CG020 Genomika
Přednáška 2 – dokončení
Identifikace genů
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
 Identifikace genů ab initio
 příprava genově obohacených knihoven
pomocí technologie metylačního filtrování
 EST knihovny
 přímá a reverzní genetika
 Experimentální identifikace genů
 genomová kolinearita a genová homologie
 struktura genů a jejich vyhledávání
 Postupy „přímé“ a reverzní genetiky
 rozdíly v myšlenkových přístupech k
identifikaci genů a jejich funkcí
Osnova
(dokončení přednášky 02)
3
 Změna fenotypu po mutagenezi
 Genetika přímá
 Identifikace sekvenčně-specifického
mutanta a analýza jeho fenotypu
 Genetika reverzní
 Analýza exprese daného genu a jeho
časoprostorové specifity
 Principy experimentální identifikace genů
prostřednictvím přímé a reverzní genetiky
Přímá a reverzní
genetika
4
 Změna fenotypu po mutagenezi
 Genetika přímá
 Principy experimentální identifikace genů
prostřednictvím přímé a reverzní genetiky
Přímá a reverzní
genetika
5
 Změna fenotypu po mutagenezi
 Genetika přímá
 Principy experimentální identifikace genů
prostřednictvím přímé a reverzní genetiky
Přímá a reverzní
genetika
 CKI1 overexpression mimics cytokinin response
Kakimoto, Science, 1996
NO
hormones
tZ
ctrl1 ctrl2Plasmid Rescue Pro35S::CK1
Identifikace CKI1 aktivační
mutagenezí
6
Signal Transduction via MSP
NUCLEUS
CYTOKININ
PM
AHK sensor histidine kinases
• AHK2
• AHK3
• CRE1/AHK4/WOL
REGULATION OF TRANSCRIPTION
INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS
HPt Proteins
• AHP1-6
Response Regulators
• ARR1-24
7
8
 Změna fenotypu po mutagenezi
 Genetika přímá
 Identifikace inzerčního mutanta a analýza
jeho fenotypu
 Genetika reverzní
 Principy experimentální identifikace genů
prostřednictvím přímé a reverzní genetiky
Přímá a reverzní
genetika
Identification of insertional
cki1 mutant allele
9
CKI1 Regulates Female Gametophyte
Development
CKI1/CKI1CKI1/cki1-i
Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003)
10
A. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i
B. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt
C. ♂ wt x ♀ CKI1/cki1-i
D. ♂ CKI1/cki1-i x ♀ wt
CKI1 specific primers (PCR positive control)
cki1-i specific primers
CKI1 and
Megagametogenesis
 cki1-i is not transmitted through the female gametophyte
11
FG 0FG 1FG 2FG 3FG 4
CKI1 and
Megagametogenesis
12
cki1-iCKI1
late FG5FG6FG7
24 HAE48 HAE
CKI1 and
Megagametogenesis
Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003)
13
14
 Změna fenotypu po mutagenezi
 Genetika přímá
 Identifikace inzerčního mutanta a analýza
jeho fenotypu
 Genetika reverzní
 Analýza exprese daného genu a jeho
časoprostorové specifity
 Principy experimentální identifikace genů
prostřednictvím přímé a reverzní genetiky
Přímá a reverzní
genetika
CKI1 is Expressed During
Megagametogenesis
FG0-FG1
FG3-FG4
FG4-FG5
FG7
15
12 HAP
(hours
after
pollination)
24 HAP48 HAP72 HAP
♀ wt x ♂ ProCKI1:GUS
Paternal CKI1 is Expressed in the
Arabidopsis Sporophyte Early after
Fertilization
24 HAP
Hejátko et al., Mol Genet Genomics (2003)
16
CG020 Genomika
Přednáška 3
Reverzní genetika
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
18
18
 Bioinformatics and Functional Genomics, 2009, Jonathan Pevsner, WilleyBlackwell,
Hobocken, New Jersey
http://www.bioinfbook.org/index.php
 Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press,
Totowa, New Jersey
 Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference.
Nature, 431, 338-342.
 Klinakis et al.. (2000) Genome-wide insertional mutagenesis in human cells by
the Drosophila mobile element Minos. EMBO Rep, 1, 416.
 Hansen et al.. (2003) A large-scale, gene-driven mutagenesis approach for the
functional analysis of the mouse genome. PNAS, 100, 9918.
