CG020 Genomika
Přednáška 6
Genová exprese a chemická genetika
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
2
 Zdrojová literatura
 Karaiskos N, Wahle P, Alles J, Boltengagen A, Ayoub S, Kipar C, Kocks C,
Rajewsky N, Zinzen RP (2017) The Drosophila embryo at single-cell
transcriptome resolution. Science 358: 194-199
 Lecuyer, E., Yoshida, H., Parthasarathy, N., Alm, C., Babak, T., Cerovina, T.,
Hughes, T.R., Tomancak, P., and Krause, H.M. (2007). Global analysis of
mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture
and function. Cell 131, 174-187.
 Nevo-Dinur, K., Nussbaum-Shochat, A., Ben-Yehuda, S., and Amster-Choder,
O. (2011). Translation-independent localization of mRNA in E. coli. Science
331, 1081-1084
 Schonberger, J., Hammes, U.Z., and Dresselhaus, T. (2012). In vivo
visualization of RNA in plants cells using the lambdaN(22) system and a
GATEWAY-compatible vector series for candidate RNAs. The Plant journal : for
cell and molecular biology 71, 173-181.
 Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and
signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-10
 Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins):
Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497–9501
Genomika 06
3
3
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
 Chemická genetika
Osnova
4
4
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
Osnova
5
□ Transkripční fůze s promotorovou oblastí
 Identifikace a klonování promotorové oblasti genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen
(uidA, GFP)
TATA box
počátek transkripce
promotor
5’ UTR
ATG…ORF reportérového genu
Transkripční fůze
5
6
□ Transkripční fůze s promotorovou oblastí
 Identifikace a klonování promotorové oblasti genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérový gen
(uidA, GFP)
 příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a
jejich histologická analýza
Transkripční fůze
6
7
GUS reporter in mouse
embryos
7
8
8
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
Osnova
9
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
 Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného
genu
 příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a kódující sekvenci
studovaného genu ve fůzi s reportérovým genem (uidA, GFP)
TATA box
promotor
5’ UTR
ATG…ORF analyzovaného genu….ATG…ORF reportérového genu….....STOP
Translační fůze
9
10
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
 příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a
jejich histologická analýza
 oproti transkripční fůzi umožńuje analyzovat např. intracelulární lokalizaci
genového produktu (proteinu) nebo jeho dynamiku
Histone 2A-GFP in Drosophila embryo by PAM
Translační fůze
PIN1-GFP in Arabidopsis
10
11
□ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
repotérovým genem
Translační fůze
11
12
12
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
Osnova
13
Databáze
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
13
14
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
Databáze
14
15
Databáze
□ Analýza exprese pomocí ePlant
15
16
Databáze
□ Analýza exprese pomocí ePlant
16
17
□ Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP1 a AHP2,
Arabidopsis, Affymetrix ATH 22K Array)
Databáze
17
18
18
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
Osnova
19
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
□ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
Microarray expression profiles of 19 fluorescently sorted GFP-marked lines were
analyzed (3–9, 23, 24). The colors associated with each marker line reflect the
developmental stage and cell types sampled. Thirteen transverse sections were
sampled along the root's longitudinal axis (red lines) (10). CC, companion cells.
