mosuasoiq loouiod jo^ejajuioiq A>i!)aui>| eipnjs Ape|yjez □ ODODODODODOD onononononono □ ODOnODOnODOn onononononono noDOnoDOnonon onononononono □ODonononoDOö ononononono □onoDononon ononononono □ onoDononon ononononono □onoDononon n o n o n o O n o □ O n n o n o n o O n o □ O n onononononono nnnnnnnnnnnnn Aflnltní Interakce ■ vznik afinitního komplexu na základě specifické interakce dvou biomolekul s komplementárními vazebnými doménami je základem všech procesů v živých systémech ■ experimentální studium interakcí mezi biomolekulami pomáhá objasnit vzájemné vztahy v biologických systémech ■ mimo klasické procesy studia afinitních interakcí jsou nyní v biochemii a biologii stále častěji využívány moderní metodiky na bázi biosensorů ■ přínosem biosensorů je rychlost, pohodlnost a možnost přímého sledování interakce v reálném čase bez nutnosti značení Typy afinitních interakcí molekulární reakce mezi partnery: antigén protilátka hormón receptor leciva receptor enzým kofaktor / substrát / inhibitor receptor mikroorganismus / buňka nukleová kyselina vazebná bílkovina nukleová kyselina komplementární řetězec Afinitní interakce Kinetické konstanty: ka... asociační rychlostní konstanta Ar^... disociační rychlostní konstanta KA = ka/kd asociační rovnovážná konstanta Rozdělení afinitních sensorů ■ vždy je jeden z afinitních partnerů imobilizován na povrchu převodníku; podle generování signálu se pak rozlišují: ■ přímé afinitní biosensory vznik biokomplexu je možné sledovat přímo v průběhu afinitní interakce (v reálném čase) jako převodníky slouží speciální optické světlovodné systémy, piezosensory nebo impedimetrická zařízení ■ nepřímé afinitní biosensory jeden z afinitních partnerů je vhodně označen, na konci interakce se pak stanoví množství značky navázané na povrchu sensoru podle typu značky (enzym nebo fluorofor) se použije převodník vhodný pro měření enzymové aktivity nebo fluorescence Schéma měření s biosensorem Charakterizace afinitních reakcí proč merit rychlostní kinetické konstanty? 400 200 0 - 4001 200- 1-1-1-1 0 1000 2000 3000 t(s) T-1-1 1000 2000 3000 t (s) 400 1 200 ■ 400 i 200 ■ 1000 2000 3000 t (S) —i-1-1 1000 2000 3000 t (s) všechny tyto interakce mají stejnou rovnovážnou konstantu, liší se rychlostními konstantami Kinetická analýza ■ kvantitativní charakterizace afinitních interakcí má základní význam pro řadu oblastí biochemie, biotechnologie i biologie ■ klasické metody pro měření afinity jsou obvykle založeny na smísení interagujících partnerů, dosažení rovnovážného stavu, separaci volných a vázaných molekul a kvantifikaci jednoho z partnerů ■ užívají se vhodné detekční značky - radioaktivita, fluorescence, enzymy ■ nezískají se kompletní kinetická data a navíc může dojít ke změnám nativní molekuly ■ nejvíce informací lze vždy získat při průběžném sledování vazebného děje pomocí biosensorů ■ jedna z interagujících látek - ligand - je navázána na povrchu citlivé oblasti vhodného fyzikálního sensoru ■ při specifické vazbě druhé látky se změní fyzikální charakteristiky citlivého povrchu, na které sensor reaguje změnou signálu ■ vazebnou interakci tak lze sledovat v reálném čase a přímo bez nutnosti používat značení. Uspořádání experimentu nejčastěji používaná metoda studia bioafinitních interakcí je schématicky