude vadit u řady víceenzymových systémů pro stanovení složitějších cukrů pro její odstranění lze použít antiinterferenční vrstvu obsahující glukosa oxidasu a katalasu (rozkládá vznikající peroxid vodíku), tento postup funguje do asi 2 mM koncentrace pokud nemá být ovlivněna hladina kyslíku v okolí biosensoru, je možné spotřebovat glukosu fosforylací ATP pomocí hexokinasy: § §kyslík je možné z okolí biosensoru odstranit jeho spotřebou při oxidaci glukosy glukosa oxidasou. Hexokinasa glukosa + ATP glukosa-6-fosfát + ADP [USEMAP] Bioanalytická stanovení v organické fázi •Výhody bioreakcí v organické fázi: §zvýšená rozpustnost nepolárních substrátů (analýzy tuků či olejů) §změněné reakční rovnováhy (místo hydrolýzy často probíhá syntéza) §zvýšená termální stabilita (fixovaná struktura biomakromolekul) §zjednodušená imobilizace prostou adsorpcí §neprobíhají rušivé reakce s účastí vody §nenastává bakteriální kontaminace §pro činnost enzymů v organické fázi je potřeba jisté minimální množství vody (1 až 5 %) - hydratační obal bílkoviny §obvykle nelze používat rozpouštědla volně mísitelná s vodou, která hydratační obal kompletně odstraní §nepolární rozpouštědla je vhodné nasytit předem vodou §na povrchu bílkoviny existuje přechodová oblast - interfáze, někdy je pro její tvorbu vhodné přidat hexanol nebo detergent CTAB, cetyl trimethylamonium bromid). [USEMAP] Polarita rozpouštědel Pro posouzení polarity rozpouštědel se používá partiční koeficient P, což je vlastně rozdělovací poměr daného rozpouštědla mezi oktanol a vodu: P = [rozp]oktanol/[rozp]voda nižší hodnota znamená méně polární rozpouštědlo Podle velikosti log P lze přibližně vymezit tři skupiny rozpouštědel: log P < 2 nejsou vhodná, narušují vodný obal biomokuly; někdy jsou použitelná ve směsi s vodou 2 < log P < 4 účinek rozpouštědla na aktivitu enzymu je třeba vyzkoušet log P > 4 obecně jsou použitelná, vodný obal enzymu není narušen log P dimethylsulfoxid -1.3 dioxan -1.1 dimethylformamid -1.0 methanol -0.76 ethanol -0.24 aceton -0.23 tetrahydrofuran 0.49 butanol 0.80 ether 0.85 cyklohexanol 1.5 chloroform 2.0 benzen 2.0 toluen 2.5 pentan 3.0 hexan 3.4 dekan 5.6 hexadekan 8.8 [USEMAP] Aktivita v organické fázi §průběh aktivity enzymu v závislosti na polaritě rozpouštědla má charakteristický esovitý tvar §imobilizovaný enzym obvykle lépe snáší i méně polární rozpouštědla; mimo polaritu rozpouštědla je samozřejmě nutné zvážit také jeho dostupnost, těkavost, cenu a případně toxicitu §někdy je výhodné použít místo čistého rozpouštědla mikroemulze tvořené směsí rozpouštědla (1 až 10 %), vody a vhodného detergentu (0.05 až 0.5 %). [USEMAP] Příklady stanovení §aplikace se zaměřují na ve vodě nerozpustné analyty nebo vzorky §nejvíce biosensorů je založeno na použití tyrosinasy - je vhodná pro stanovení fenolů v oleji nebo v organických extraktech z vody, na základě inhibice jde stanovit substituované thiomočoviny (vznikají z glukosinolátů, které znehodnocují krmné směsi s řepkou). §podobně lakasa je vhodná pro p-difenoly §peroxidáza mimo detekce peroxidu vodíku slouží také pro detekci organických hydroperoxidů, které vznikají v tucích při jejich rozkladu §cholesterol v másle a margarínech lze v organické fázi výhodně stanovit cholesterol oxidasou §acetylcholinesterasy slouží pro detekci pesticidů (organofosfáty, karbamáty) po extrakci z vodné fáze §v poslední době se objevují i pokusy provádět v organické fázi některá imunochemická stanovení nízkomolekulárních toxických látek [USEMAP] Modely biokatalytických sensorů §pro popis a optimalizaci dílčích procesů tvořících odezvu biosensoru (látkový transport, enzymová reakce, elektrodová reakce) §amperometrické biosensory jsou nejčastějším objektem modelování, uplatňuje se zde několik východisek: §enzymová reakce (1, 2, více) převádí analyt stechiometricky na snadno měřitelnou látku; uvažuje se lineární reakce (reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci), nelineární reakce vedou k numerickému řešení §modelování lze provádět buď stacionárně pro předpokládaný ustálený stav (očekává se nezávislost nalezeného řešení na čase) §nebo dynamicky, kdy model obsahuje časovou proměnnou, takže lze nalézt řešení v žádaném časovém okamžiku §pro nalezení řešení je velmi důležitý popis situace v přechodových oblastech, což jsou rozhraní povrch elektrody / biokatalytická vrstva / okolní roztok [USEMAP] Modelovaný systém §existuje jistý počet navazujících vrstev, což je nejčastěji soubor několika membrán (enzymová, dialysační pro kontrolu transportu, mechanická