Proteomika Proteomické aplikace CG010 Zbyněk Zdráhal Výzkumná skupina Proteomika, CEITEC-MU Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU NCBR, PřF MU zdrahal@sci.muni.cz Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Národní centrum pro výzkum biomolekul Přírodovědecká fakulta MU 1 Obsah obrázku text, interiér, police, kancelář Popis byl vytvořen automaticky http://skypaper.cz/image/3074-ceitec.jpg Zbyněk Zdráhal Phone: +420 777 926 602 E-mail: zbynek.zdrahal@ceitec.muni.cz CF: www.ceitec.eu/proteomics-core-facility/cf95 RG: www.ceitec.cz/proteomika-zbynek-zdrahal/rg49 Logo Obsah obrázku budova, vsedě, stůl Popis byl vytvořen automaticky CG010 Proteomika - Proč? * z každého genu může vzniknout několik proteinů, resp. jejich forem, které nelze indikovat na základě analýzy DNA resp. mRNA * neexistuje přímá korelace mezi obsahem mRNA a výsledným obsahem proteinů * * funkční význam proteinu závisí velmi často na jeho interakci s jinými proteiny či DNA/RNA * * na úrovni proteinů lze zachytit epigenetické faktory regulace exprese genu * 3 Náročnost analýzy proteomu * proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat až 1 000 000 proteinů včetně všech forem (izoformy, PTMs) - proteoforms (Nature Methods, 10 (3), 186 (2013)) ~ 10 000 exprimovaných genů v buňce v každém okamžiku * široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA * široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností * analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů MM900282753[1] CG010 4 Přehled vybraných metod pro studium proteinů Charakterizace komplexních směsí proteinů •Hmotnostní spektrometrie včetně přípravy vzorku a separace • Proteinové čipy Struktura proteinů •Cirkulární dichroismus •Nukleární magnetická resonance • Rentgenová krystalografie • Kryoelektronová mikroskopie Interakce proteinů •Dvouhybridní systém (Y2H) •Surface plasmon resonance •Mikroskopické techniky Detekce/lokalizace proteinů • Imunochemické metody (westernový přenos, ELISA) •Mikroskopické techniky CG010 5 Obsah obrázku text, patro, interiér, obchod Popis byl vytvořen automaticky Proteomické aplikace CG010 Charakterizace kvalitativních a kvantitativních změn celého proteomu Ultraflex_III * Hmotnostní spektrometrie (MS) nejrozšířenější technika pro charakterizaci proteinů a jejich modifikací (na základě primární struktury) 6 Nalezený obrázek pro Unattainable Cartoon Image Obsah obrázku text, interiér, police, kancelář Popis byl vytvořen automaticky >gi|3157976|gb|AAC17470.1| alpha actinin [Homo sapiens] MVDYHAANQSYQYGPSSAAMAWRRGSMGDYMAQEDDWDRDLLLDPAWEKQQRKTFTAWSNSHLRKAGTQI ENIDEDFRDGLKLMLLLEVISGERLPKPERGKMRVHKINNVNKALDFIASKGIKLDFHRAEEIVDGNAKM TLGMIWTIILRFAIQDISVEETSAKEGLLLWCQRKTAPYKNVNVQNFHISWKDGLAFNALIHRHRPELIE YDKLRKDDPVTNLNNAFEVAEKYLDIPKMLDAEDIVNTARPDEKAIMTYVSSFYHAFSGAQKAETETAAN RICKVLAVNQENCSTSMEDYEKLASDLLEWIRRTIPWLEDRVPQKTIQEMQQKLEDFRDYRRVHKPPKVQ EKCQLEINFNSVQTKLRLSNRPAFMPSEGKMVSDINNGWQHLEQAEKGYEEWLLNEIRRLERLDHLAEKF RQKASIHEAWTDGKEAMLKHRDYETATLSDIKALIRKHEAFESDLAAHQDRVEQIAASAQELNELDYYDS HNVNTRCQKICDQWDALGSLTHSRREALEKTEKQLEAIIDQLHLEYAKPAAPFNNWMESAMEDLQDMFIV HTIEEIEGLISAHDQFKSTLPDADREREAILHPQGGQRIAESNHIKLSGSNPYTTVTPQIINSKWEKVQQ LVPKRDHALLEEQSKQQQSNEHLRRQFASQANVVGPWIQTKMEEIAISIEMNGTLEDQLSHLKQYERSIV DYKPNLDLLEQQHQLIQEALIFDNKHTNYTMEHIRVGWEQLLTTIARTINEVENQILTRDAKGISQEQMQ EFRASFNHFDKDHGGALGRGVQGLPHQPGLRRGERPAGEAEFNRIMSLVDPNHSGLVTFQAFIDFMSRET TDTDTADQVITSFKVLAGDKNFITAEELRRELPPDQAEYCIARMAPYQGPDGVRGALDYKSFSTALYGES DL Western Blotting vs Hmotnostní spektrometrie identifikace „neznámých“ proteinů jistota identifikace ~ citlivost instrumentální náročnost CG010 7 CG010 •kvantifikace proteinů (pomocí „izotopických“ značek , label-free, MRM) •identifikace proteinů (identifikace, proteinové komplexy, de novo sekvenování) •analýza intaktních molekul (MW,kontrola produktů reakce, MALDI-MS profilování) •charakterizace proteinových modifikací (fosforylace, acetylace,ubikvitinace aj. ) Sphos m/z D m/z = 167 Hmotnostní