Technologické aspekty biosensorů nimobilizace biomolekul na povrch sensorů –uchování aktivity a specificity –robustní spojení –dobrý převod signálu –povrchová hustota bioreceptoru –reprodukovatelná a snadná procedura [USEMAP] Membrány a biosensory nmembrány v biosensorech plní několik funkcí: nimobilizace biorekogničních molekul – nosná funkce. nřízení transportu látek buď prostřednictvím difúzní kontroly nebo ovlivněním selektivity (antiinterferenční) nzlepšení mechanické stability nbiokompatibility. [USEMAP] Rozdělení membrán nmembrána = porézní prostředí, rozdělení: nhrubě porézní - póry nad 5 nm (skelná frita), permeabilitu ovlivňuje rozdíl hydrostatického tlaku na obou stranách, osmotický tlak se neuplatňuje (pokud polymer membrány neinteraguje s rozpouštědlem); permselektivita je velmi špatná až žádná (prochází všechny látky) njemně porézní - póry 1 až 5 nm (např. acetylcelulosa), rozpouštědlo prochází konvekcí a difúzí, permeabilita je dána velikostí rozpuštěných látek nneporézní (husté) - nevykazují porézní strukturu, rozpouštědlo prochází pouze difúzí n [USEMAP] Příprava membrán nje potřeba pečlivě kontrolovat podmínky (vlhkost, teplota), které silně ovlivňují vlastnosti vznikajících membrán nfázová konverze - roztok polymeru ve vhodném rozpouštědle se nalije na pevný povrch a vyčká se odpaření rozpouštědla –polyvinyl chlorid (tetrahydrofuran - THF), acetylcelulosa (aceton), polyethersulonát (dimethylsulfoxid) nebo polyurethan (THF, aceton) –vyšší vlkost a nižší teplota okolí - vznikají větší póry –nalití roztoku polymeru v org. rozpouštědle nemísitelném s vodou na vodní hladinu, zde se na rozhraní utvoří asymetrická membrána npolymerace z mono či oligomerů přímo na místě použití (tvorba „in situ“) - vhodná k přípravě fragilních gelovitých membrán (polyvinylalkohol, polyakrylamid), které obsahují velký podíl vody ndodatečná tvorba pórů - tzv. nukleární membrány (Nucleopore) –vrstva polymeru se „prostřílí“ urychlenými nukleony, lokálně narušená struktura polymeru se naleptá a vzniknou póry –velmi dobrá reprodukovatelnost a homogenita pórů o poměrně přesně definovaném průměru –lokální změny lze vyvolat mechanickým natahováním (polyenové membrány, obsahující krystalické a amorfní oblasti, v amorfních pak následně vzniknou póry) n [USEMAP] Úpravy membrán nvelikost pórů membrány lze dodatečně změnit: nzvětšení průchodnosti se dosáhne naleptáním polymeru membrány, které vede ke zvětšení průměru pórů –alkalická hydrolýza acetylcelulosy nebo polykarbonátů nzmenšení průchodnosti a zlepšení permselektivity se dosáhne depozicí vhodných látek uvnitř pórů –např. organosilanů nebo lipidických látek nsymetrické membrány - obě strany jsou rovnocenné, průchodnost oběma směry je stejná nasymetrické membrány - připravují se na rozhraní dvou fází Nucleopore membrána [USEMAP] Biokompatibilita npři použití biosensorů v živém organismu (in vivo) nebo v klinické praxi při kontaktu zejména s krví (in vitro) npři kontaktu povrchu membrán s prostředím dochází k adsorpci proteinů – zejména albuminu a fibrinogenu na povrch npak se vytváří další vrstva krevních destiček (koagulační trombóza) npři dlouhodobé implantaci dochází k zarůstání biosensoru tkání npostupné snižování citlivosti důsledkem snížené prostupnosti nbiosensor může vyvolávat rušivé reakce u živého organismu –srážení krve, zánětlivé procesy n je potřeba povrch biosensoru povléknout vhodnými polymery –silikon, polytetrafluorethylen a zejména