ochrana, …) na povrchu elektrody •předpoklady: §dobře míchaný okolní roztok §zanedbatelná spotřeba okolního analytu v důsledku činnosti biosensoru §zachování hmoty při přechodu mezi vrstvami §nulový tok neaktivních částic na povrchu elektrody, §elektroaktivní látka je na povrchu elektrody úplně spotřebována (c=0) enzymová vrstva elektroda okolní roztok d 0 x-ová osa symbolika: §S, P, A, B (…) značí koncentrace substrátu, produktu a dalších pomocných látek, v okolním roztoku jsou koncentrace So, Po, Ao atd. §rozměr (vzdálenost) je x, počátek = rozhraní enzymové vrstvy a okolního roztoku. §čas je t, modelování začíná v čase 0 §pro jednotlivé látky jsou difúzní koeficienty DS, DP, atd §rychlostní konstanta enzymové reakce je k (lineární reakce, k = Vmax/KM) §koncentrace v daném místě a čase jsou S(x,t), derivace podle času jsou St(x,t), podle x pak Sx(x,t) a Sxx(x,t) [USEMAP] Příklad řešení §nejjednodušší amperometrický biosensor (1 vrstva, 1 enzym, lineární reakce) je uvedeno pro ilustraci. Předpokládejme konverzi substrátu (analytu) enzymem a následnou elektrochemickou detekci produktu (Ai značí pomocné látky): Rovnice a podmínky pro stacionární řešení substrátu a produktu: 0 = DSSxx – kS 0 = DPPxx + kS S(0) = So Sx(d) = 0 P(0) = 0 P(d) = 0 Vyřešení diferenciálních rovnic pak poskytuje rovnice pro koncentrace obou látek uvnitř biovrstvy po ustavení ustáleného stavu: [USEMAP] §proud v ustáleném vztahu ISS je vlastně dán tokem produktu P na povrchu elektrody Px(d): ISS = nFADPPx(d) n značí počet elektronů, F je Faradayova konstanta, A plocha elektrody. výsledky teroretického modelu je možné porovnat s experimentálně stanoveným proudem biosensoru §pro tento jednoduchý příklad existuje řešení i pro dynamický model: • St = DSSxx – kS • S(0,t) = So Sx(d,t) = 0 S(x,0) = 0 • • Pt = DPPxx + kS • P(0,t) = 0 P(d,t) = 0 P(x,0) = 0 §časový průběhu koncentrace substrátu: §časový průběh proudu ISS je úměrný toku produktu na povrchu elektrody Px(d,t) : • I(t) = nFADPPx(d,t) [USEMAP] Grafické znázornění §na základě dynamického řešení je možné zkonstruovat koncentrační profily substrátu a produktu uvnitř biovrstvy na povrchu elektrody §na obrázku jsou použity pro názornost bezrozměrné souřadnice §vyvinutý model umožňuje studovat vliv změny parametrů (tloušťka biovrstvy, aktivita enzymu, průchodnost vrstvy) na odezvu biosensoru [USEMAP] Mezní případy řešení §rovnici pro signál v ustáleném stavu lze dále zjednodušit: §zavádí se Thieleho modul Φ, pak lze podle velikosti tohoto modulu určit dvě limitní oblasti činnosti biosensoru, pro něž se dají odvodit rovnice pro ISS §pro velmi malé Φ (Φ ® 0) je odezva biosensoru určována pouze rychlostí enzymové reakce, existuje kinetická kontrola pro přibližné řešení se cosh Φ nahradí aritmetickou řadou (Taylorův rozvoj, ze které se použije pouze první člen, cosh Φ = 1 + Φ 2 + … : ISS ≈ nFASokd/2 §naopak pro velmi velká Φ (Φ -> ∞) převládne vliv transportních procesů uvnitř biovrstvy, nastává difúzní kontrola pro zjednodušení se použije: což konečně vede ke zjednodušenému výrazu: ISS ≈ nFADSSo/d §oba výrazy platí poměrně dobře pro reálné odezvy biosensorů § [USEMAP] Limitace odezvy enzymového sensoru §Pokud je analyt současně substrátem pro enzym imobilizovaný v biosensoru, je výhodné pracovat za podmínek difúzní kontroly: na odezvu nemá výrazný vliv rychlost enzymové reakce, takže případný postupný úbytek enzymové aktivity v biovrstvě enzymu se na velikosti signálu nemusí prakticky vůbec projevit. Biosensor obvykle vykazuje konstantní citlivost, která pak náhle klesne (enzymová aktivita se vyčerpá). Difúzní kontrola nastává u biovrstev s vysokou koncentrací enzymu, jinak ji lze dosáhnout předřazením málo propustné difúzní bariéry (kontrolní membrána). §Kinetická kontrola - druhý limitní typ – je výhodný zase pokud analyt funguje jako inhibitor imobilizovaného enzymu. Pak se i malé poklesy aktivity v důsledku inhibice ihned projeví poklesem signálu biosensoru. [USEMAP] Následky pro reálné systémy •analyt je substrát ... difúzní kontrola je preferována –odezva významně nezávisí na množství enzymu v biovrstvě postupný pokles aktivity dlouho neovlivňuje citlivost –jak dosáhnout – hodně velké množství enzymu, vytvoření difúzní bariéry (kontrolní membrána) • •analyt je inhibitor ... je nutná kinetická kontrola –i velmi malé úbytky aktivity (~Vmax) enzymu v biovrstvě důsledkem inhibice se okamžitě projeví poklesem signálu citlivost doba používání kinetická kontrola difúzní kontrola došla latentní enzymová aktivita [USEMAP]