CG020 Genomika
Přednáška 6
Genová exprese a chemická genetika
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
 Zdrojová literatura
 Karaiskos N, Wahle P, Alles J, Boltengagen A, Ayoub S, Kipar C, Kocks C,
Rajewsky N, Zinzen RP (2017) The Drosophila embryo at single-cell
transcriptome resolution. Science 358: 194-199
 Lecuyer, E., Yoshida, H., Parthasarathy, N., Alm, C., Babak, T., Cerovina, T.,
Hughes, T.R., Tomancak, P., and Krause, H.M. (2007). Global analysis of
mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture
and function. Cell 131, 174-187.
 Nevo-Dinur, K., Nussbaum-Shochat, A., Ben-Yehuda, S., and Amster-Choder,
O. (2011). Translation-independent localization of mRNA in E. coli. Science
331, 1081-1084
 Schonberger, J., Hammes, U.Z., and Dresselhaus, T. (2012). In vivo
visualization of RNA in plants cells using the lambdaN(22) system and a
GATEWAY-compatible vector series for candidate RNAs. The Plant journal : for
cell and molecular biology 71, 173-181.
 Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and
signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-10
 Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins):
Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501
Genomika 06
3
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
 Chemická genetika
Osnova
4
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
Osnova
5
□ Transkripční fůze s promotorovou oblastí
 Identifikace a klonování promotorové oblasti genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen
(uidA, GFP)
TATA box
počátek transkripce
promotor
5’ UTR
ATG…ORF reportérového genu
Transkripční fůze
6
□ Transkripční fůze s promotorovou oblastí
 Identifikace a klonování promotorové oblasti genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen
(uidA, GFP)
 příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a
jejich histologická analýza
Transkripční fůze
7
GUS reporter in mouse
embryos
8
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
Osnova
9
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
 Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného
genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a kódující sekvenci
studovaného genu ve fůzi s reportérovým genem (uidA, GFP)
TATA box
promotor
5’ UTR
ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP
Translační fůze
10
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
 příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a
jejich histologická analýza
 oproti transkripční fůzi umožńuje analyzovat např. intracelulární lokalizaci
genového produktu (proteinu) nebo jeho dynamiku
Histone 2A-GFP in Drosophila embryo by PAM
Translační fůze
PIN1-GFP in Arabidopsis
11
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
Translační fůze
12
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
Osnova
13
Databáze
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
14
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
Databáze
15
Databáze
□ Analýza exprese pomocí ePlant
16
Databáze
□ Analýza exprese pomocí ePlant
17
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
Databáze
18
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
Osnova
19
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
□ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
20
□ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
21
□ High-Resolution Expression Map in Drosophilla
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
Nikos Karaiskos et al. Science 2017;science.aan3235
22
Expression Maps - Proteins
Ponten et al., J Int Med, 2011
□ Human Protein Atlas
23
□ Human Protein Atlas
(http://www.proteinatlas.org/)
Expression Maps - Proteins
24
□ Human Protein Atlas
(http://www.proteinatlas.org/)
Expression Maps - Proteins
25
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
Osnova
26
 DNA čipy
 metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství
genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou
 nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy
 k dispozici komerčně dostupné sady pro celý genom
 firma Operon (Qiagen), 29.110 70-mer oligonulkleotidů reprezentujících
26.173 genů kódujících proteiny, 28.964 transkriptů a 87 microRNA genů
Arabidopsis thaliana
 možnost používat pro přípravu čipů fotolitografické techniky-usnadnění
syntézy oligonukleotidů např. pro celý genom člověka (cca 3,1 x 109 bp) je
touto technikou možno připravit 25-mery v pouźe 100 krocích)
Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array čipy nejen pro analýzu exprese,
ale např. i genotypování (SNP
polymorfizmy, sekvenování
pomocí čipů, …)
DNA Chips
27
DNA Chips
28
Photolitography
29
 DNA čipy, analýza výsledků
 pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost
pokročilých statistických metod
 kontrola na přesnost měření (opakované měření
na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení
stejných vzorků analyzovaných na různých čipech
proti sobě)
 je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování
 kontrola reproducibility měření (opakované měření
s různými vzorky, izolovanými za stejných
podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti
sobě)
Che et al., 2002
 identifikace hranice spolehlivého měření
nespolehlivé
spolehlivé
 konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo
různých podmínek proti sobě – vlastní výsledek
 v současnosti je již velké množství výsledků různých
experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných
databázích
DNA Chips
30
 Proteinové čipy
 čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů
 analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a