znázorněna na obrázku jedna z reagujících látek (ligand L) je imobilizována na citlivém povrchu sensoru (| —) druhá (receptor R) je přítomná v roztoku v koncentraci c, ta je obvykle během měření prakticky neměnná, např. při průtočném uspořádání sleduje se tvorba komplexu RL: K —L + R —- —LR k, interakci popisují kinetické rychlostní konstanty ka (asociační) a kd (disociační). d[RL]/dt = ka [R][L] - kd [RL] rychlost tvorby komplexu je: Po ustavení rovnováhy (d[RL]/dr = 0) jsou koncentrace všech forem dány rovnovážnými konstantami KA resp. KD; platí pro ně vztahy KA = [RL]/([R][L] = ki/k* KD = 1/KA. |-ligand + receptor « ► |- komplex ■ měřený signál je úměrný množství vznikajícího komplexu ■ u všech typů sensorů signál závisí na hmotnosti molekul navázaných na citlivý povrch Výpočet kinetických konstant ■ výchozí signál Y0 se bere nulový ■ vazebná kapacita Ymax povrchu je úměrná celkové změně signálu po obsazení všech přítomných molekul Ugandu L ■ v průběhu vazby bude zbývající množství volného neobsazeného Ugandu L přímo úměrné rozdílu Ymax -Y ■ množství navázaného partnera R je přímo úměrné Y: d[RL]/df = dWdf = k,c(Y- Y^J -kdY ■ a další úpravou získat: dWdf = kacYmax-{kac + kd)Y ■ k určení kinetických parametrů z experimentálních závislostí Y na čase ŕ lze použít dva odlišné postupy, linearizaci transformací nebo nelineární regresi Linearizace experimentální závislost Y=f(t)se numerickou transformací (derivace) převede na tvar dY/dt = f(Y) nově získaná závislost by měla být lineární tvaru dY/dt = a + bY pro absolutní člen (úsek na ose y) platí a = kacYmax, pro směrnici b = -kac - kď pokud se provedou vazebná měření pro řadu koncentrací c volného partnera L, lze kinetické rychlostní konstanty ka, kd jednoduše zjistit vynesením závislostí a, b na koncentraci c na základě grafu směrnic se určí velikosti konstant a z grafu úseků vazebná kapacita Ymax lineární transformace primárních naměřených dat bohužel vede také k transformaci chyb počítaných parametrů, a tak jsou kvalitní naměřené údaje částečně znehodnoceny... v současnosti používána zřídka Ukázka použití ELSEVIER JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS Journal of Immunological Meihods J76 (1994) 117-125 Characterization of monoclonal antibodies to 2,4-dichlorophenoxyacetic acid using a piezoelectric quartz crystal microbalance in solution Petr Skládalá,b*, Maria Minunni ů, Marco Mascini \ Vladimír Kolár c, Milan Franěk c 5 TTlitl Fig, 2. Experimental tracings obtained during the flow of solutions of the monoclonal antibody E2/G2 through the cell with the APTS/GA/BSA/2,4-D modified piezoelectric crystal. The individual curves were shifted vertically for better resolution and the concentrations of IgG solutions t/ig/m)) are indicated above the curves. In the inset ^raph, the frequency changes the end of the 15 min binding period are plotted vs. corresponding ]gG concentrations. Fig. 5. Experimental binding curves obtained from flow of the individual MAb sululions (30 ^ig/ml) through the cell containing the APTS/GA/BSA/2,4 D modified piezoelectric: crystal. 