spektrometrie v proteomice •charakterizace 3D struktury proteinů •MALDI-MS zobrazování 8 Differenční (expresní) proteomika Kvalitativní a kvantitativní srovnání proteomů - určení změn v regulaci proteinů a jejich forem (PTMs), které nastaly v důsledku vnitřních či vnějších podnětů kontrola stres Rhodotorula glutinis CG010 9 Cílená proteomika Sledování kvantitativních změn vybraných proteinů (např. biomarkerů) ve vzorcích. interní std real LC-MS/MS (MRM, PRM) MS MS/MS real is Stanovení enterotoxinu (S. aureus) CG010 10 Studium interakcí proteinů a jejich funkční význam. - interakce mezi proteiny - vznik a architektura proteinových komplexů - interakce proteinů s jinými molekulami (RNA, DNA metabolity aj.) Funkční proteomika K.G. Guruharsha et al., Cell, 147, 690–703 (2011) L. Kozakova et al., Cell Cycle, 14, 920-930 (2015) CG010 11 Studium vyšších úrovní proteinové struktury (terciární, kvarterní) a vztahu struktury k funkci proteinu. Strukturní proteomika http://swissmodel.expasy.org/course/gifs/1bmf.gif Strukturu formují různé typy vazeb – iontové interakce, vodíkové můstky, van der Waals síly nebo disulfidické můstky. CG010 12 > Snímek11 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ab/Zv%C3%ADkov_4.jpg 13 Proteomické aplikace využívající „pouze“ analýzy intaktních molekul CG010 14 CG010 Kontrola produktů syntézy 15 CG010 MW(adukt) = 250 Počet navázaných aduktů N = 12 20000 40000 60000 80000 100000 120000 140000 m/z 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 a.i. /D=/Data/Zbynek/020205/BSA/2Lin/pdata/1 Administrator Fri Feb 22 13:59:04 2002 mass diff. cca 3 kDa MW(adukt) = 250 Počet navázaných aduktů N = 12 Kontrola výsledku reakce 16 CG010 vzorek extrakce peptidů/proteinů MALDI MS (3 – 20 kDa) PCA analýza databáze MALDI MS profilů BD18215_ MALDI-MS profilování * identifikace mikroorganizmů * třídění vzorků (kontrola kvality potravin) * diagnostika chorob 17 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. 5000 7000 9000 11000 m/z 0 500 1000 1500 2000 2500 a.i. Alcaligenes faecalis Sphingomonas paucimobilis Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS CG010 18 CG010 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Acinetobacter nosocomialis NIPH 106 Acinetobacter nosocomialis NIPH 97 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2134 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2812 Acinetobacter nosocomialis NIPH 386 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2265 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2120 Acinetobacter nosocomialis NIPH 12 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2119T Acinetobacter nosocomialis NIPH 523 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2249 Acinetobacter pitii NIPH 14 Acinetobacter pitii NIPH 95 Acinetobacter pitii NIPH 336 Acinetobacter pitii NIPH 2256 Acinetobacter pitii NIPH 519T Acinetobacter pitii NIPH 76 Acinetobacter pitii NIPH 3678 Acinetobacter pitii NIPH 3870 Acinetobacter pitii NIPH 2133 Acinetobacter pitii NIPH 2258 Acinetobacter pitii NIPH 789 Acinetobacter baumannii NIPH 501T II Acinetobacter baumannii NIPH 501T III Acinetobacter baumannii NIPH 146 Acinetobacter baumannii NIPH 601 Acinetobacter baumannii NIPH 80 Acinetobacter baumannii NIPH 190 Acinetobacter baumannii NIPH 67 Acinetobacter baumannii NIPH 1669 Acinetobacter baumannii NIPH 70 Acinetobacter baumannii NIPH 2264 Acinetobacter baumannii NIPH 410 Acinetobacter baumannii NIPH 615 Acinetobacter baumannii NIPH 527 Acinetobacter baumannii NIPH 528 Acinetobacter baumannii NIPH 501T I Acinetobacter baumannii NIPH 1734 Acinetobacter baumannii NIPH 201 Acinetobacter baumannii NIPH 329 Acinetobacter baumannii NIPH 335 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 13 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2253 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2254 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2706 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2814 