Buňky a biosensory nbuňky jako biorekogniční element nstudium vlastností buněk pomocí biosensorových technologií [USEMAP] Buněčný systém nbuňky jsou schopné velmi citlivě reagovat na různé podněty z okolí, zejména na přítomnost různých chemikálií nbiologický a biomedicínský výzkum nfarmaceutický vývoj nových léčiv ndetekce nových nebo neznámých toxických látek v podezřelých vzorcích – pokud nemáme k dispozici (nebo neznáme) konvenční biorekogniční molekuly (enzym, protilátka, DNA, …) n nhlavní motivace = jaký je účinek testované látky na živý organismus n [USEMAP] Výhody buněčných sensorů nbiochemická složka v aktivním životním stavu - jedná se o mikrobiální, rostlinné nebo živočišné buňky nebo jejich subcelulární elementy (organely) nebo celé tkáně či orgány nbiokomponenta je v přirozeném prostředí - příznivé pro její aktivitu a stabilitu nmísto jediného enzymu lze použít celé metabolické reakční sekvence, optimalizované přirozenou cestou nnejsou nutné izolační a purifikační kroky (nízká cema) npokud jsou zachovány životní podmínky - spontánní obnova využívané enzymové aktivity [USEMAP] Mikrobiální sensory nhistoricky - měření metabolitů (glukosa a další sacharidy, laktát) - dnes již překonáno nspeciální kmeny Pseudomonas - exotické aktivity, možnost detekovat aromatické uhlovodíky (benzen) i vysloveně toxické látky - fenol (dezinfekční prostředek) nstanovení BSK (BOD, biochemical oxygen demand) - míra znečištění (odpadních) vod organickými polutanty –klasické měření trvá 5 dnů (BSK5) –biosensor - O2 sensor s imobilizovaným mikrobem (Trichosporon cutaneum, Bacillus subtilis a licheniformis –měří se rychlost respirace po přídavku vzorku, potřebná doba je přitom pouze několik minut –kalibračními substráty jsou obvykle směs glukosy a kyseliny glutamové n n [USEMAP] Mikrobiální sensory nbakterie, sinice či kvasinky, imobilizované buď na povrchu převodníku (membránový typ) nebo ve formě předřazeného reaktoru nproblém - existence řady enzymových systémů v buňce; zlepšení selektivity: –indukce = přídavek potenciálního analytu = substrátu vyvolá zvýšenou tvorbu komponent metabolické dráhy –inhibice = potlačí se funkce nežádoucích aktivit nimobilizace –zachycení buněk přefiltrováním přes vhodnou membránu ve formě „pasty“ nebo filmu uvnitř pórů membrány (filtrační papír, polyamid, celulosa). Dynamické vlastnosti výsledného sensoru budou záviset na tloušťce a porozitě membrány a vlastnostech buněčné stěny mikroba. –stabilnější je zachycení buněk uvnitř gelu při jeho tvorbě. Nelze použít příliš drastické podmínky - agar, kolagen, želatinu, polyakrylamid nebo polyvinylalkohol. –kovalentní vazba buněk nevhodná - dojde ke zničení buněčné stěny. nmikrobiální složku je nejčastěji možné spojit s kyslíkovou elektrodou, dále pak se sensory pro CO2 nebo amoniak, je možné použití mediátorů přenosu elektronů (ferrikyanid) nperoxid vodíku obvykle není produkován (toxický pro buňky) [USEMAP] Tkáňové řezy ntenký řez vhodné části rostliny se uchytí pomocí síťky před vlastní sensor n n [USEMAP] Buněčný systém - komplexnost vstupní signály růstové faktory, antigeny/protilátky, hormony, adhezní faktory, teplota, pH, … výstupní signály pH, ionty (Na+, K+, Ca2+, Cl-), regulační látky (NO, glutamát, ...), obranné (ROS - peroxid vodíku, superoxid. radikál), adheze, morfologie, CO2, membr. potenciál, … receptory modulátory metabolismus pH pH- regulace vesikulární transport O, glukosa, léčiva 2 adheze a morfologie proliferace enzymové kaskády cytostatika [USEMAP] Buněčný biosensor npřiblížení se in vivo stavu (sterilita, zajištění přísunu živin, biokompatibilita, …) chemické/ fyzikální sensory signály sběr údajů vstupy cell(s) Testovaný