HPLC

Kolonová chromatografie je separační technika sloužící k rozdělení chemických směsí na jednotlivé
složky. Tyto složky je následně možné jednotlivě analyzovat. Směs je nanesená na kolonu naplněnou
stacionární fází a eluovaná z kolony mobilní fází (rozpouštědlem). Různé složky interagují různou
měrou se stacionární fází, čímž se jejich průchod kolonou různou měrou zpomaluje. Naopak vyšší
rozpustnost dané složky v mobilní fázi její průchod kolonou urychluje. Cílem chromatografie je co
nejlepší rozlišení jednotlivých složek. Vlastnost, která určuje rozpustnost v mobilní fázi a
interakce se stacionární fází, je nejčastěji polarita, ačkoli v závislosti na výběru stacionární
fáze to může být např. i náboj nebo velikost molekuly.

Nejběžnější typ chromatografie, kapalinová chromatografie, využívá kolony naplněné pevnou
stacionární fází a kapalnou mobilní fázi – rozpouštědlo. U vysokoúčinné kapalinové chromatografie
(HPLC) je aplikován tlak, což umožňuje použít kolony plněné menšími částicemi s větším povrchem, na
kterém dochází k interakcím. Tím se zlepšuje rozlišení.

Při dělení molekul podle polarity využíváme kolony s normální nebo reverzní fází. Kolony s normální
fází (NP) obsahují polární stacionární fázi – silikagel, který obsahuje kyselé silanolové funkční
skupiny. Naproti tomu kolony s reverzní fází (RP) mají silikagel modifikovaný nepolárními
skupinami, nejčastěji uhlíkovými řetězci: -C8 nebo -C18. U chromatografie s normální fází je
tradičně používáno čistě organické rozpouštědlo (typicky hexan). Pro analýzu polárních látek, které
by se organickým rozpouštědlem nevymyly, se přidává voda ve variantě nazvané hydrofilní interakční
chromatografie (HILIC). U iontově výměnné chromatografie (IEC) jsou používány kolony s nabitou
(kyselou nebo bazickou) stacionární fází pro separaci nabitých molekul.

Rozpouštědla by měla být co nejčistší (vysoká čistota chemikálií, filtrace 0,45 µm). Často je
potřeba kontrolovat při analýze pH (např. mohou-li analyty disociovat, což by zkomplikovalo jejich
interakci s nepolární stacionární fází). V takovém případě se do rozpouštědel přidávají kyseliny
nebo pufry. V každém případě musíme dbát na to, aby do kontaktu nepřišla rozpouštědla, která jsou
vzájemně nemísitelná nebo nerozpustná, tak aby nedošlo ke vzniku sraženin.

●        Objem prodlevy (dwell volume) je objem chromatografického systému mezi místem, kde se
míchají mobilní fáze a vstupem do kolony.

●        Mimo-kolonový objem (ECV) je objem systému mezi nástřikem vzorku a detektorem (ale bez
objemu kolony).

●        Objem kolony (column volume) je objem mobilní fáze v koloně.

●        Efektivita (N) se udává v počtu teoretických pater, což je číslo určující, kolikrát během
průchodu danou kolonou dosáhne analyt rovnovážného stavu mezi fázemi.

●        Retence (k) udává, jaký je pro daný analyt poměr doby strávené ve stacionární a mobilní
fázi.

●        Selektivita (α) vyjadřuje vzdálenost dvou píků.

●        Rozlišení kombinuje tyto parametry a udává schopnost dané kolony rozlišit dané analyty:

Parametry, které ovlivňují kvalitu detekce, jsou senzitivita, selektivita a lineární rozsah
detektorů. Tyto parametry se liší pro jednotlivé detektory i analyty. Nejčastěji používaný typ
detektoru v kapalinové chromatografii pracuje na principu absorpce analytů v ultrafialovém nebo
viditelném světle. Druhý nejčastější typ, detekce na principu hmotnostní spektrometrie, zahrnuje
přidání další separační techniky – dělení podle hmoty (přesněji poměru m/z).

Možné kroky v přípravě vzorku:

Homogenizace, přídavek standardů, odstranění interferentů, hydrolýza, extrakce, derivatizace,
převedení do mobilní fáze, filtrace

                                     Analýza vína metodou HPLC

Složení vína:

●        voda 86 %

●        ethanol 12 %

●        glycerol 1 %

●        organické kyseliny:

jablečná, citronová, jantarová, vinná, mléčná, fumarová, octová

●        cukry

●        fenolické látky, především flavonoidy:

anthokyany (pochází ze slupek, v menší míře z dužin modrých hroznů),

katechin a epikatechin (pochází z jader) a další


Výroba vína:

Základní surovinu pro výrobu vína tvoří hrozny révy vinné, a to buď bílé hrozny pro výrobu bílých
vín nebo modré hrozny pro výrobu červených vín. Nejprve je třeba oddělit třapinu. Vzniklý mošt s
narušenými bobulemi se nazývá rmut.

Mošt se od rmutu oddělí lisováním. U bílých vín k tomu dochází většinou po krátké době naležení,
několik hodin po oddělení třapin. Rmut se nechává naležet kvůli lepší extrakci aromatických látek,
které jsou uloženy ve slupce bobulí. Oranžová vína získáme z bílých hroznů tak, že mošt necháme v
dlouhodobém kontaktu se slupkami, jádry a často i s třapinami. V případě výroby červených vín se
rmut lisuje až poté, co prokvasí spolu se slupkami a jádry. U růžových vín se rmut z modrých hroznů
nechá několik hodin naležet a poté se vylisuje. Pokud se rmut z modrých hroznů lisuje ihned (bez
naležení), vzniká bílý klaret.

Kvašení (proces přeměny cukru na alkohol) může nastartovat samovolně díky kvasinkám, které jsou
přirozeně přítomny na hroznech, ale většinou se používají speciální selektované kmeny kvasinek.
Hlavně u červených vín se často po hlavním kvašení provádí ještě tzv. jablečno-mléčná fermentace,
tj. přeměna hrubé kyseliny jablečné na hladší kyselinu mléčnou díky speciálním bakteriím.

Školení vína je souhrnný název pro manipulaci s vínem od dokvašení až přípravu k lahvování. Je to
zejména stáčení (oddělení vína od usazených kvasnic), přídavek oxidu siřičitého k zabránění
oxidace, čiření (odstranění bílkovin a dalších nežádoucích látek) a filtrace.


Protokol:

Určete, zda neznámý vzorek vína je oranžové nebo růžové víno.

Doplňte zvolené parametry:

Analyt                                 ____________________

Kolona                                ____________________

Rozpouštědla                      ____________________

Detekce                              ____________________

Příprava vzorku                   ____________________

Určený druh vína                  ____________________