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2262 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3680 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3804 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2155 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2245T Distance Level 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Acinetobacter nosocomialis NIPH 106 Acinetobacter nosocomialis NIPH 97 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2134 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2812 Acinetobacter nosocomialis NIPH 386 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2265 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2120 Acinetobacter nosocomialis NIPH 12 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2119T Acinetobacter nosocomialis NIPH 523 Acinetobacter nosocomialis NIPH 2249 Acinetobacter pitii NIPH 14 Acinetobacter pitii NIPH 95 Acinetobacter pitii NIPH 336 Acinetobacter pitii NIPH 2256 Acinetobacter pitii NIPH 519T Acinetobacter pitii NIPH 76 Acinetobacter pitii NIPH 3678 Acinetobacter pitii NIPH 3870 Acinetobacter pitii NIPH 2133 Acinetobacter pitii NIPH 2258 Acinetobacter pitii NIPH 789 Acinetobacter baumannii NIPH 501T II Acinetobacter baumannii NIPH 501T III Acinetobacter baumannii NIPH 146 Acinetobacter baumannii NIPH 601 Acinetobacter baumannii NIPH 80 Acinetobacter baumannii NIPH 190 Acinetobacter baumannii NIPH 67 Acinetobacter baumannii NIPH 1669 Acinetobacter baumannii NIPH 70 Acinetobacter baumannii NIPH 2264 Acinetobacter baumannii NIPH 410 Acinetobacter baumannii NIPH 615 Acinetobacter baumannii NIPH 527 Acinetobacter baumannii NIPH 528 Acinetobacter baumannii NIPH 501T I Acinetobacter baumannii NIPH 1734 Acinetobacter baumannii NIPH 201 Acinetobacter baumannii NIPH 329 Acinetobacter baumannii NIPH 335 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 13 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2253 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2254 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2706 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2814 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2262 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3680 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 3804 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2155 Acinetobacter calcoaceticus NIPH 2245T Distance Level spolehlivá diferenciace na úrovni druhů (u většiny rodů) Identifikace mikroorganizmů pomocí MALDI-MS identifikace na základě srovnání naměřeného profilu s profilem z databáze * uznaná metoda v klinické praxi Šedo O. et al., Syst. Appl. Microbiol., 36 (8), 572– 578 (2013) 19 20 cooperation with prof. Pekar, FS MU MALDI-MS profiling of spider venoms •evolution of food specialisation in spiders •species adaptations •ant-eating spiders Pekár S. et al., J. Anim. Ecol., 81 (4), 838-848 (2012) Bočánek O. et al., Toxicon, 133, 18-25 (2017) Pekár S. et al. Mol. Ecol., 27 (4), 1053-1064 (2018) Z. merlijni CG010 Analýza profilů –včasná detekce chorob (peptide profiling, pattern profiling) BD18215_ MALDI MS, SELDI MS (3 – 20 kDa) klastrová analýza žádná či minimální úprava vzorku (ionex, IMAC, afinitní sorbent) CG010 21 J. LaBaer et al., J. Proteome Res., 4 (4) 1053-1059 (2005). CG010 22 Využití MS pro vyhledávání biomarkerů Pattern profiling přímá MS analýza vzorků (MALDI MS, SELDI MS) srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného (bez identifikace, statistická analýza) včasná diagnostika chorob Identifikace biomarkerů Separace LC srovnávání peptidového (proteinového) složení vzorku „zdravého“ a nemocného (statisticky relevantni soubory) MS/MS identifikace rozdílových proteinů specifická protilátka Imunodetekce MS/Protein arrays CG010 23 Glycan profiling and structural analysis of glycans NSCLC - Bronchoalveolar Carcinoma Bronchoalveolar Adenocarcinoma Large Cell Carcinoma 0 1 2 3 4 4 x10 2000 2500 3000 3500 