19
20
□ High-Resolution Expression Map in Arabidopsis Root
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
(A) The majority of enriched GO terms (hierarchically clustered) are associated
with individual cell types (blue bar). A smaller number are present across multiple
cell types (green bar). (fig. S2) (B) GO category enrichment for hair cells
confirms a previous report (15). Enriched cis-elements and an enriched TF family
were also identified. (C) From the top 50% of varying probe sets, 51 dominant
radial patterns were identified. Pattern expression values were mean-normalized
(rows) and log2 transformed to yield relative expression indices for each marker
line (columns). Marker line order is the same for all figures; see table S1 for
marker line abbreviations. (D) Pattern expression peaks were found across one
to five cell types. (E to G) Patterns where expression is enriched in single and
multiple cell types support transcriptional regulation of auxin flux and synthesis. In
all heat maps with probe sets, expression values were mean-normalized and log2
transformed. Expression is false-colored in representations of a root transverse
section, a cut-away of a root tip, and in a lateral root primordium. (E) Auxin
biosynthetic genes (CYP79B2, CYP79B3, SUPERROOT1, and SUPERROOT2)
are transcriptionally enriched in the QC, lateral root primordia, pericycle, and
phloem-pole pericycle (P = 1.99E–11, pattern 5). All AGI identifiers and TAIR
descriptions are found in table S14. (F) Auxin amido-synthases GH3.6 and
GH3.17 that play a role in auxin homeostasis show enriched expression in the
columella, just below the predicted auxin biosynthetic center of the QC (P =
8.82E–4, pattern 13). (G) The expression of the auxin transporter, PINFORMED2,
and auxin transport regulators (PINOID, WAG1) are enriched in the
columella, hair cells, and cortex (P = 1.03E–4, pattern 31).
20
21
□ High-Resolution Expression Map in Drosophilla
Expression Maps - RNA
Brady et al., Science, 2007
Nikos Karaiskos et al. Science 2017;science.aan3235
Deconstructing and reconstructing the embryo by single-cell
transcriptomics combined with spatial mapping.
(A) Single-cell sequencing of the Drosophila embryo: ~1000 handpicked stage 6
fly embryos are dissociated per Drop-seq replicate, cells are fixed and counted,
single cells are combined with barcoded capture beads, and libraries are
prepared and sequenced. Finally, single-cell transcriptomes are deconvolved,
resulting in a digital gene expression matrix for further analysis.
(B) Mapping cells back to the embryo: Single-cell transcriptomes are correlated
with high-resolution gene expression patterns across 84 marker genes, cells are
mapped to positions within a virtual embryo, and expression patterns are
computed by combining the mapping probabilities with the expression levels
(virtual in situ hybridization).
21
22
Expression Maps - Proteins
Ponten et al., J Int Med, 2011
□ Human Protein Atlas
Schematic flowchart of the Human Protein Atlas. For each gene, a signature
sequence (PrEST) is defined from the human genome sequence, and following
RT-PCR, cloning and production of recombinant protein fragments, subsequent
immunization and affinity purification of antisera results inmunospecific
antibodies. The produced antibodies are tested and validated in various
immunoassays. Approved antibodies are used for protein profiling in cells
(immunofluorescence) and tissues (immunohistochemistry) to generate the
images and protein expression data that are presented in the Human Protein
Atlas (Ponten et al., J Int Med, 2011).
22
23
□ Human Protein Atlas
(http://www.proteinatlas.org/)
Expression Maps - Proteins
23
24
□ Human Protein Atlas
(http://www.proteinatlas.org/)
Expression Maps - Proteins
24
25
25
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
Osnova
26
 DNA čipy
 metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství
genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou
 nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy
 k dispozici komerčně dostupné sady pro celý genom
 firma Operon (Qiagen), 29.110 70-mer oligonulkleotidů reprezentujících
26.173 genů kódujících proteiny, 28.964 transkriptů a 87 microRNA genů
Arabidopsis thaliana
 možnost používat pro přípravu čipů fotolitografické techniky-usnadnění
syntézy oligonukleotidů např. pro celý genom člověka (cca 3,1 x 109 bp) je
touto technikou možno připravit 25-mery v pouźe 100 krocích)
Affymetrix ATH1 Arabidopsis genome array čipy nejen pro analýzu exprese,
ale např. i genotypování (SNP
polymorfizmy, sekvenování
pomocí čipů, …)
DNA Chips
26
27
DNA Chips
28
Photolitography
29
 DNA čipy, analýza výsledků
 pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost
pokročilých statistických metod
 kontrola na přesnost měření (opakované měření
na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení
stejných vzorků analyzovaných na různých čipech
proti sobě)
 je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování
 kontrola reproducibility měření (opakované měření
s různými vzorky, izolovanými za stejných
podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti
sobě)
Che et al., 2002
 identifikace hranice spolehlivého měření
nespolehlivé
spolehlivé
 konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo
různých podmínek proti sobě – vlastní výsledek
 v současnosti je již velké množství výsledků různých
experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných
databázích
DNA Chips
29
30
 Proteinové čipy
 čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů
 analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a
interakcí s malými molekulami
 možnost použít protilátky – stabilnější než samotné
proteiny
Protein Chips
30
31
 Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí
integrinu αIIbβ3 krevních destiček
 exprese cytoplasmatické části jako
fůzního peptidu biotin-KVGFFKR
 analýza vazby s proteinovým čipem
obsahujícím 37.000 klonů E.coli
exprimujících lidské rekombinantní
proteiny
 potvrzení interakce pull-down
analýzou peptidů i koprecipitací
celých proteinů (chloridový kanál
ICln)
 další využití např. při identifikaci
substrátů kináz, kdy substráty jsou
navázány na čip a vystaveny
působení kináz za přítomnosti
radiokativně značeného ATP (768
purif. proteinů ječmene, z nich 21
identifikováno jako subtráty kinázy
CK2α, Kramer et al., 2004)
Lueking et al., 2005
Protein Chips
31
32
32
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
Osnova
33
WT hormonal mutant
Next Gen Transcriptional
Profiling
□ Transcriptional profiling via RNA sequencing
mRNA
Sequencing by Illumina and
number of transcripts determination
mRNA
cDNA cDNA
33
34
Results of –omics Studies vs
Biologically Relevant Conclusions
□ Transcriptional profiling yielded more then 7K differentially
regulated genes…
gene locus sample_1 sample_2 status value_1 value_2 log2(fold_change) test_stat p_value q_value significant
AT1G07795 1:2414285-2414967 WT MT OK 0 1,1804 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.88885e-05
0,00039180
1 yes
HRS1 1:4556891-4558708 WT MT OK 0 0,696583 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.61994e-06
4.67708e-
05 yes
ATMLO14 1:9227472-9232296 WT MT OK 0 0,514609 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.74219e-05
0,00053505
5 yes
NRT1.6 1:9400663-9403789 WT MT OK 0 0,877865 1.79769e+308
1.79769e+3
08 3.2692e-08
3.50131e-
07 yes
AT1G27570 1:9575425-9582376 WT MT OK 0 2,0829 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.76039e-06 6.647e-05 yes
AT1G60095 1:22159735-22162419 WT MT OK 0 0,688588 1.79769e+308
1.79769e+3
08 9.95901e-08
9.84992e-
07 yes
AT1G03020 1:698206-698515 WT MT OK 0 1,78859 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00913915 0,0277958 yes
AT1G13609 1:4662720-4663471 WT MT OK 0 3,55814 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00021683 0,00108079 yes
AT1G21550 1:7553100-7553876 WT MT OK 0 0,562868 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00115582 0,00471497 yes
AT1G22120 1:7806308-7809632 WT MT OK 0 0,617354 1.79769e+308
1.79769e+3
08 2.48392e-06
1.91089e-
05 yes
AT1G31370 1:11238297-11239363 WT MT OK 0 1,46254 1.79769e+308
1.79769e+3
08 4.83523e-05
0,00028514
3 yes
APUM10 1:13253397-13255570 WT MT OK 0 0,581031 1.79769e+308
1.79769e+3
08 7.87855e-06
5.46603e-
05 yes
AT1G48700 1:18010728-18012871 WT MT OK 0 0,556525 1.79769e+308
1.79769e+3
08 6.53917e-05
0,00037473
6 yes
AT1G59077 1:21746209-21833195 WT MT OK 0 138,886 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00122789 0,00496816 yes
AT1G60050 1:22121549-22123702 WT MT OK 0 0,370087 1.79769e+308
1.79769e+3
08 0,00117953 0,0048001 yes
Ddii et al., unpublished
AT4G15242 4:8705786-8706997 WT MT OK 0,00930712 17,9056 10,9098 -4,405231.05673e-05 7.13983e-05 yes
AT5G33251 5:12499071-12500433 WT MT OK 0,0498375 52,2837 10,0349 -9,8119 0 0 yes
AT4G12520 4:7421055-7421738 WT MT OK 0,0195111 15,8516 9,66612 -3,900439.60217e-05 0,000528904 yes
AT1G60020 1:22100651-22105276 WT MT OK 0,0118377 7,18823 9,24611 -7,503826.19504e-14 1.4988e-12 yes
AT5G15360 5:4987235-4989182 WT MT OK 0,0988273 56,4834 9,1587 -10,4392 0 0 yes
Excample of an output of transcriptional profiling study using Illumina sequencing
performed in our lab. Shown is just a tiny fragment of the complete list,
copmprising about 7K genes revealing differential expression in the studied
mutant.
