Spektrofotometrické stanovení standardního redoxního potenciálu cytochromu c TEORETICKÁ ČÁST Redoxní potenciál V biochemii hrají významnou roli oxidačně-redukční (redoxní) reakce, spojené s přenosem elektronů mezi redoxními páry. Reakci redoxního páru 1 (Ox[1]/Red[1]) s redoxním párem 2 (Ox[2]/Red[2]) lze schematicky psát jako: Ox[1] + Red[2] ↔ Red[1] + Ox[2] (1) O termodynamicky možném směru toku elektronů rozhodují aktuální hodnoty tzv. redoxních potenciálů E obou párů. Při průběhu reakce (1) zleva doprava je E[1] > E[2] a pro opačný směr E[1] < E[2]. Jinak řečeno, akceptorový pár má vyšší redoxní potenciál než pár donorový; elektron se mezi redoxními páry přesouvá ve směru vzrůstu redoxní potenciálu. Nachází-li se reakce (1) v rovnováze, platí E[1] = E[2]. Obr. 1. Měření redoxního potenciálu E pomocí standardní vodíkové elektrody. Využívá se voltmetru s vysokým vnitřním odporem, aby byl zajištěn bezproudový stav. Roztoky v obou částech jsou vodivě spojeny solným můstkem. Pro [Ox]=[Red] dostaneme standardní redoxní potenciál E^0. V praxi se obtížně realizovatelná vodíková elektroda nahrazuje jinými referenčními elektrodami se známým potenciálem. Redoxní potenciál E je definován jako rozdíl elektrického potenciálu (tj. napětí) mezi inertní sběrnou elektrodou, která v rovnováze s danými koncentracemi [Ox] a [Red], a standardní vodíkovou elektrodou, obsahující standardní koncentrace redoxního páru 2H^+/H[2] (obr. 1). Vztah mezi E a poměrem [Ox]/[Red] vyjadřuje Nernstova rovnice Obsahuje dva základní parametry: E^0,^ standardní redoxní potenciál, a n, počet elektronů potřebných k redukci Ox na Red. Změříme-li hodnoty poměru [Ox]/[Red] při různých hodnotách E a sestrojíme-li graf závislosti E na ln([Ox]/[Red]), dostaneme podle (2) přímku se směrnicí RT/nF (z níž lze určit n) a s úsekem na svislé ose rovným E^0. V biochemii se často užívá její zjednodušená forma s dekadickým logaritmem, definovaná pro 25 °C (2) Jsou-li v roztoku v rovnováze dva redoxní páry, z rovnosti E[1] = E[2] plyne a po úpravě: Závislost ln([Ox[1]]/[Red[1]]) na ln([Ox[2]]/[Red[2]]) má tedy podobu přímky se směrnicí n[1]/n[2] a úsekem (n[1]F/RT)(E[2]^0- E[1]^0). Známe-li hodnoty E[2]^0 a n[2], můžeme určit E[1]^0 a n[1]. Zjednodušená rovnice pro 25 °C nabývá obdobně tvaru (3) Spektrofotometrické stanovení poměrů [Ox]/[Red] U mnohých biochemicky významných redoxaktivních látek lze aktuální poměry [Ox]/[Red] zjišťovat spektrofotometricky. Základním předpokladem je, že obě redoxní formy rozdílnou měrou absorbují elektromagnetické záření. Je-li v roztoku pouze jedna absorbující redoxaktivní látka, podle Lambertova-Beerova zákona při vlnové délce λ pro její absorbanci A(λ) platí (4) kde ε[ox](λ) a ε[red](λ) jsou molární dekadické absorpční koeficienty oxidované a redukované formy (závislé na λ) a d délka optické dráhy v roztoku. Celková (analytická) koncentrace c redoxaktivní látky se při redoxní reakci nemění a je rovna součtu koncentrací obou forem, tedy (5) Je-li látka úplně oxidována (tj. [Red]=0) resp. redukována (tj. [Ox]=0), dostáváme absorbance A[ox](λ) = ε[ox](λ)·d·c resp. A[red](λ) = ε[red](λ)·d·c. Po jejich zavedení namísto absorpčních koeficientů vztah (4) přechází na tvar (6) (6) Podíly [Ox]/c a [Red]/c jsou zřejmě molové zlomky x[ox] a x[red] oxidované a redukované formy; jejich součet se podle (5) rovná 1. Při respektování této relace lze z (6) odvodit (7) a