4000 m/z 0 2 4 6 4 x10 0 0.5 1.0 1.5 4 x10 3x 3x 4x 4x 6x 5x 5x 3x 6x 4x 5x 3x 5x 3x 4x 3x 4x 5x 3x GlcNAc; Fuc Gal; Man; MALDI-TOF-MS spectra of N-glycans after desialylation 24 Lattová E., J. Proteome Res., 15 (8), 2777-2786 (2016) CG010 > Snímek27 https://encrypted-tbn1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRScQs6mUqMmXlk5Ta3Bs2Xmj6fXfPwEPODoIEj-pnF0kF KWqdrsg 25 Proteomické aplikace využívající „pouze“ identifikace proteinů CG010 26 izolace proteinů proteinový extrakt (proteolytické štěpení) vícerozměrná frakcionace/separace gelová elektroforéza, kapalinová chromatografie kombinace separačních principů proteinové (peptidové) frakce MALDI-MS/MS LC-ESI-MS/MS identifikované proteiny Obecné schéma proteomického experimentu Analýza komplexních směsí CG010 zachování stavu vzorku zjednodušení komplexní směsi před vlastní detekcí 27 CG010 Separace proteinových izolátů na úrovni intaktních proteinů peptides HPLC - UV protein fractions 1D (2D) gel electrophoresis IEF (in-solution, in-gel) peptides peptides protein fractions in-solution digestion in-gel digestion of individual bands in-solution/ in-gel digestion 28 Separace proteinových izolátů na úrovni peptidů CG010 protein mixture In-solution digestion peptides 1D (2D) HPLC – on-line/off-line IEF fractionation LC-MALDI vždy MS/MS analýza shotgun proteomics MuDPIT (Multi-Dimensional Protein Identification Technology) 29 CG010 Charakterizace proteomu Eyer L. et al.,Proteomics, 7 (1), 64-72 (2007) proteom stafylokokového fága 812, spolupráce s prof. Doškářem (ÚEB PřF MU) identifikace proteinů ve spotech, MS/MS techniky fag 812-Ag 2006-08-18 30 A draft map of the human proteome Min-Sik Kim et al., Nature 509, 575-581 (2014), doi:10.1038/nature13302 293 000 non redundant peptides corresponding to proteins encoded by 17294 genes CG010 31 8M slina pH3,9-5,1 13-2-09 CG010 Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů Obp3A Obp3B Obp2 Myodes glareolus * sliny * 2D gelová elektroforéza * MS/MS vybraných spotů Stopková R., Zdráhal Z., Ryba Š. et al, BMC Genomics 2010, 11:45 spolupráce s PřF UK Praha * není znám genom * nejsou protilátky 32 m/z 3079.4 DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR MALDI-MS/MS původní sekvence - QAELEGKWVTTAIAADNIDTIEEEGPMR (OBP3) DAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR HAELEGTWYTTAIAADNVDTIEEEGPLR Ověření sekvence a určení izoforem OBP proteinů MALDI-MS/MS a LC-MS/MS manuální interpretace spekter CG010 33 * > 80% proteinů je funkčních až po začlenění do komplexu * ~ 10000 typů interakcí Aloy P., Russell R. B.: Nat. Biotechnol. 22 (10), 1317-1321 (2004) Charakterizace proteinových komplexů funkční proteomika purifikace komplexu vzorek (buněčná kultura) MS/MS analýza validace interakcí * vyhledávání nových interakcí * možnost studia „celého“ komplexu CG010 34 T. Köcher, G. Superti-Furga: Nat. Methods, 4(10), 807-815 (2007). Purifikace proteinových komplexů in vivo exprese proteinu se značkou vysoký stupeň čistoty komplexu ztráta slabě vázaných členů komplexu CG010 35 Gavin A.-C. et al.: Nature, 440, 631-636 (2006). • identifikace jednotlivých členů komplexu včetně posttranslačních modifikací • validace interakčních partnerů (odlišení nespecifických interakcí) • určení poměrů jednotlivých členů komplexu (stechiometrie) • určení prostorové struktury komplexu (cross-linking) Možnosti MS v analýze komplexů: CG010 36 > Snímek13 https://encrypted-tbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcRP_qhRoMQTDXD_QaxmH5Ag8-sHdiXCMwjor2j8CFvPxPM e5UFS 37 Charakterizace posttranslačních modifikací 38 ...Post-translational modifications (PTMs) occur on nearly all proteins. Many domains within proteins are modified on multiple amino acid sidechains by diverse enzymes to create a myriad of possible protein species. How these combinations of PTMs lead to distinct biological outcomes is only beginning to be understood... A. P. Lothrop, M. P. Torres, S. M. Fuchs, FEBS Letters. 