interakcí s malými molekulami
 možnost použít protilátky – stabilnější než samotné
proteiny
Protein Chips
31
 Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí
integrinu αIIbβ3 krevních destiček
 exprese cytoplasmatické části jako
fůzního peptidu biotin-KVGFFKR
 analýza vazby s proteinovým čipem
obsahujícím 37.000 klonů E.coli
exprimujících lidské rekombinantní
proteiny
 potvrzení interakce pull-down
analýzou peptidů i koprecipitací
celých proteinů (chloridový kanál
ICln)
 další využití např. při identifikaci
substrátů kináz, kdy substráty jsou
navázány na čip a vystaveny
působení kináz za přítomnosti
radiokativně značeného ATP (768
purif. proteinů ječmene, z nich 21
identifikováno jako subtráty kinázy
CK2α, Kramer et al., 2004)
Lueking et al., 2005
Protein Chips
32
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
Osnova
33
WT hormonal mutant
Next Gen Transcriptional
Profiling
□ Transcriptional profiling via RNA sequencing
mRNA
Sequencing by Illumina and
number of transcripts determination
mRNA
cDNA cDNA
34
Results of –omics Studies vs
Biologically Relevant Conclusions
□ Transcriptional profiling yielded more then 7K differentially
regulated genes…
gene locus sample_1 sample_2 status value_1 value_2 log2(fold_change) test_stat p_value q_value significant
AT1G07795 1:2414285-2414967 WT MT OK 0 1,1804 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.88885e-05
0,00039180
1 yes
HRS1 1:4556891-4558708 WT MT OK 0 0,696583 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.61994e-06
4.67708e-
05 yes
ATMLO14 1:9227472-9232296 WT MT OK 0 0,514609 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.74219e-05
0,00053505
5 yes
NRT1.6 1:9400663-9403789 WT MT OK 0 0,877865 1.79769e+308
1.79769e+3
08 3.2692e-08
3.50131e-
07 yes
AT1G27570 1:9575425-9582376 WT MT OK 0 2,0829 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.76039e-06 6.647e-05 yes
AT1G60095 1:22159735-22162419 WT MT OK 0 0,688588 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.95901e-08
9.84992e-
07 yes
AT1G03020 1:698206-698515 WT MT OK 0 1,78859 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00913915 0,0277958 yes
AT1G13609 1:4662720-4663471 WT MT OK 0 3,55814 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00021683 0,00108079 yes
AT1G21550 1:7553100-7553876 WT MT OK 0 0,562868 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00115582 0,00471497 yes
AT1G22120 1:7806308-7809632 WT MT OK 0 0,617354 1.79769e+308
1.79769e+3
08 2.48392e-06
1.91089e-
05 yes
AT1G31370 1:11238297-11239363 WT MT OK 0 1,46254 1.79769e+308
1.79769e+3
08 4.83523e-05
0,00028514
3 yes
APUM10 1:13253397-13255570 WT MT OK 0 0,581031 1.79769e+308
1.79769e+3
08 7.87855e-06
5.46603e-
05 yes
AT1G48700 1:18010728-18012871 WT MT OK 0 0,556525 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.53917e-05
0,00037473
6 yes
AT1G59077 1:21746209-21833195 WT MT OK 0 138,886 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00122789 0,00496816 yes
AT1G60050 1:22121549-22123702 WT MT OK 0 0,370087 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00117953 0,0048001 yes
Ddii et al., unpublished
AT4G15242 4:8705786-8706997 WT MT OK 0,00930712 17,9056 10,9098 -4,40523 1.05673e-05 7.13983e-05 yes
AT5G33251 5:12499071-12500433 WT MT OK 0,0498375 52,2837 10,0349 -9,8119 0 0 yes
AT4G12520 4:7421055-7421738 WT MT OK 0,0195111 15,8516 9,66612 -3,90043 9.60217e-05 0,000528904 yes
AT1G60020 1:22100651-22105276 WT MT OK 0,0118377 7,18823 9,24611 -7,50382 6.19504e-14 1.4988e-12 yes
AT5G15360 5:4987235-4989182 WT MT OK 0,0988273 56,4834 9,1587 -10,4392 0 0 yes
35
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
Osnova
36
 Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané
funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 metoda umožňující izolaci dominantních mutantů
prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního
promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím
odpovídajícím fenotypovým změnám
 prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené
pomocí transformace silného konstitutivního promotoru
nebo zesilovače
 následuje vyhledávání zajímavých fenotypů
 identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-
rescue
Gain-of-Function Approaches
37
TF TF
TF
40S
60S
TF TF TF TF
40S
60S
40S
60S
40S
60S
40S
60S
TF TF
TF
Activation Mutagenesis
38
Izolace genu CKI1
- izolace genu pomocí aktivační mutageneze
- Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985
Kakimoto, Science, 1996
NO
hormones
tZ
ctrl1 ctrl2Plasmid Rescue Pro35S::CK1
39
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
Osnova
40
 umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci
genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím
identifikaci přirozené funkce genu
 pOP systém
Regulated Expression
Systems
41
35S LhG4
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
x
Regulated Expression
Systems
42
35S LhGR
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
DEX DEX
+DEX DEX
DEX
DEX
x
Regulated Expression
Systems
43
35S LhGR
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
DEX DEX
+DEX DEX
DEX
DEX
x
pOP
TATA
GUS
DEX DEX
wt Col-
0
4C
Regulated Expression
Systems
44
 umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci
genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím
identifikaci přirozené funkce genu
 pOP systém
 UAS systém
Regulated Expression
Systems
45
UAS System
http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/
46
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
 Chemická genetika
Osnova
47
 pojem chemical genetics – více než 50.000/235,577
záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008/19.11.