konečně též (8) Známe-li tedy absorbance plně oxidovaného a plně redukovaného vzorku při vlnové délce λ, můžeme po změření A(λ) vypočítat dosazením do vztahu (8) aktuální podíl koncentrace oxidované a redukované formy. Není přitom ani nutná znalost celkové koncentrace c. Jak se změní situace, jestliže se v roztoku nacházejí dva absorbující redoxní páry, Ox[1]/Red[1] a Ox[2]/Red[2]? Místo vztahu (4) teď máme jeho rozšíření na čtyři komponenty jedna látková bilance (5) je nahrazena dvěma bilancemi (9) [ ] (9) a (6) dostává následující podobu (10) Je důležité si uvědomit, co přesně znamenají absorbance na pravé straně vztahu (10). Například A[ox1](λ) získáme pro zcela oxidovaný vzorek, který obsahuje pouze redoxní pár 1 v koncentraci c[1]; redoxní pár 2 není přítomen. Analýza směsi dvou redoxních párů podle (10) tudíž vyžaduje, abychom měli k dispozici i data pro separátní oxidované a redukované standardy: 1) [Ox[1]] = c[1] a c[2] = 0; 2) [Ox[2]] = c[2 ]a c[1] = 0; 3) [Red[1]] = c[1] a c[2] = 0; 4) [Red[2]] = c[2] a c[1] = 0. V případě jednoho redoxního páru v zásadě stačila jedna rovnice (6) spolu s látkovou bilancí (5) k charakterizaci redoxního stavu systému. Naproti tomu zde jedna rovnice (10) nestačí, protože ze čtyř obsažených molových zlomků x[ox1] = [Ox[1]]/c[1], x[red1] = [Red[1]]/c[1], x[ox2] = [Ox[2]]/c[2] a x[red2] = [Red[2]]/c[2] jsou v důsledku (9) nezávislé dva. Východisko spočívá ve změření vzorku pří více vlnových délkách (λ[1] , … , λ[k]). Místo (10) pak máme soustavu k lineárních rovnic o čtyřech neznámých molových zlomcích redoxních forem: (11) nebo ve zkráceném zápisu A x = a (11´) A je matice typu k x 4, obsahující absorbance standardů, x je čtyřrozměrný vektor molových zlomků a a je k-rozměrný vektor absorbancí směsi. Pro k > 4 se jedná o tzv. přeurčenou soustavu, která obecně nemá řešení. Můžeme však hledat vektor x takový, aby velikost vektoru A x - a nabyla minimální hodnoty. V české verzi Excelu lze k tomuto účelu použít maticové funkce LINREGRESE(pole_y;[pole_x];[b];[stat]) kde pole_y je svislá oblast obsahující složky vektoru a, pole_x je oblast obsahující prvky matice A; pro argumenty b a stat se volí logická hodnota 0 (NEPRAVDA). Výsledný vektor x se nachází ve vodorovné oblasti, přičemž jeho složky jsou v buňkách umístěny v opačném pořadí, tedy (x[red2], x[ox2], x[red1], x[ox1]). Do svislé podoby ho lze převést funkcí TRANSPOZICE. Ukázka výpočtu je na obr. 2. Obr. 2. Ukázka výpočtu molových zlomků redoxních forem z absorbancí standardů a směsi za použití Excelu. Cytochrom c Cytochrom c studovaný v naší úloze se běžně izoluje z hovězího srdce. Tento malý (M[r] = 12 400) a dobře rozpustný protein je tvořen jedním polypeptidovým řetězcem se 104 aminokyselinovými zbytky, který nese kovalentně vázaný hem (obr. 3). Obr. 3. Vazba hemu na polypeptidový řetězec v cytochromu c. Hem je vázán kovalentně dvěma thioetherovými můstky, jež vznikly adicí thiolových skupin dvou zbytků cysteinu na vinyly v polohách 2 a 4 tetrapyrrolového kruhu. Kromě toho síra methioninu a dusík imidazolového kruhu histidinu vystupují jako další dva ligandy Fe hemu. > Cytochrom c se nachází v prostoru mezi vnitřní a vnější membránou mitochondrií, kde díky své schopnosti přecházet mezi oxidovanou a redukovanou formou působí jako přenašeč elektronů v respiračním řetězci. Pokud se z mitochondrie uvolní do cytoplasmy buňky, může se vázat na zde přítomný