polyurethany) nmodifikovat povrchní obal (hydrofilizace, konverze aminoskupin na hydroxyskupiny) ndo vnější vrstvy vpravit látky omezující rušivé reakce fosforylcholin, fosfolipidy, heparin [USEMAP] Adsorpce biomolekul njednoduchá a levná metoda probíhající za mírných pracovních podmínek nbílkoviny se adsorbují v náhodné orientaci, přitom může docházet ke konformačním změnám, které mohou (negativně) ovlivnit funkční vlastnosti nadsorpce bílkovin na pevný povrch bude záviset na: –vlastnostech proteinu: velikost, hmotnost, difúzní koeficient, rozložení nabitých / hydrofilních / hydrofobních / redoxaktivních skupin, konformační stabilitě –povrchovém napětí a náboji, hydrofobnosti / hydrofilnosti povrchu, stupni hydratace a struktuře hydratované vrstvy, přítomných funkčních skupinách –pH, iontové síle roztoku, přítomnosti interagujících aditiv –dalších parametrech – teplota, „inkubační geometrie“ – poměr objemu přidaného roztoku a velikosti povrchu, hydrodynamice – míchání, třepání, … [USEMAP] Mechanické zachycení biomolekul nnejjednodušší - kápne se roztok biokomponenty na povrch převodníku a překryje se dialyzační membránou nalternativní metodou je zachycení biomolekul uvnitř vhodného polymeru (inkluze), polymerní vrstva se vytvoří na povrchu podpůrné dialyzační membrány [USEMAP] Zachycení v gelu n inkluze biomolekul uvnitř struktury membrány při její tvorbě npolyakrylamid (PAG) příprava ze směsi akrylamidu a methylen-bis(akrylamid) v přítomnosti enzymu, iniciace UV světlem, polymer obsahuje vysoký podíl vody (80 až 95%) n [USEMAP] Zachycení v gelu nželatina je často používána pro enzymové membrány; 5% roztok se rozpustí při zvýšené teplotě (až 50 oC) a přidá se enzym, promíchá se a naleje na podložku (např. dialyzační membrána) nNafion je polymer rozpuštěný ve směsi alkoholů s vodou –používá se pro tvorbu permselektivních membrán - jako iontoměnič –může zachycovat biomolekuly n n [USEMAP] Zachycení v PVA npolyvinylalkohol (PVA) je hydrofilní, neutrální a biokompatibilní polymer, ve vodě silně bobtná; dostupný ve formě oligomerů (90 kDa), které po zesíťování vytvoří konečný polymer nradiační polymerace využívá ozáření směsi oligomerů a enzymu γ-zářením (generuje 60Co) –vzniklé radikály vyvolají další polymeraci a zesíťování –výsledná membrána neobsahuje žádné nežádoucí produkty a současně je sterilizována nchemické síťování – triisokyanáty (TIC), spojí postranní hydroxyly nUV polymerace - PVA obsahující styrylbipyridiniové skupiny (PVA-SbQ, 1.3%) –vůbec nejšetrnější postup imobilizace pomocí PVA [USEMAP] Polyurethany nreprezentují velice širokou skupinu biokompatibilních polymerů s velmi dobrými adhezními vlastnostmi nvychází z oligomerů (kolem 50 kDa), které se v přítomnosti enzymu zesíťují např. difenylmethan diisokyanátem n [USEMAP] Multifunkční polymery nkombinují imobilizaci enzymu s polymerní strukturou nesoucí skupiny mediátorů přenášející elektrony, tzv. redox relays npoly-4-vinylpyridin (oligomer kolem 50 kDa) se částečně využije pro tvorbu komplexu s osmiem (mediátor), a částečně se do něj kvarternizací zavedou aminoskupiny nsměs modifikovaného oligomeru, enzymu a bifunkčního činidla PEGDE (polyethylenglykoldiglycidylether) se nanese na elektrodu n n [USEMAP] Sol-gel matrice (CH3O)4Si + H2O (CH3O)3Si-OH + CH3OH 2 (CH3O)3Si-OH (CH3O)3Si-O-Si(CH3O)3 + H2O 2 (CH3O)3Si-OH (CH3O)3Si-O+-Si(CH3O)3 + OH- H sol SixOy(µ-OH)z(t-OH)4x-2y-2z gel SixOy + zH+ + (2x-y-z) H2O xerogel (mech. stabilní) nsol-gel