587 (2013) 1247–1257 počet druhů PTMs > 400 počet PTMs ≈ 90 000 (experimentálne identifikovaných) ≈ 230 000 (predikce) (SwissProt, per ≈ 530 000 proteinů) G. A. Khoury et al., Sci. Rep. 1, 90; (2011); http://selene.princeton.edu/PTMCuration ...PTMs are known to act alone and in combination to regulate nearly all aspects of protein function... Proč? CG010 39 40 Histone H3 most frequent PTMs CG010 41 Phosphorylation of Dishevelled proteins comparison of phosphorylation status of DVL3 induced by eight kinases 88 phoshosites detected after TiO2 enrichment Hanáková K. et al, Cell Commun. Signal., 17, 170 (2019) 42 Phosphorylation of Dishevelled proteins comparison of phosphorylation status of DVL3 induced by eight kinases Hanáková K. et al, Cell Commun. Signal., 17, 170 (2019) S phospho S phospho + umodified - direct analysis without TiO2 enrichment site occupancy info % % 21 phosphosites or clusters The panels show the phenotypic phosphoproteome comparison organized by GO biological process for mitotic (left) and S phase (right) cells. Proteins involved in metabolic processes have high-occupancy phosphorylation sites during mitosis, but low-occupancy sites during S phase (color scale: yellow, high overrepresentation; dark blue, high underrepresentation). Olsen J.V. et al., Sci. Signal., 3 (104) ra3 (2010) * * quantified 6027 proteins * quantified 20,443 unique phosphorylation sites Analýza fosfoproteomu změny během buněčného cyklu CG010 - HELA buňky - SILAC značení - TiO2 frakcionace - LC-MS/MS (Orbitrap) 43 44 Acetylome analysis histone and non-histone acetylations CG010 Ab - Cell Signaling kit Immunoprecipitation (monoclonal antibody, 2 hours) In-solution digestion (reduction/alkylation, trypsin) - Cell lysis and fractionation (lysis buffers) LC-MS/MS desalting desalting CG010 45 5mg of peptides Acetylome analysis histone and non-histone acetylations Ab - Cell Signaling kit Sample: lyophilized mouse liver tissue > Snímek20 http://g.denik.cz/20/6f/2913579_hrad_okor_denik-380.jpg 46 Proteomické aplikace - kvantitativní studie Relativní kvantifikace Absolutni kvantifikace 47 CG010 relativní kvantifikace Obecné schéma proteomického experimentu Analýza komplexních směsí s cílem kvantifikovat jednotlivé komponenty pomocí izotopicky odlišných značek Vzorek A Vzorek B extrakt A společné proteolytické štěpení MS or MS/MS analýza izolace proteinů extrakt B SILAC ICAT, iTRAQ, ICPL, ... (separace) (separace) Vzorek A Vzorek B extrakt A proteolytické štěpení MS or MS/MS analýza izolace proteinů extrakt B směs peptidů směs peptidů Reduktivní alkylace, iTRAQ, TMT, … (separace) kvantifikace bez použití izotopicky odlišných značek „label free“ metody statistické zpracování naměřených MS nebo MS/MS dat počet vzorků bez omezení není třeba žádné derivatizační reakce 48 Charakterizace markerových proteinů u kuřat infikovaných salmonelou relativní kvantifikace CG010 kontrola po infekci vzorky stěny střeva proteinové izoláty digesce trypsinem reduktivní alkylace LC-MS/MS data processing 49 * identifikováno více než 2300 proteinů * kvantifikační údaj pro více než 1900 Accession Description 363741657 PREDICTED: syntenin-2-like [Gallus gallus] 41.032 118095649 PREDICTED: beta-1,3-galactosyl-O-glycosyl-glycoprotein beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase 3 [Gallus gallus] 34.036 4927286 alpha enolase [Bos taurus] 33.575 112491068 Chain A, Crystal Structure Of A M-Loop Deletion Variant Of Ment In The Cleaved Conformation 30.221 56118294 ribonuclease homolog precursor [Gallus gallus] 25.497 363741459 PREDICTED: protein-glutamine gamma-glutamyltransferase E [Gallus gallus] 24.786 CG010 ověřění pomocí real-time PCR objasnění molekulárních mechanizmů nalezení markerových proteinů pro časnou diagnostiku infikovaný/ kontrola spolupráce s VÚVel Brno Matulova M. et al., Vet. Res., 44:37 (2013) 50 The quantitative and condition-dependent Escherichia coli proteome Schmidt A., Nature Biotechnol., 34 (2016), 