34
35
35
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
Osnova
36
 Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané
funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 metoda umožňující izolaci dominantních mutantů
prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního
promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím
odpovídajícím fenotypovým změnám
 prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené
pomocí transformace silného konstitutivního promotoru
nebo zesilovače
 následuje vyhledávání zajímavých fenotypů
 identifikace zasaženého genu např.pomocí plasmid-
rescue
Gain-of-Function Approaches
36
37
TF TF
TF
40S
60S
TF TF TF TF
40S
60S
40S
60S
40S
60S
40S
60S
TF TF
TF
Activation Mutagenesis
37
38
Izolace genu CKI1
- izolace genu pomocí aktivační mutageneze
- Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985
Kakimoto, Science, 1996
NO
hormones
tZ
ctrl1 ctrl2Plasmid Rescue Pro35S::CK1
38
39
39
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
Osnova
40
40
 umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci
genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím
identifikaci přirozené funkce genu
 pOP systém
Regulated Expression
Systems
41
35S
LhG4
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
x
Regulated Expression
Systems
41
42
35S LhGR
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
DEX DEX
+DEX DEX
DEX
DEX
x
Regulated Expression
Systems
42
43
35S LhGR
pOP
TATA
CKI1
activator
reporter
activator x reporter
DEX DEX
+DEX DEX
DEX
DEX
x
pOP
TATA
GUS
DEX DEX
wt Col-
0
4C
Regulated Expression
Systems
43
44
44
 umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci
genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím
identifikaci přirozené funkce genu
 pOP systém
 UAS systém
Regulated Expression
Systems
45
UAS System
http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/
46
46
 Metody analýzy genové exprese
 Kvalitativní analýza exprese genů
 Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s
reporterovým genem (gen zpravodaj)
 Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s
reporterovým genem
 Využití dostupných dat ve veřejných databázích
 Tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese
 Kvantitativní analýza exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulace genové exprese v identifikaci funkce genů
přístupy získané funkce
 T-DNA aktivační mutageneze
 Ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese
 Chemická genetika
Osnova
47
47
 pojem chemical genetics – více než 50.000/235,577
záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008/19.11.
2020, nárůst >470%)
Chemical Genetics
 podobně jako v případě genetiky, existují i zde přístupy
„přímé“ a „reverzní“
 oproti přístupům „klasické“ genetiky není předmětem zájmu
gen ale protein
 chemická genetika se snaží identifikovat buď cílový protein
po chemickém působení a následných fenotypových změnách
(„přímá“ chemická genetika) nebo naopak chemikálie
schopné interakce s proteinem zájmu („reverzní“ chemická
genetika)
 za tímto účelem jsou prováděna vyhledávání v knihovnách
nejrůznějších chemických látek (tisíce položek, komerčně
přístupné)
 příklad: analýza endomembránového transportu u rostlin
48
 Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy
chemické genetiky
 v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům,
zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem
(viz film, GFP směřované do ER)
Chemical Genetics
48
49
 Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy
chemické genetiky
 v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům,
zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem
(viz film, GFP směřované do ER)
 endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem
při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů
Chemical Genetics
49
50
Anterograde
transport
Retrograde
transport
Trans-Golgi
network
Multivesicular
bodies-late
endosome
(prevacuolar
compartment)
Recycling
endosome
Richter et al., E J Cell Biol (2010)
Huang et al., 2010
PIN1-GFP
Endomembránový transport
In the figure, there is simplified scheme of vesicle trafficking pathways, regulated
by GNOM and its closest relative, GNOM-LIKE1 (GNL1).