proces – vznik „skla“ hydrolytickou polymerací monomole-kulárních prekursorů (CH3O)4Si tetramethyl-o-křemičitan (TMOS): biomakromolekula zachycení v pórech gelovatění stárnutí a vysychání [USEMAP] Zesíťování biomolekul nzdaleka nejčastěji se používá glutaraldehyd; jeho směs s roztokem bílkoviny v závislosti na koncentraci složek vytváří spontánně retikulum buď přímo na povrchu sensoru, nebo na vhodném podkladovém materiálu (polyamidová síťka, dialyzační membrána) nreakcí mezi aldehydovou skupinou činidla s aminoskupinou bílkoviny (postranní lyzinové zbytky) vzniká propojením Schiffova báze, která se ještě může zredukovat na stabilnější aminovou vazbu [USEMAP] Aktivace inertních povrchů npracovní povrch sensorů tvoří malá skupina poměrně inertních materiálů: sklo, křemík, různé modifikace uhlíku (grafit, skelný uhlík, kompozitní směsi) a ušlechtilé kovy (zejména zlato a platina) nněkteré biomolekuly se na tyto materiály adsorbují s různou pevností, avšak spolehlivá a dlouhodobě stabilní imobilizace vyžaduje kovalentní vazbu mezi biomolekulou a povrchem nprvním krokem imobilizace jsou aktivační postupy, které na málo reaktivní povrch sensoru zavádějí reaktivní skupiny schopné pak kovalentní vazby s biomolekulami [USEMAP] Silanizace nmetoda aktivace inertních povrchů částečně pokrytých vrstvou oxidu (sklo, křemík, kovy) kontaktní vrstvou silanu s vhodnou reaktivní skupinou nnepoužívají se organické halogenované silany (jsou příliš reaktivní a žádná další skupina už by nezbyla), ale méně reaktivní alkoxyderiváty nγ-aminopropyltriethoxysilan (APTES nebo APTS) nglycidoxypropyltriethoxysilan (GOPS) njejich účinkem se na povrchu vytvoří několik molekulárních vrstev R S i ( O C 2 H 5 ) 3 O S i R O O S i R O O ( C 2 H 5 O) 3 S i ( C H 2 ) 3 N H 2 ( C H 3 O) 3 S i ( C H 2 ) 3 O C H 2 C H C H 2 O S i C H 3 ( C H 2 ) 3 C H 3 C 2 H 5 O N H 2 -- OH --OH silanizace APTES GOPS APDMES [USEMAP] Silanizace nlze provádět z organické fáze –10% roztok silanu v toluenu, v něm se daný povrch refluxuje 12 až 24 hod, po promytí toluenem či acetonem a vysušení se dále zahřívá 2 až 4 hod při 110 oC nz vodné fáze se dosáhne menší vazebná kapacita, ale vrstva je stabilnější při použití ve vodném prostředí –povrch se hydratuje 30 min povařením ve vodě –zahřívá 3 až 4 hod při 75 oC v 10% vodném roztoku silanu, pH 4 –po usušení se zahřívá přes noc při 110 oC nodpařovací nanesení je nejjednodušší –povrch se inkubuje 1 hod v 1% silanu v acetonu –po opláchnutí acetonem a vysušení se zahřívá 1 hod při 110 oC nnanášení silanu z vodné fáze nebo z polárních rozpouštědel vede ke tvorbě složitějších struktur (4 až 5 vrstev silanu) [USEMAP] Spontánní vznik monovrstev nmonovrstvy (SAM, „self-assembled monolayers“) mohou vzniknout samovolnou organizací na nosném povrchu nnejběžnějším příkladem je velmi pevná adsorpce thiosloučenin na povrchu zlata nvhodnou volbou dalších funkčních skupin thiolu nebo disulfidu lze získat reaktivní skupiny využitelné pro další imobilizační kroky [USEMAP] SAMs nvždy vzniká monomolekulární vrstva, která může být tak hustá, že povrch je prakticky elektricky izolován nnaopak adsorpce krátkých thioderivátů často zlepšuje elektrochemické odezvy bílkovin a jiných látek (usnadněná výměna elektronů s cyt c) nhustotu a kompaktnost vrstvy lze určit elektrochemicky –na základě signálu vhodné elektroaktivní látky (ferrikyanid) –nebo sledovat pokles vodivosti povrchu v průběhu vzniku SAM [USEMAP] Thiosloučeniny