protein Apaf-1 (apoptotic protease activating factor 1). To vede ke vzniku oligomerního apoptosomu, aktivaci prokaspasy 9 a dalších enzymů účastnících se apoptosy (programované buněčné smrti). Přítomnost hemové skupiny způsobuje barevnost proteinu. Spektrum roztoku jeho redukované formy vykazuje ve viditelné oblasti tři hlavní absorpční pásy s maximy při vlnových délkách 416 nm (γ; tzv. Soretův pás), 520 nm (β) a 550 nm (α). Při oxidaci se spektrum mění zejména v oblasti vyšších vlnových délek. Používané metody Samotný standardní redoxní potenciál cytochromu c budeme stanovovat dvěma metodami. Obě využívají ekvilibrace redoxního páru cyt c[ox]/cyt c[red] s druhým (pomocným) redoxním párem a platnosti vztahu (3). 1) Metoda redoxního pufru Při tomto měření poslouží jako pomocný redoxní pár směs hexakyanoželezitanu („ferrikyanidu“) a hexakyanoželeznatanu („ferrokyanidu“). Jejich vzájemná přeměna probíhá jednoelektronově (Fe(CN)[6]^3- + e^- ↔ Fe(CN)[6]^4-), standardní redoxní potenciál je roven 0,430 V. Pokud jsou oba ionty přítomny ve výrazném stechiometrickém nadbytku vzhledem k cytochromu c, jejich koncentrace se během reakce s ním prakticky nezmění; podle Nernstovy rovnice (2) se nemění ani redoxní potenciál. Pár hexakyanoželezitan/hexakyanoželeznatan tedy působí jako redoxní pufr, který udržuje konstantní redoxní potenciál a „vnutí“ jej páru cyt c[ox]/cyt c[red]. (Srovnej analogické chování směsi báze s její protonovanou konjugovanou kyselinou, pufrující pH.) Abychom mohli aplikovat vztah (3), je zapotřebí pro několik známých výchozích poměrů [hexakyanoželezitan]/[hexakyanoželeznatan] (redoxní pár č. 2) stanovit odpovídající rovnovážné poměry [cyt c[ox]]/[cyt c[red]] (redoxní pár č. 1). Využijeme k tomu měření absorbance v oblasti maxima α pásu (550 nm), neboť zde ferrikyanid ani ferrokyanid významně neabsorbují. Poměry [cyt c[ox]]/[cyt c[red]] vypočteme pomocí vztahu (8). 2) Metoda redoxního indikátoru Zde bude roztok kromě cytochromu c obsahovat redoxní indikátor 2,6-dichlorfenolindofenol (DCIP) (obr. 4), jehož standardní redoxní potenciál má podle literatury hodnotu 0,217 V. Obr. 4. Struktura 2,6-dichlorfenolindofenolu (DCIP) Obě látky jsou redukovatelné enzymem xanthinoxidasou během katalytické konverze xanthinu na kyselinu močovou za anaerobních podmínek. Po nastartování enzymové reakce a redukce obou látek postupně klesá redoxní potenciál ve směsi, což se projevuje změnami poměrů koncentrací oxidovaných a redukovaných forem cytochromu c i DCIP. Analýzou opakovaně zaznamenávaných absorpčních spekter reakční směsi lze oba tyto poměry určit. Jak bylo zdůvodněno výše, potřebujeme k tomu spektra oxidovaných a redukovaných standardů, která změříme separátně. PRAKTICKÁ ČÁST 1) Potenciometrické ověření platnosti Nerstovy rovnice Přístroje: Automatické pipety 1-10 μl, 5-20 μl, 100-1000 μl, 1000-5000 μl, pipetovací špičky Voltmetr MT 100 Materiál: Kádinky 5ml, 100ml Termostatovaná 40ml kádinka Pt elektroda Referenční kalomelová/AgCl elektroda Magnetické míchadlo Chemikálie: 5 ml 0,1 M K[4][Fe(CN)[6]] 5 ml 0,1 M K[3][Fe(CN)[6]] 100 ml 0,1 M sodno-fosfátového pufru (pH 7,0) Postup: Do kádinky temperované na 25 °C napipetujeme 27 ml fosfátového pufru, 3 ml roztoku 0,1 M K[4][Fe(CN)[6]] a 7,5 μl 0,1 M K[3][Fe(CN)[6]]. Do roztoku ponoříme pracovní platinovou elektrodu a referenční elektrodu. Po ustálení signálu zaznamenáme hodnotu elektrochemického