vzorek výstupy fyziologické vstupy (O2,glukosa, růstové faktory, T, pH, ..) … H+, CO2, adh., meta- bol., .. … nneinvazivní, on-line záznam nmultiparametrický charakter nčím více parametrů se podaří sledovat paralelně a současně, tím lépe se porozumí složitým buněčným odezvám [USEMAP] Měřící systém nacidifikace – pH ISFET nkyslík – Clarkův sensor nadheze – IDE (impedance) nionty – ISFETy nteplota – Pt100 nbioelektrické děje –mikroelektrody n n n n nCMOS technologie – miniaturizace, standardizace, kombinace sensorů a vyhodnocovací elektroniky na témž čipu – integrace, paralelizace [USEMAP] Bionas [USEMAP] Ukázka záznamu z biočipu nAcidifikace nRespirace nAdheze n nvliv paracetamolu na kulturu fibroblastů n nTriton X-100 detergent [USEMAP] Konfigurace nkompaktní systém, buňky kultivovány přímo na povrchu (elektrochemických) sensorů, vhodné kombinovat i s fluorescenčním měřením nbuňky separovány od měřících sensorů pomocí vhodné membrány (kultivace na membránových insertech) [USEMAP] References: - Vörös, J. et al. “Optical Grating Coupler Biosensors”, Biomaterials 23 (2002) 3699-3710 - Szekacs, A. et al - Madarasz, E. et.al -- Signál (Impedance, Resistance, Resonance, …) Cell shape: nástřik, sedimentace výchozí kontakty rozprostírání, uvolňování matrix proteinů pasivní sedimentace üres+PLL+FCS+4C_5 DSCN0953 6 – 30 min 10 µm 10 μm adhezivní neadhezivní 60 min latence Kontakt buněk s povrchem [USEMAP] Normální vs. apoptické buňky npohodlné sledování morfologických změn a adheze pomocí piezoelektrických sensorů - viskoelastické procesy [USEMAP] Adheze – impedanční měření nfirma Roche – systém exCELLigence nzměna impedance Z v reálném čase The technology of the xCELLigence System is based on impedance measurements https://www.roche-applied-science.com/sis/xcelligence/xce_images/030400_02.jpg Experimental Data Plot: real-time data analysis, plotting and organization of experimental data [USEMAP] Vazba buněk njednotlivé fáze nparalelní sledování mikroskopem [USEMAP] intracelulární záznam extracelulární záznam Spikeform NC3 Neurony nbuňky s elektrickou aktivitou [USEMAP] Neuročip nAkční potenciál - 8x CPFET a 64x microelda npH – 2x ISFET nteplota – dioda n nintegrovaná elektronika – filtry, zesilovače, multiplexer, I2C sběrnice, stimulační obvody [USEMAP] Měřící systém [USEMAP] Buněčné biosensory nznačný potenciál do budoucna v oblasti výzkumu (šíření nervových vzruchů, umělá paměť, rozpoznávací a vyhodnocovací funkce, „učení“, ...) nnáhrada testů toxicity nových či podezřelých látek - dosud se provádí pomocí experimentálních zvířat nvyhledávání a testování nových druhů léčiv n nkomplikace –velmi komplexní systém, náchylný na poškození, není snadné udržovat v optimálním stavu –obtížné uchovávání a transport (musí se připravit in situ) –komplexní odezvy, informace bývá skryta v napohled chaotických datech - úloha chemometrie a software n [USEMAP] síla čas drug rychlost tepů AFM hlava CMs Nano-biosensing s kardiomyocyty (CM) § sledování tepání kardiomyocytů je snadné (mikroskop, video) § nanomechanický převodník – kantilevr z AFM systému – síla tepů - mechanokardiogram § efekty testovaných látek v reálném čase § klinický buněčný model – studium srdečních poruch: Duchennova svalová dystrofie, arytmie, Fabryho nemoc, … Biosensors and Bioelectronics 85 (2016) 751–757; 124-5 (2019) 129-135 [USEMAP] Výchylka kantilevru v čase pro různé testované látky kontrola (medium) isoproterenol (aktivátor) metoprolol (betablokátor) kofein graf [USEMAP] Vliv vápníku ‘heart on chip’ [USEMAP] Síla a elektrický potenciál nCMs zachyceny na povrchu pole mikroelektrod nsynchronní záznam síly tepu a iniciace změnou el. potenciálu n [USEMAP]