nnejčastěji se používají thioly obsahující v molekule aminoskupinu (cysteamin, cystamin, thiofenol), hydroxyskupinu (16-merkapto-hexadekanol) nebo karboxyskupinu (12-merkaptoundekan-karboxylová kyselina) nbis(N-hydroxysukcinimidester) kyseliny 3,3’-dithiopropionové (DSP) je speciální činidlo, které se váže na zlato – N-hydroxysukcinimidová skupina (NHS) je reaktivní a může být vyměněna za volnou postranní aminoskupinu z bílkoviny, přičemž vznikne amidová vazba n n [USEMAP] Aktivace polyamidu npolyamidy se připravují polykondenzačními reakcemi –Nylon 66 - z 1,6-diaminohexanu a hexan-1,6-dikarboxylové kyseliny –Silon - kondenzací ε kaprolaktamu nvyužívány ve formě membrán, sítěk, kuliček a trubiček pro imobilizaci enzymů nmálo volných koncových skupin - nutné strukturu částečně narušit –opatrnou hydrolýzou (3 M HCl, doba závisí na formě materiálu, 10 sec až 1 hod) –často se však polyamid mechanicky naruší nvýhodnější aktivační postupy, které amidovou vazbu nepřerušují –O-alkylace amidové vazby oxoniovou solí (triethyloxonium BF4-) nebo dimethylsulfátem –vzniklý imidoester reaguje v slabě alkalickém prostředí s aminoskupinou (lyzin, 1,6-diaminohexan) za vzniku amidinu, kladný náboj zvyšuje polaritu polymeru nzíská se větší povrchová hustota využitelných karboxy nebo aminoskupin n n [USEMAP] Elektropolymerace nvyužívá elektrochemickou oxidaci k přípravě reaktivních monomerů, ty spontánně vytváří polymerní film na povrchu elektrody nfunguje i na členitém povrchu nebo na povrchu mikroelektrod npokud jsou v průběhu elektropolymerace v roztoku přítomné biomolekuly, dochází k jejich zachycení uvnitř vznikající membrány; méně se může uplatnit také kladný náboj polymeru nvlastnosti membrány je možné ovlivnit přídavkem dalších látek do elektropolymerační směsi ntloušťku membrány určuje velikost prošlého náboje, tak se dá snadno reprodukuvatelně ovlivnit množství imobilizované biomolekuly nněkteré elektropolymerní vrstvy mohou být navíc vodivé, což usnadňuje přenos elektronů mezi elektrodou a biomolekulami; tyto polymery jsou obvykle barevné [USEMAP] Polypyrrol (PPY) nklasický příklad, provádí se oxidací 50 až 200 mM pyrrolu amperometrickou oxidací při potenciálu kolem 0.8 V, jako elektrolyt se přidává KCl, pracuje se v anaerobním prostředí ntloušťka filmu je úměrná množství prošlého náboje (5 mC/cm2 odpovídá 13 nm), lze dosáhnout až 100 nm tlustých vrstev nvzniklý PPy film je vodivý, vodivost dosahuje asi 500 S/cm –pro srovnání jsou vodivosti mědi 106, křemíku 10-4 a skla 10-11 S/cm). nobdobně probíhá elektropolymerace methylpyrrolu [USEMAP] Polyfenylenoxid (PPO) nvelmi tenké a mechanicky stabilní filmy PPO na povrchu elektrod vznikají elektropolymerací fenolu nnevodivé, takže elektropolymerace se samovolně zastaví, jakmile je povrch elektrody elektricky izolován nprůběžně se dá pozorovat pokles oxidačního proudu při vzniku filmu: n n n n n n nméně stabilní jsou polyanilinové (PANI) filmy vzniklé z anilinu: n I I čas potenciál 1 2 3 Elektropolymerace fenolu amperometricky a cyklickou voltametrií [USEMAP] Kontrolní membrány nelektropolymerní vrstvy jsou také vhodné pro ovlivňování transportu látek jako kontrolní membrány - polyfenylendiaminové (PPD) filmy z 1,2 diaminobenzenu nnevodivé o tloušťce kolem 10 nm; snadno přes ně prochází peroxid vodíku, přitom jiné rušivé látky jsou odstíněny nprotože zachycení bílkovin uvnitř polymeru je poměrně volné, dochází časem k uvolnění do roztoku a tím k