napětí. Následně přidáváme roztok 0,1 M K[3][Fe(CN)[6]] jak je naznačeno ve vzorové tabulce a zaznamenáváme hodnoty potenciálu. Roztoky E (V) log([ferrikyanid]/[ferrokyanid]) ferrokyanid + 7,5 μl ferrikyanidu + 7,5 μl ferrikyanidu + 7,5 μl ferrikyanidu + 7,5 μl ferrikyanidu + 7,5 μl ferrikyanidu + 7,5 μl ferrikyanidu + 15 μl ferrikyanidu + 15 μl ferrikyanidu + 15 μl ferrikyanidu Vyhodnocení: Koncentrace, resp. poměry oxidované a redukované formy hexakyanoželezitanu a hexakyanoželeznatanu, jsou známy a lze je spočítat z koncentrací zásobních roztoků. Vyneseme graf závislosti E na log([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]]), body proložíme lineární regresní přímkou a uvedeme v protokolu vedle grafu i rovnici této přímky. Úpravou rovnice (2) vypočítáme standardní redoxní potenciál páru hexakyanoželezitan a hexakyanoželeznatan a srovnáme s tabelovanou hodnotou: E[7]^0 ([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]) = +0,43 V; n = 1. Protokol: Tabulka s naměřenými elektrochemickými potenciály páru hexakyanoželezitan/hexakyanoželeznatan a vypočítané logaritmy poměru koncentrací tohoto redoxního páru. Graf závislosti E na log([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]]). Výpočet standardního redoxního potenciálu hexakyanoželezitanu/hexakyanoželeznatanu a srovnání s tabelovanými hodnotami. 2) Metoda redoxního pufru Přístroje: Automatické pipety 1-10 μl, 5-20 μl, 100-1000 μl, 1000-5000 μl, plastové špičky Spektrofotometr UV-VIS Ultrospec 2000 Materiál: Plastové míchadlo 3ml spektrofotometrické plastové kyvety Chemikálie: 0,1 M K[4][Fe(CN)[6]] (z předchozí úlohy) 0,1 M K[3][Fe(CN)[6]] (z předchozí úlohy) 0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0) (z předchozí úlohy) 10 ml 0,5 mg/ml cytochromu c (cyt c) v 0,1 M sodno-fosfátovém pufru (pH 7,0) Na[2]S[2]O[4 ](krystalky) Postup: Pracovní prostor spektrofotometru necháme temperovat na teplotu 25 °C. Připravíme 4 kyvety. Slepý vzorek (blank) bude tvořit 3000 μl ml 0,1 fosfátového pufru. Zbývající 3 pracovní roztoky se připraví smícháním 2700 μl ml roztoku cytochromu c buď s 300 μl ml 0,1 M fosfátového pufru a dosypáním několika krystalků Na[2]S[2]O[4] (redukovaný standard), nebo s 300 μl 0,1 M K[3][Fe(CN)[6]] (oxidovaný standard), nebo s 300 μl roztoku 0,1 M K[4][Fe(CN)[6]]. K tomuto poslednímu roztoku budeme postupně přidávat roztok z předchozí kyvety s K[3][Fe(CN)[6]] jak je naznačeno ve vzorové tabulce. Měříme absorbance při 550 nm. Absorbance budou zaznamenávány do tabulky dle vzoru. Roztoky A[550] log([cyt c[ox]]/[cyt c[red]]) log([ferri]/[ferro]) cyt c + Na[2]S[2]O[4 ]– kyveta 1 cyt c + ferri – kyveta 2 cyt c + ferro – kyveta 3 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 7,5 μl roztoku z kyvety 2 + 15 μl roztoku z kyvety 2 + 15 μl roztoku z kyvety 2 + 15 μl roztoku z kyvety 2 Vyhodnocení: Poměry [cyt c[ox]]/[cyt c[red]] vypočteme pomocí rovnice (8). Koncentrace, resp. poměry oxidované a redukované formy hexakyanoželezitanu a hexakyanoželeznatanu, jsou známy a lze je spočítat z koncentrací zásobních roztoků. Vyneseme graf závislosti log([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]]) na log([cyt c[ox]]/[cyt c[red]]), body proložíme lineární regresní přímkou a uvedeme v protokolu vedle grafu i rovnici této přímky. Úpravou rovnice 3 vypočítáme standardní redoxní potenciál redoxního páru cyt c[ox]/cyt c[red], když je známo, že E[7]^0 ([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]) = +0,43 V a n = 1. Protokol: Tabulka s naměřenými absorbancemi a vypočítanými dekadickými logaritmy poměru koncentrací oxidovaných a redukovaných komponent v reakční směsi. Graf závislosti log([K[3][Fe(CN)[6]]]/[K[4][Fe(CN)[6]]]) na log([cyt c[ox]]/[cyt c[red]]). Výpočet standardního redoxního potenciálu cyt c a počtu přenášených elektronů a srovnání s tabelovanými hodnotami. 