0.6 - PfC} Wi/QZ O 10 Ait/ail 50 [UG] Of/ml) Fig. 3. The resulls of transformations Of the f-i curves (Fig. Fie- 4* The dependence of slopes SL (o) and intercepts INT 2) lo the dependencies of (df/dt) on / (deiails are explained _ ." ■f / from Fig. 3) on concentrations of the monoclonal antibody in the text). The concentrations of IgG E2/G2 corresponding E2/G2 Th£ error bars represerit the caJcuiated staTldard to the individual curves (symbols) are shown in ihe figure. deviations. = 4540 ±270 moP1! s'1 itd = 7.89 x 10_4± 8.5 x 10-5 s_1 _Nelineární regrese_ ■ je exaktnější postup vycházející z integrace rovnice výchozí podle času, to přímo vede k výrazu závislosti velikosti signálu Y na čase f: YJgCYmax {l-*Xp[-(kaC+kd )t] } _Kc+K_ ■ z jediného experimentu tak je možné určit přímo žádané kinetické konstanty (takto se používá zřídka) ■ pro usnadnění numerického výpočtu lze zavést Yeq, tj. velikost signálu při dosažení rovnovážného stavu: Yeq=KcYmax /(kac+kd )=cYmax /(c+KD )=KAcYmJ(c +KA) ■ rovnice pak přejde na tvar: Y=Yeq{l-exP[-(kac+kd)t]} dalšího zjednodušení výpočtu lze dosáhnout zavedením kobs = kaC + kd \Y=Yeq{[l-exp(-kobst)] ■ hodnoty kinetických rychlostních konstant pak lze určit vynesením kobs proti koncentraci volného vazebného partnera ■ nelineární regrese umožňuje vyhodnotit vazebné křivky tvořené ze dvou nezávislých kinetických interakcí (např. nespecifická adsorpce Ugandu), je možné uvažovat vliv nestability základní linie, lze korigovat změny signálu vyvolané výměnou pracovního roztoku ■ po nástřiku vzorku dochází obvykle k výrazné změně indexu lomu okolního prostředí, které se projeví jako prudká změna signálu u optických sensorů, stejně působí změny viskozity u piezoelektrických sensorů ■ nelineární regerese je univerzální, lze použít i tam, kde linearizace selhává nebo není principiálně použitelná vůbec Ukázka kinetické analýzy Studium interakce protilátky s imobilizovaným haptenem pomocí piezoelektrického biosensoru Interakce antigénu (imobiliz.) s fragmentem protilátky (scFv) Time (min) Time (min) Biacore 3000, Ag imobilizován na čipy CM5 a CM3, interakční závislosti pro různé koncentrace protilátek ukázky průběhu interakčních křivek pro různé koncentrace protilátky (nM) Vyhodnocení ref. kanál 1 - BSA, povrchové hustoty antigénu (RU, v kanálu č.): CM3: 2 - 264, 3 - 920, 4 - 647; CM5: 2 - 1206, 3 - 513, 4 - 2550) průtočná rychlost 25 ul/min (bez vlivu) Ukázky nalezených kinetických konstant - v závislosti na použité konc. Ab (nezávislá regrese každé křivky použitím Scrubber2, Biaevaluate použit pro extrakci dat) 200 150 100 50 A A A *A 30 20 10 O O o o§ o o o Distribution of the fitted k a values according to [Ab] CM3 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) ň A A CM3 A 50 100 150 [Ab] (nmol ľ) 200 Distribution of the fitted ka values according to [Ab] CM3 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) O 9 9 o o CM3 g 50 100 150 [Ab] (nmol ľ1) 200 200 150 100 50 A A A AA. 30 - 20 - 10 - O O 9 o o Distribution of the fitted k a values according to [Ab] CM5 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) CM5 A A A A 50 100 [Ab] (nmol ľ) 150 200 Distribution of the fitted ka values according to [Ab] CM5 chip with immobilized Ag (NHS/CDI) O CM5 9 50 100 [Ab] (nmol ľ) 150 200 Výsledky: i CM3: ka = 56300. ± 8300 I moh1 S"1 /cd = (6.9±1.5)-10-5S"1 CM5: ka = 38000 ± 12000 I moh1 S"1 /cd = (7.3±1.8)-10-5s-1 Pisociační fáze interakce ■ po vytvoření komplexu LR na povrchu sensoru se z okolí