poklesu aktivity n njiné postupy proto použivají elektropolymerní film jen jako výchozí chemickou modifikaci povrchu elektrody, a film se pak dále upravuje chemickými reakcemi. n [USEMAP] Modifikace elektropolymerů npolypyrrol se dá nitrovat v β poloze a elektrochemickou redukcí nitroskupiny se získá aminoskupina vhodná pro další kovalentní vazbu biomolekul: n n n n n nmožností je i reakce PPy s nitrobenzoylchloridem, nitroskupinu je pak možné redukovat také chemicky zinkem v kyselině octové: n n [USEMAP] Elektropolymerace bílkovin nelektropolymerovat se dají také vhodné deriváty biomolekul ve směsi např. s pyrrolem nk postranním skupinám enzymů je možné připojit pyrrolová jádra, takže po skončení elektropolymerace je enzym nedílnou součástí řetězce polymeru: n n n n npodobně je možné využít i derivát s koncovou aminoskupinou [USEMAP] Kovalentní vazba biomolekul npředpokládá se vazba zvolené biomolekuly na výchozí materiál (povrch sensoru, membrána, …) nesoucí některou z následujících skupin: amino karboxyl hydroxyl n ndále jsou popsána vhodná činidla umožňující kovalentní vazbu biomolekul, zejména bílkovin nnásledující část je samozřejmě míněna pouze jako neúplný přehled základních postupů nneustále se objevují nová speciální činidla použitelná obecně nebo pro speciální aplikace; nové reagenty lze nalézt v katalozích firem (Pierce, Merck) [USEMAP] Imobilizace na aminoskupinu nnejjednodušší je aktivace aminoskupiny vhodným bifunkčním činidlem, pak reaguje svou druhou reaktivní částí s vhodnou povrchovou skupinou navazované biomolekuly (B) npoužívá se glutaraldehyd, který je běžně dostupný a dostatečně reaktivní; inkubací (0.5 až 5% vodný roztok, 0.5 až 2 hod) s povrchem se vytvoří Schiffova báze a po promytí pak je druhá volná aldehydová skupina k dispozici pro stejnou reakci s aminoskupinou biomolekuly [USEMAP] nchloranil (tetrachlor-p-benzochinon), který mimo imobilizační funkci obsahuje redoxaktivní chinonové uspořádání využitelné pro přenos elektronů mezi enzymem a elektrodou: n n n n n n ndianhydrid kyseliny benzentetrakarboxylové nebo DIDS, trans- stilben-(4,4’-diisothiokyanát)-2,2’-disulfonová kyselina: Další bifunkční činidla pro –NH2 [USEMAP] Aromatická –NH2 skupina naromatické aminoskupiny lze velice snadno aktivovat diazotací kyselinou dusitou, biomolekula se naváže přes tyrozinový zbytek: HNO 2 N H 2 N N + H O B N N H O B Imobilizace pomocí diazotace [USEMAP] Imobilizace na karboxyskupinu npro aktivaci se užívá reakce s karbodiimidy, které působí vlastně vázání vody při vzniku amidové, esterové či thioesterové vazby ndicyklohexylkarbodiimid DCC, nevýhodou je nerozpustnost ve vodě nve vodě rozpustný je EDC, 1‑ethyl‑3‑(3‑dimethylaminopropyl)‑karbodiimid, a CMC, 1‑cyklohexyl-3‑(2‑morfolino-ethyl)‑karbodiimid methoxy‑p‑toluensulfonát [USEMAP] Vazba přes NHS nPro imobilizaci citlivějších bílkovin se neprovádí přímo reakce s CDI, ale pomocí CDI a N-hydroxysukcinimidu (NHS) se připraví reaktivní a stabilní NHS derivát karboxylu nten pak reaguje s aminoskupinou např. bílkoviny, proti reakci pouze s CDI je průběh mírnější a nevznikají nežádoucí meziprodukty n n n n n nTSTU O-(N hydroxy-sukcinimidyl)-N,N,N’,N’- tetramethyluronium tetrafluoroboritan inkubací (vDMF) s ekvimolárním množstvím karboxylu poskytne NHS derivát přímo [USEMAP] Sacharidové matrice s -COOH karboxymethyl (CM-)dextran např. u SPR čipů [USEMAP] Metoda směsných anhydridů nvyužívá aktivaci pomocí isobutylchloroformiátu, který