104 – 110 22 different growth conditions in biological triplicates. (i)growth on minimal media with an excess of different carbon and energy sources (ii)growth in glucose-limited chemostat cultures with varying growth rates, (iii)growth on glucose excess with different stress conditions, (iv)growth on complex medium, and (v)1 and 3 d into stationary phase. cellular protein concentrations for 55% of predicted E. coli genes (>2,300 proteins) 41 proteins related to glycolytic pathway, tricarboxylic acid cycle enzymes and others was selected to absolute quantification The concentration range of the 41 proteins covered more than four orders of magnitudes ranging from around 92,000 to only 2 copies per cell. Deep proteome coverage obtaining maximum information about proteome Direct analysis of complex protein mixture (tryptic digest) by LC-MS/MS 2000-5000 protein identifications Cells contain ~ 8 000 – 10 000 proteins (modified forms not counted) Reasons •Wide dynamic concentration range •Time limitation of mass spectrometers (not enough time to measure all peptides eluting simultaneously from column) Solution To simplify the complex sample prior LC-MS/MS analysis by fractionation •organelle level •protein level •peptide level • •instrumentally (e.g. repeated analyses of the same sample with exclusion of already identified peptides, scheduled precursor list (SPL)) 52 Charakterizace proteomu a fosfoproteomu buněčné linie HEK293 lyze SDT pufr [SDS+DTT+Tris] HEK293 53 TiO2 frakcionace analýza fosfofrakcí LC-MS/MS (Orbitrap Elite) zpracování dat reverzní fáze pH 10 1D LC separace zpracování dat analýza frakcí LC-MS/MS (Orbitrap Elite) FASP TMT značení spolupráce s doc. V. Bryjou, PřF MU Wnt3a aktivace WT vs DVL KO 2 replikáty •10 000 proteinů •30 000 fosfopeptidů • •~100 změn na proteinové úrovni •~250 změněných fosforylovaných míst dosud nepublikováno 2-D LC-MS/MS off-line Data processing w/o and with SPL LC-MS/MS (Orbitrap Elite) SPL – „scheduled precursor list“ analysis enables repeated analysis of sample with exclusion of already identified peptides in previous analysis 54 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 High pH fractionation of whole proteome digest (1th D) 2-D LC-MS/MS off-line 55 17931 20395 86212 95781 Number of identified peptides Number of identified proteins 9013 3398 3098 5474 5140 1317 1126 8560 Fractionation three fold increase in number of identified proteins Higher sequence coverage for most proteins Cílená MS/MS analýza vybraných proteinů relativní /absolutní kvantifikace multiple reaction monitoring (MRM) CG010 screening – výběr kandidátního proteinu příprava metody (výběr MRM přechodů – peptid + vybraný fragment) Protein mixture In-solution digestion Peptides LC-MS/MS – MRM mode vlastní analýza a zpracování dat http://www.srmatlas.org 56 PRM Kvantifikace enterotoxinů cílená analýza vybraného proteinu MRM * výběr peptidů vhodných pro kvantifikaci * absolutní kvantifikace pomocí AQUA peptidů výsledek - zjištěné množtví/koncentrace daného proteinu ve vzorku CG010 57 SWATH MS Q-TOF, MS/MS < 10 ppm Retention time m/z * Relativní i absolutní kvantifikace * Procesování dat – - srovnání s knihovnami MS/MS spekter - klasické prohledávání proti databázím proteinových sekvencí celé MS/MS spektrum Gillet et al, MCP, 11, 1-17 (2012) DIA – data independent acquisition 58 CG010 59 Krasny L. et al., Mol. Omics, 17, 29 – 42 (2021) DDA vs DIA CG010 60 Single-cell proteomics CG010 Why? See the source image 61 Single-cell proteomics CG010 ~ 1 HeLa cell ~1250 proteins bruker.com 2021 2022 Claudia Ctortecka presentation, Evosep webminar HEK293T single cells základní předpoklad úspěchu – správná příprava vzorku zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz) odstranění kontaminant rušících koncovou MS analýzu ... CG010 Proces přípravy proteomických vzorků je složen z mnoha procedur, v každém z nich hrozí ztráta vzorku či jeho ovlivnění 62 _______7 a to je konec 63