Secretory and membrane proteins are synthesised at the ER (blue) and passed
onto the Golgi apparatus (green) by anterograde trafficking in COPII-coated
vesicles.
The retrograde route from the Golgi apparatus to the ER is regulated by the ARFGEFs
GNOM (GN) and GNL1, which regulate the recruitment of COPI coats to
the Golgi membrane. On the secretory route, proteins are transported to the
sorting station, the trans-Golgi network (TGN; lilac).
From there, proteins are either transported to the vacuole (grey) via
multivesicular bodies (MVB, also called prevacuolar compartment, PVC, which
corresponds to the late endosome; deep blue) or trafficked to the plasma
membrane (PM).
Plasma membrane proteins like the auxin efflux carrier PIN1 (red), which
accumulates at the basal PM at steady state, are continually internalised and
trafficked to the TGN, which resembles the early endosome (EE) in plants.
From the TGN, PIN1 is recycled to the plasma membrane via the recycling
endosome (RE; light blue). This pathway is regulated by the ARF-GEF GNOM.
50
51
Zouhar et al., 2004
chemická struktura sortinů
detekce vakuolárního fenotypu (tvaru tonoplastu)
kvasinek pomocí barvení specifickou barvou (MDY-64)
Imunodetekce karboxypeptidázy
Chemical Genetics
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu přístupy chemické genetiky
 pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek
byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S.
cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y),
která je normálně transportována pomocí
endomembránového transportu do vakuoly
 analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a
imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním
médiu pomocí monoklonálních
protilátek
51
52
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu přístupy chemické genetiky
 pomocí vyhledávání v „knihovně“ chemických látek
byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S.
cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y),
která je normálně transportována pomocí
endomembránového transportu do vakuoly
 identifikované látky („sortiny“) byly schopny vyvolat
obdobné změny i u Arabidopsis - konzervované
mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin
 analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a
imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním
médiu pomocí monoklonálních
protilátek
 pro bližší identifikaci molekulárního procesu
ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů“ byla
provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového
proteinu (AtCPY) – sortin 1 inhibuje specificky pouze
tuto sekreční cestu
 pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se
změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hyposenzitivní
mutanti)
Zouhar et al., 2004
tvar rostlinných vakuol pomocí EGFP:-TIP
fenotyp semenáčků v přítomnosti sortinů
Sortin 1
Sortin 2
Chemical Genetics
52
53
 Analýza mechanismů endomembránového
transportu pomocí chemické genetiky -
shrnutí
 GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly
(tonoplastu) a identifikace mutací
vedoucí ke změně morfologie
tonoplastu
 chemická genetika v kombinaci s
klasickou genetikou - identifikace
proteinů zúčastńujících se regulace
endomembránového transportu
 proteomické přístupy – identifikace a
analýza proteomu vakuol
Chemical Genetics
53
54
54
 Genová exprese je specifická v místě i čase
 Analýza časoprostorové specificity genové exprese
pomocí
 Transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reporterovým
genem (gen zpravodaj)
 Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reporterovým
genem
 Veřejně dostupné databáze často s buněčným rozlišením
 Kvantitativní analýza genové exprese
 DNA a proteinové čipy
 Next gen transkripční profilování
 Regulací genové exprese lze identifikovat funkci
genů - přístupy získané funkce
 K získání nových podmíněných fenotypů lze použít
chemickou genetiku
Klíčové koncepty
55
55
Diskuse