aktivuje karboxyskupinu na reaktivní anhydrid a ten pak umožňuje vznik amidové vazby: [USEMAP] Aktivace hydroxyskupiny npro imobilizace na povrchy modifikované sacharidovou vrstvou (nejčastěji dextran), která dodává hydrofilní vlastnosti zvyšující biokompatibilitu nepichlorhydrin - na oxiranový cyklus se mohou adovat biomolekuly prostřednictvím amino či hydroxyskupiny: n n n n ntriazinová metoda využívá kyanurchlorid a zejména jeho méně reaktivní deriváty (X substituent O-CH2-COOH či NH-CH2-COOH) [USEMAP] Bromkyanová metoda nklasickým činidlem aktivace polysacharidových materiálů je použití bromkyanu, jeho nevýhodou je vysoká jedovatost nreakce s hydroxyly probíhá v alkalickém prostředí, rozsah aktivace je úměrný koncentraci činidla nmeziprodukt imidokarbonát reaguje s aminoskupinou biomolekuly za vzniku různých derivátů: [USEMAP] Oxidace jodistanem nsacharidové materiály obsahující diolové uskupení je možné za mírných podmínek oxidovat jodistanem, přitom vzniklé aldehydové skupiny reagují s aminoskupinami biomolekul za vzniku Schiffových bází ntato reakce je použitelná i pro aktivaci bílkovin nesoucích postranní sacharidové zbytky, ale například také pro RNA n n n n n n nlze využít i pro aktivaci hydroxylu po připojení glycidolu: [USEMAP] Amidoskupina npředevším v polyakrylamidu nalkalickou hydrolýzou (zahřívání 60 oC, pH 10.5, NaHCO3 a Na2CO3) lze převést na karboxylovou skupinu nhydrazinolýza vedoucí k hydrazidu kyseliny, který se kyselinou dusitou převede na reaktivní azid kyseliny nzahřívání polyakrylamidu v bezvodém ethylendiaminu povede k substituci a získá se koncová aminoskupina [USEMAP] Thioskupina numožňuje reverzibilní imobilizaci bílkovin s volnými cysteinovými zbytky, vazba vznikne oxidací a přeruší se redukcí: SH + S H B S S B ferrikyanid cystein [USEMAP] Imobilizace přes afinitní komplexy nnevzniká kovalentní vazba, ale navázání cílové biomolekuly se děje prostřednictvím velmi pevné nebo jinak výhodné afinitní interakce: nbiotin – avidin (streptavidin) nprotein A (G, L) - molekula imunoglobulinu nboronátové komplexy nmetaloafinitní komplexy s histidinovými zbytky [USEMAP] Biotin / Avidin nvelmi pevná interakce, KD = 1.3 x 10-15 M nodolnost komplexu - stabilní v 8 M guanidinu při pH 5, disociuje až při pH sníženém na 1.5 navidin - tetramer (4 x 16.4 kDa), každá podjednotka má vazebné místo pro biotin, glykoprotein, pI 10, izoluje se z vaječného bílku nstreptavidin - obdobná struktura (tetramer 4 x 15 kDa), strukturně odlišný od avidinu, pI 5-6 - menší celkový náboj - méně nespecifických interakcí, ze Streptomyces avidinii nširoce používáno pro přípravu konjugátů, značení a imobilizace n D-biotin [USEMAP] Reverzibilita komplexu ninterakce mezi biotinem a avidinem za normálních podmínek nelze přerušit nimobilizace různých biotinylovaných biomolekul na avidinovaný povrch n n nnitroavidin – připraví se nitrací tyrosinových zbytků v avidinu (volný nebo imobilizovaný) pomocí tetranitromethanu ninterakci mezi biotinem a nitroavidinem lze narušit nadbytkem biotinu nebo při pH 10 B B NO2 lze přerušit nelze lze přerušit [USEMAP] Biotinylace - lysin, ev. jiné -NH2 nalternativně lépe rozpustný nebo s delším spacerem: Sulfo-NHS-biotin: NHS-LC-biotin: (i sulfo varianta) n NHS-biotin NHS 1.35 nm x 2.24 nm [USEMAP] Biotinylace –SH maleimido-propionylbiocytin ... ... N-[6-(biotinamido)hexyl]-3’-(2’-pyridyldithio)propionamid biotin-HPDP [USEMAP] Biotinylace sacharidů biocytin-hydrazid