odstraní volný receptor R a lze pozorovat zpětný rozpad (disociaci) komplexu na výchozí složky ■ kineticky tento proces odpovídá dříve uvedené rovnici dWdí- k^Y^-(kao + kd)Y ■ kde se položí [R] = c = 0, odtud pak plyne: dWdř =-kdY ■ je-li výchozí množství komplexu LR na povrchu sensoru dáno signálem Ya, integrace vede ke vztahu: Y - vaexp(-/fd t) ■ z experimentální disociační křivky lze pak parametry kd a Ya určit nelineární regresí, případně po úpravě na rovnici přímky lineární regresí: \nY = \nYa-kdt Interakce proteinu GP41 (imob.) a scFv protilátek (Spreeta)__ 40 (ig/ml 20 f 15 10 5 i B12J buffer' buffer' buffer An = 0.0005 At= 10 min Dissociation interaction ci rate constants determined from di? jrves sociation parts of the Antibody *d (s"L) B12 Q.QQ15± 0.002 0 CM 0,00039 =0,00048 biotinylovaný protein gp41 byl imobilizován na Au sensor přes cystamin, glutaraldehyd a avidin Asociace MmoľW1) Disociace Ms"1) Tvar závislosti Způsoby určení konstant středně rychlá 100 až 5-106 velmi rychlá «0.01 J n i_ asociace => ka rovnováhy => Ka disociace příliš rychlá středně rychlá 100 až 5-106 rychlá 0.001 až 0.01 asociace => ka rovnováha ^> Ka disociace => kd středně rychlá 100 až 5-106 středně rychlá 10"5 až 0.001 asociace => ka rovnováha nenastává disociace => kd středně rychlá 100 až 5-106 pomalá < 10"5 asociace ^> ka rovnováha nenastává disociace příliš pomalá rychlá > 5- 10"5 velmi rychlá «0.01 asociace příliš rychlá rovnováha => Ka disociace příliš rychlá rychlá > 5- 10"5 rychlá 0.001 až 0.01 J asociace příliš rychlá rovnováha => Ka disociace => kd rychlá > 5- 10"5 středně rychlá 10"5 až 0.001 asociace příliš rychlá disociace => kd Kinetika u Biacore ukázky průběhu interakčních křivek pro různé kombinace hodnot rychlostních konstant Kinetika u BIACORE interakce imobilizované karbonátanhydrasy II (30 kDa) a acetozolamidu (222 Da) challenger 19 low density ri subrt.txt low density challenger 1 9 medium density ri subt.ut medium density A 0 A + B AB Í77 km =1.282 m f 9\l/3 fvD2 A V hl J -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 -50 0 50 100 15fl 200 250 300 33) 400 450 challenger 19 high density ri subttxt high density response RU time/s -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 ka= 1.141 xlO7 l.moH.s-1 ^=0.178 s"1 Evaluation software: SCRUBBER-data layout CLAMP - kinetic calculation V praxi to bývá komplikovanější ■■■ ■ při disociaci ligandu z povrchu sensorů se může někdy vyskytovat tzv. "rebinding,, - partner R se sice uvolní z komplexu LR, ale než se stačí dostat do volného roztoku, je zachycen jinými neobsazenými Ugandy L na povrchu ■ nastává pokud je povrchová hustota ligandu L vysoká (L je nízkomolekulární) ■ nebo pokud biovrstva není monovrstvou a má větší tloušťku (imobilizace v dextranové matrici) ■ projevem bývají velmi nízké hodnoty kd oproti očekávání ■ při analýze interakcí protilátek (IgG) s imobilizovanými antigény se obvykle uvažuje stechiometrie interakce 1:1, nicméně při interakci s imobilizovanými hapteny (R) je možná i bivalentní vazba ■ různé orientace (nehomogenita) ligandu ■ transport látek z roztoku k sensorů ■ obvykle existuje na povrchu sensorů nemíchaná vrstva - mimo vlastní afinitní interakce je tedy nutné uvažovat difúzni transport partnera R ■ bude diskutováno v další části