3) Metoda redoxního indikátoru Přístroje: Automatické pipety 1-10 μl, 5-20 μl, 100-1000 μl, 1000-5000 μl, plastové špičky Hamiltonova jehla 1-5 μl Spektrofotometr UV-VIS Ultrospec 2000 Materiál: Parafilm 1ml spektrofotometrické plastové kyvety s gumovou zátkou Chemikálie: 0,1 M sodno-fosfátový pufr (pH 7,0) (z předchozí úlohy) Na[2]S[2]O[4] (krystalky) 0,01 M cyt c [ ] 0,01 M DCIP (dichlorfenol-indofenol; 2,6-dichlor-N-(4-hydroxyfenyl)-1,4-benzochinonimin) 0,01 M xanthin – 17,4 mg xanthinu rozpustíme v 0,1 ml 1M NaOH a následně přidáme 9,9 ml vody do výsledného objemu 10 ml 10 mM benzylviologen (pomocný přenašeč elektronů od enzymu) Xanthinoxidasa (mléčná) Argon v tlakové lahvi Návod k měření a zaznamenání spekter: 1. Zapneme hlavní vypínač na počítači a spektrofotometru UV-VIS Ultrospec 2000. 2. Plocha ® SWIFT Bio-ws ® File ® Open ® Parameters ® redoxtit.ws1 3. Run ® Standard ® Samples = 10 Þ OK ® File already exists! Overwrite? Þ Yes ® Load Reference Þ OK ® Load sample 1–10 Þ OK v intervalu po 3 minutách 5. Post-Run ® Data points ® recorded spectrum 0–9 (v případě standardů 0–3) Postup: Kyvetový prostor spektrofotometru ponecháme temperovaný na 25 °C. Do 1ml kyvety odměříme 888 μl 0,1 M sodno-fosfátového pufru, 4 μl 0,01 M cyt c, 16 μl 0,01 M DCIP, 1 μl benzylviologenu a 90 μl 0,01 M xanthinu. Horní vstup kyvety zavřeme gumovou zátkou a utěsníme omotáním parafilmem. Necháme roztok probublávat argonem po dobu 10 minut. Mezitím si připravíme blank (1 ml fosfátového pufru) a 4 standardy pro oxidované a redukované formy obou redoxaktivních látek (viz tabulka). Odečteme absorbance pro minimálně 6 odlišných vhodně vybraných vlnových délek (např. 450, 535, 550, 565, 600, 635 nm). pufr (μl) xanthin (μl) cyt c (μl) DCIP (μl) krystalky Na[2]S[2]O[4] cyt c ox. 906 90 4 - - DCIP ox. 894 90 - 16 - cyt c red. 906 90 4 - ano DCIP red. 894 90 - 16 ano Ve spektrometru změříme blank jako referenci a poté do přístroje přeneseme kyvetu se směsí probublanou argonem. Následně zaznamenáme spektrum tohoto roztoku jako spektrum číslo 1 v čase 0 min. Poté nastartujeme redukci cyt c a DCIP přidáním 1 μl roztoku xanthinoxidasy Hamiltonovou jehlou. Postupně v časových intervalech po 1 minutě zaznamenáme 9 dalších spekter. Odečteme absorbance pro shodné vlnové délky, jaké byly použity u standardů. Vyhodnocení: Do tabulky uvedeme absorbance pro vybrané vlnové délky oxidované a redukované formy cyt c a DCIP, absorbance směsi, v které probíhala redoxní reakce a molové zlomky cyt c a DCIP vypočtené dle návodu v obr. 2 v programu Microsoft Excel. Dosazením do neupravené rovnice 3 vypočítáme standardní redoxní potenciál cyt c. E[7]^0 (DCIP) je +0,217 V pro dvouelektronový přenos (n = 2). Protokol: Tabulka s naměřenými absorbancemi pro vybrané vlnové délky a vypočítanými molárními zlomky pro DCIP a cyt c. Výpočet standardního redoxního potenciálu cyt c a srovnání s tabelovanými hodnotami a hodnotou získanou metodou redoxního pufru.