po oxidaci jodistanem na aldehyd s CDI účinkuje i na Asp a Glu [USEMAP] Biotinylace Tyr, His diazobenzoyl-biocytin [USEMAP] Fotobiotin N-(4-azido-2-nitrofenyl)-aminopropyl- -N’-(N-D-biotinyl-3-aminopropyl)-N’- -methyl-1,3-propandiamin [USEMAP] Boronátové komplexy nkyselina boritá je schopna vytvářet komplexy se sloučeninami obsahujícími diolové uskupení – sacharidy, glykoproteiny nmožnost využití pro reversibilní imobilizaci biomolekul pomocí kyseliny m-aminofenylborité (APBA): n n n n n n n nnejznámější je možnost měření hladiny glykosylovaného hemoglobinu [USEMAP] nvelmi silnou komplexaci mezi kyselinou fenylboritou (PBA) a salicylhydroxamovou (SHA) využívá firma Prolinx pro generický způsob imobilizace biomolekul či tvorbu biokonjugátů: n n n n n n nSHA je obvykle kovalentně navázána na povrch sensoru a PBA (nebo diboritá varianta PDBA) je dostupná v preaktivované formě pro modifikaci biomolekul: Boronátové komplexy (Versalinx) PDBA-X-NHS [USEMAP] npřímá kovalentní imobilizace IgG můž vést díky nevhodné orientaci k málo aktivním povrchům: n n n n n n n nend-on side-on top-on orientovaně n nProtein A – isolován z buněčné stěny Stafylokoka, Mr = 42 kDa má silnou afinitu k Fc části imunoglobulinů (do jisté míry závisí na původu Ig) – 4 vazebná místa pro Fc norientovaná imobilizace IgG zvyšuje vazebnou kapacitu povrchu npodobně fungují i protein G a protein L n n n n Imobilizace IgG Protein A Fab Fc Fab [USEMAP] nkomplexotvorná reakce nitrilotrioctové kyseliny (NTA) s vhodným iotem kovu (Ni2+, Cu2+) a imidazolovým kruhem histidinových zbytků n n n n nlysin-NTA Metaloafinitní interakce M2+ protein [USEMAP] Metaloafinitní interakce nrekombinantní proteiny – na N nebo C konci nesou velmi často několik (5-6) histidinových zbytků – „oligohistidine tag“ nvyužití při purifikaci a při imobilizaci na povrch sensorů nsnadná obměna ligandů - komplex se rozruší EDTA nebo imidazolem n„přidání“ povrchových His skupin k bílkovinám – např. oxidace sacharidových zbytků jodistanem a pak navázání His, stabilizace Schiffových basí redukcí [USEMAP] Langmuir-Blodgett technika namfifilní molekuly (surfaktanty, fosfolipidy) utváří orientovanou monovrstvu na rozhraní vody a vzduchu (Langmuirův film) nuhlíkatý řetězec (CH2)n –pro n<<12 vznikají micely –pro n>>12 vznikají krystaly nstruktura filmu se ovlivní kompresí n [USEMAP] Přenos LB filmů ntyp LB filmu určují: nsložení subfáze, teplot npovrchové napětí při depozici nrychlost depozice ntyp povrchu, doba inkubace ve vzduchu a v subfázi nzpůsob nanášení: –up (vynořování) –down (ponořování) n n n [USEMAP] KSV 3000 LB filmy nlze použít prakticky pro jakýkoliv typ pevného substrátu npřesná kontrola tloušťky nanášené vrstvy nhomogenní struktura i pro rozměrné plochy nmožnost vytvářet multivrstevné struktury s různými typy jednotlivých vrstev n ntypická aplikace – lipidové dvojvrstvy [USEMAP] struktura biomembrány hydrofilní protein zakotvený přes hydrofobní část integrální protein lipidová dvojvrstva amfifilní molekuly Lipidové membrány (BLM) [USEMAP] lipidová dvojvrstva kontaktní vrstva elektroda VYPNUTO SEPNUTO Princip: volná disociace podjednotek gramicidinu v lipidové dvojvrstvě umožňuje jejich asociaci, vedoucí k funkčnímu iontovému kanálku Biochemický spínač [USEMAP] Afinitní převodník Příklad kompetitivního stanovení na bázi biochemického spínače OFF ON afinitní komplex (bez pohybu) nový komplex vzniká - horní podjednotka je uvolněna + volný analyt + [USEMAP]