2020, nárůst >470%)
Chemical Genetics
 podobně jako v případě genetiky, existují i zde přístupy
„přímé“ a „reverzní“
 oproti přístupům „klasické“ genetiky není předmětem zájmu
gen ale protein
 chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein
po chemickém působení a následných fenotypových změnách
(„přímá“ chemická genetika) nebo naopak chemikálie
schopné interakce s proteinem zájmu („reverzní“ chemická
genetika)
 za tímto účelem jsou prováděna vyhledávání v knihovnách
nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně
přístupné)
 příklad: analýza endomembránového transportu u rostlin
48
 Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy
chemické genetiky
 v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům,
zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem
(viz film, GFP směřované do ER)
Chemical Genetics
49
 Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy
chemické genetiky
 v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům,
zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem
(viz film, GFP směřované do ER)
 endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem
při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů
Chemical Genetics
50
Anterograde
transport
Retrograde
transport
Trans-Golgi
network
Multivesicular
bodies-late
endosome
(prevacuolar
compartment)
Recycling
endosome
Richter et al., E J Cell Biol (2010)
Huang et al., 2010
PIN1-GFP
Endomembránový transport
51
Zouhar et al., 2004
chemická struktura sortinů
detekce vakuolárního fenotypu (tvaru tonoplastu)
kvasinek pomocí barvení specifickou barvou (MDY-64)
Imunodetekce karboxypeptidázy
Chemical Genetics
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu přístupy chemické genetiky
 pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek
byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S.
cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y),
která je normálně transportována pomocí
endomembránového transportu do vakuoly
 analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a
imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním
médiu pomocí monoklonálních
protilátek
52
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu přístupy chemické genetiky
 pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek
byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S.
cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y),
která je normálně transportována pomocí
endomembránového transportu do vakuoly
 identifikované látky („sortiny“) byly schopny vyvolat
obdobné změny i u Arabidopsis - konzervované
mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin
 analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a
imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním
médiu pomocí monoklonálních
protilátek
 pro bližší identifikaci molekulárního procesu
ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů“ byla
provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového
proteinu (AtCPY) – sortin 1 inhibuje specificky pouze
tuto sekreční cestu
 pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se
změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hyposenzitivní
mutanti)
Zouhar et al., 2004
tvar rostlinných vakuol pomocí EGFP:-TIP
fenotyp semenáčků v přítomnosti sortinů
Sortin 1
Sortin 2
Chemical Genetics
53
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu pomocí chemické genetiky -
shrnutí
 GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly
(tonoplastu) a identifikace mutací
vedoucí ke změně morfologie
tonoplastu
 chemická genetika v kombinaci s
klasickou genetikou - identifikace
proteinů zúčastńujících se regulace
endomembránového transportu
 proteomické přístupy – identifikace a
analýza proteomu vakuol
Chemical Genetics
54
 Genová exprese je specifická v místě i čase
 Analýza časoprostorové specificity genové exprese
pomocí
 Transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým
genem (gen zpravodaj)
 Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým
genem
 Veřejně dostupné databáze často s buněčným rozlišením
 Kvantitativní analýza genové exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulací genové exprese lze identifikovat funkci
genů - přístupy získané funkce
 K získání nových podmíněných fenotypů lze použít
chemickou genetiku
Klíčové koncepty
55
Diskuse