Literatura
19
„Přímě genetický“přístup
1. IDENTIFIKACE FENOTYPU
2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ
3. GENOVÁ IDENTIFIKACE
-poziční klonování
„Reverzně genetický“ přístup
1.IZOLACE SEKVENČNĚ
SPECIFICKÉHO MUTANTA
2. IDENTIFIKACE FENOTYPU
3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI
MEZI INZERCÍ A FENOTYPEM
NÁHODNÁ MUTAGENEZE
Přístupy „klasické“genetiky versus „reverzně genetický“
přístup ve funkční genomice
EMS
T-DNA
(retro)transposons
19
20
20
 Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi
fenotypem a inzerční mutací
 využití nestabilních inzerčních mutagenů a
izolace revertantních linií
 kosegregační analýza
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v
elektronických databázích
 identifikace nezávislé inzerční alely
Osnova
 vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní
rekombinace
 komplementace mutanta pomocí transgenu
21
• Mobilní elementy
• Stabilní elementy
 Autonomní transpozony (En-1)
 Neautonomní transpozony (dSpm)
 T-DNA
 obsahují gen pro transponázu, umožňující excizi
a opětovné začlenění do genomu
 na obou koncích obsahují krátké obrácené
repetice, které jsou transponázou rozpoznávány
 mutant En/Spm transpozonu, který mutací v genu
pro transponázu ztratil autonomii
 může být aktivován křížením s linií nesoucí
En/Spm transpozon
 zcela stabilní, její inzerce však může vést k
chromozomovým přestavbám (inverze, delece,
transpozice)
Typy inzerčních mutagenů
21
22
22
vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
Knihovny inzerčních
mutantů (u rostlin)
příprava transgenních rostlin
vytvoření populace mutantních jedinců
23
23
Knihovny inzerčních
mutantů (u živočichů)
Transfekce do lidských buněčných kultur (HeLa) nebo
myších embryonálních kmenových (ES) buněk
vytvoření populace mutantních buněčných linií
a analýza frekvence inzercí
In vitro analýzy nebo příprava knihovny
inzerčních mutantů reintrogresí ES do myších
embryí
Technologii inzerční mutageneze lze využít i u živočichů. Zda se využívají
např. transpozony odvozené z Drosophily (transpozon Minos, viz schéma
vlevo nahoře (Klinakis et al., 2000). V tomto případě bylo nutne provést
kotransfekci s tzv. helper plasmiem, kódujícím transponázu (neautonomní
transpozon). Neo kóduje rezistenci k neomycinu, šipky ukazují směr
transkripce řízený přislušnými promotory, pA je polyadenylační signál, ori
je počátek replikace viru SV40, S-P je promotor téhož viru. Pro identifikaci
inzercí „in frame“ se zasaženými geny lze využít transpozony, obsahující
fůzi akceptorových míst sestřihu s ORF reportérového genu, např. lacZneo
(bez AUG kodonu). Tento přístup umožňuje identifikovat inzerce do
aktivních genů prostřednictvím selekce inzerčních mutantů na rezistenci k
neomycinu, resp. vykazující β-galaktozidázovou aktivitu (Klinakis et al.,
2000).
24
24
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
Osnova
 „trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR
25
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
1.Knihovna En-1 inzerčních mutantů
• 3000 nezávislých linií
• průměrně 5 kopií na linii
• trojrozměrné vyhledáváni pomocí PCR
• autonomní En/Spm, bez selekce
25
26
Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky
 „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR
 izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření
souhrnných souborů DNA („trojice“, řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy)
p o o l 1 ......p o o l 2 8
28x3-tray pools
90
R
28 x 7 row pools
28 x 5 column pools
35
B
35
B
28 x 3 1-tray pools
3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii)
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
27
Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky
 „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR
 izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a
vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice“, řady a sloupce trojic
a jednotlivé podnosy)
 identifikace pozitivní „trojice“ pomocí PCR, blotování PCR produktů
a hybridizace s genově specifickou sondou
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky
p o o l 1 ......p o o l 2 8
28x3-tray pools
Identifikace PCR produktu pomocí
hybridizace s genově spec. sondou
1. Vyhledávání pozitivní trojice
En-1
En-8130
En-205
Xho67
1262
CKI1 CKI1
En-1
En-8130
En-205Xho67
1262
CKI1 CKI1
(2x2x28=112 PCR reakcí)
3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii)
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
28
29
Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky
 „Trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR
 izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní
populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice“,
řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy)
 identifikace pozitivní „trojice“ pomocí PCR, blotování PCR
produktů a hybridizace s genově specifickou sondou
 identifikace pozitivní linie pomocí Identifikace pozitivního
„tácu“, řady a sloupce
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky
p o o l 1 ......p o o l 2 8
28x3-tray pools
Identifikace PCR produktu pomocí
hybridizace s genově spec. sondou
1. Vyhledávání pozitivní trojice
2. Identifikace linie nesoucí inzerci
En-1
En-8130
En-205
Xho67
1262
CKI1 CKI1
En-1
En-8130
En-205Xho67
1262
CKI1 CKI1
(2x2x28=112 PCR reakcí)
(dalších 5+7+3=15 PCR reakcí)
Celkem 112+15=127 PCR reakcí
9 0
R
7 row pools
5 column pools
3 5
B
3 5
B
3 x 1-tray pools
3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-1/linii)
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
30
31
31
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
Osnova
 „trojrozměrné“ vyhledávání pomocí PCR
 hybridizace s produkty iPCR na filtrech
32
Inzerční knihovna dSpm mutantů
 48.000 linií
 neautonomní transposon
 SINS (sequenced insertion sites) databáze
 PCR vyhledávání nebo hybridizace s iPCR filtry
 The Sainsbury Laboratory (SLAT-lines),
John Innes Centre, Norwich Research Park
 DNA a semena v Nottingham Seed Stock Centre
http://nasc.nott.ac.uk
 průměrně 1.2 izerce na linii
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
32
33
T-DNA
 Hybridizace s produkty iPCR na filtrech
 izolace genomové DNA z
jednotlivých rostlin mutantní
populace
 štěpení restriční endonukleázou
 ligace, vznik cirkulární DNA
 inverzní PCR (iPCR) pomocí T-DNA
specifických primerů
 příprava nylonových filtrů s produlty
iPCR v přesně daném vzorci
(poloze) pomocí robota
 hybridizace s genově specifickou
sondou
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
33
34
34
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v
elektronických databázích
Osnova
35
Příprava knihoven z populace A. thaliana mutované pomocí
T-DNA
GABI-Kat (MPIZ, Köln)
Izolace sekvenčně specifických
mutantů
35
36
Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních
mutantů
36
37
Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
gtgactaaagtgtaattaataagtga………
1923
13
37
38
38
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v
elektronických databázích
Osnova
 vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní
rekombinace
39
Knocking-Out the Gene
39
40
40
 Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi
fenotypem a inzerční mutací
 využití nestabilních inzerčních mutagenů a
izolace revertantních linií
 kosegregační analýza
 Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů
 příprava sbírky mutantů
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů
pomocí PCR
 vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v
elektronických databázích
 identifikace nezávislé inzerční alely
Osnova
 vypínání genů (knocking-out) pomocí homologní
rekombinace
 komplementace mutanta pomocí transgenu
41
 přítomnost více inzercí v jedné linii
Proč je nutné analyzovat příčinnou souvislost
mezi inzercí a pozorovaným fenotypem ?
 možnost vzniku nezávislé bodové mutace
 s inzercí T-DNA jsou často asociovány chromozomové aberace a
přestavby (duplikace, inverze, delece)
41
42
 Kosegregační analýza
 kosegregace specifického fragmentu např. po inzerci T-DNA (nebo
působení EMS atd.) do genomu s pozorovaným fenotypem
cki1::En-1
+ ++ + + + + + ++
Kauzalita mezi inzercí a
fenotypem
42
43
 excize transpozonů není vždy zcela přesná-vznik bodových
mutací - izolace revertantních linií s tichou mutací i stabilních
mutantů
Využití autonomních transpozonů pro izolaci
nových stabilních mutací a revertantních linií
 transpozony se často vyznačují excizí a reinzercí do blízké
oblasti-využití při izolaci nových mutantních alel
43
44
Fenotyp šešulí cki1::En-1/CKI1
cki1::En-1/CKI1 CKI1/CKI1
44
45
1. Izolace revertantních linií
• PCR vyhledávání ve 246 rostlinách segregující populace
• z 90 cki1::En-1 pozitivních 9 rostlin mělo kromě šešulí mutantních i
šešule standardního typu
Analýza potomstva
• potvrzení absence inzerce pomocí PCR
• PCR amplifikace a klonování části
genomové DNA v místě inzerce
• sekvenování
Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1
45
46
Využití autonomních transpozonů pro izolaci
nových stabilních mutací a revertantních linií
46
47
2. Izolace stabilní mutantní linie
• analýza fenotypu segregující populace (CKI1/CKI1 CKI1/cki1::En-1)
• PCR analýza rostlin s mutantním fenotypem-identifikace rostlin bez inzerce
• PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce
• sekvenování
Potvrzení fenotypu cki1::En-1/CKI1
47
48
Využití autonomních transpozonů pro izolaci
nových stabilních mutací a revertantních linií
48
49
Komplementace
mutantní linie
GOI
GO ITransposone/T‐DNA
vlastní promotor
GOI kódující oblast/genomová DNA genu zájmu
49
50
Ranjan et al., 2014
Komplementace
mutantní linie
50
51
51
 Analýza fenotypu
 Potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční
mutací
 využití nestabilních inzerčních mutagenů a
izolace revertantních linií
 kosegregační analýza
 Jak reverzní genetika zkoumá gen a jeho
funkci?
 Cílené umlčení genu
 Vyhledání v knihovnách inzerčních mutantů
 Homologní rekombinace
 identifikace nezávislé inzerční alely
Klíčové koncepty
 komplementace mutanta pomocí transgenu
52
52
Diskuse