CORE022 – Biochemie v běžném život1 Farmakogenomika doc. Jan Lochman CORE022 – Farmakogenomika2 Farmakogenetika a genomika ̶ Vývoj celé řady léčiv byl řízen omylem (penicilin, paralen, viagra, atd.) ̶ Velký problém při vývoji léčiv je ADR (adverse drug reaction) – přibližně u 7% lidí ̶ Farmakogenetika – studium dědičných rozdílů v metabolismu léků ̶ Farmakogenomika – studium všech genů ovlivňujících odpověď na léčivo ̶ Interindividuální variabilita metabolismu léčiv je hlavní příčinou nedostatečné účinnosti a nežádoucích účinků léčiv. ̶ Celá řada léčiv metabolizovaných v játrech je metabolizována enzymy cytochromu P450 (CYP) = CYP1, CYP2 a CYP3 ̶ Geny kódující tyto enzymy jsou vysoce variabilní a v rámci populací vykazují značné rozdíly v jednotlivých alelách. CORE022 – Farmakogenomika3 Xenobiotikum (léčivo) Silně lipofilní Lipofilní Polární Hydrofilní 1. Fáze biotransformace aktivace/inaktivace oxidace, redukce, hydrolýza 2. Fáze biotransformace aktivace/inaktivace konjugační reakce Akumulace v tukové tkáni Polární Hydrofilní Extracelulární tekutiny – exkrece játry, ledvinami CORE022 – Farmakogenomika4 1. fáze biotransformace ̶ zavedení polární funkční skupiny do molekuly lipofilní látky - OH, -NH2, -SH, = CO, - COOH ̶ reakce 1. fáze biotransformace: oxidace, redukce, hydrolýza ̶ během 1. fáze biotransformace může docházet jak ke snížení tak ke zvýšení účinku (toxicity) léčiva ̶ Nejčastější reakce je oxidace katalyzovaná: - cytochrom P – 450 - alkoholdehydrogenáza - monoaminoxidázy a diaminoxidázy CYP3A4 CORE022 – Farmakogenomika5 2. fáze biotransformace ̶ Xenobiotikum (léčivo) se přes polární funkční skupinu navázanou v první fázi váže na vysokomolekulární endogenní konjugační činidlo ̶ Konjugát má obvykle menší biologickou aktivitu, vyšší rozpustnost ve vodě a vyšší molekulovou hmotnost než původní látka (metabolit z 1. fáze) ̶ Obvyklé konjugační reakce: konjugace s k. glukuronovou, sulfátová konjugace, glycinová konjugace, acetylace (Nacetyltransferáza), metylace, glutathionová konjugace (glutathion-S-transferáza) CORE022 – Farmakogenomika6 CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 CYP3A4 CYP2C2,3-epoxid 4,5-epoxid 9,10-epoxid 7,8-epoxid Fenoly 4,5-diol 9,10-diol 7,8-diol CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 7,8-diol-9,10-epoxid Glutathion-konjugáty GSTA1 GSTM1 GSTP1 DNA adukty 1-OH 3-OH 6-OH 7-OH 9-OH 9-OH-4,5-oxid 9-OH-4,5-diolDNA adukty B(a)P O OH OH OH OH O EHEH CYP1A1 CYP1A2 CYP1B1 EH Pokles aktivity má protektivní účinek Pokles aktivity nese vyšší riziko CORE022 – Farmakogenomika7 Oxidace alkoholu CH2CH3 OH ethanol CCH3 O H ADH (Alkohol dehydrogenáza) NAD+ NADH + H+ CCH3 O OH NAD+ NADH + H+ ALDH (Aldehyd dehydrogenáza) CYP2E1 Kataláza + H2O2 - H2O acetaldehyd k. octová CORE022 – Farmakogenomika8 Důležité CYP450 pro metabolismus léčiv ̶ Mezi nejdůležitější patří CYP2D6, CYP2C19 a CYP2C9 ̶ Jejich genetická variabilita vysvětluje velkou část variability v enzymatické aktivitě ̶ Podle enzymatické aktivity dělíme jedince na ultrarychlé, normální, střední a pomalé metabolizéry 9 Důležité CYP450 pro metabolismus léčiv CORE022 – Farmakogenomika CORE022 – Farmakogenomika10 Důležité CYP450 pro metabolismus léčiv Chemoterapeutikum Prekurzor dopaminu Statiny Statiny CORE022 – Farmakogenomika11 Metabolismus tamoxifenu Modulátor estrogenových receptorů používaný k prevenci rakoviny prsu u žen CORE022 – Farmakogenomika12 Typy mutací Tranzice GAACGT → GAGCGT Transverze GAACGT → GATCGT Missense mutace GAACGT → GATCGT Glu Arg Asp Arg Konzervativní substituce ACTCGT → TCTCGT Thr Arg Ser Arg Radikální nahrazení GATCGT → GCTCGT Asp Arg Ala Arg Nonsense mutace GAACGT → TAACGT Asp Arg STOP Inzerce GAACGT → GAAACGT Delece GAACGT → GACGT SNPs – jednobodové polymorfismy v rámci genomové DNA CORE022 – Farmakogenomika13 AmpliChip P450 ̶ Roche Diagnostics' 2D6/2C19 – první diagnostická analýza SNPs spojených s metabolismem léčiv pomocí DNA čipu ̶ FDA schváleno, 2004 CORE022 – Farmakogenomika14 Sekvenace lidského genomu ̶ v době počátku (rok 1990) monumentální úkol ̶ započat v roce 1990 za účasti DOE and NIH ̶ sekvenace prováděna pomocí kontigových map a BACs ̶ prvotní plán počítal s dobou trvání 15 let ̶ nakonec sekvenace pomocí Sangerovy metody téměř dokončena již v roce 2000 ̶ výsledná sekvenční mapa publikována 14. dubna 2003, 99.99% přesnost (National Human Genome Research Institute) ̶ celkové náklady projektu 3 miliardy dolarů ̶ v roce 2000 prezident Bill Clinton ujistil o nepatentovatelnosti lidské DNA https://https://www.genome.gov/25019885/online-education-kit-how-to-sequence-a-human-genome// CORE022 – Farmakogenomika15 Sekvenace dle Sangera – I. generace • Syntéza DNA in-vitro za použití “terminátorů“ – dideoxynukleotidů zabraňujících po svém začlenění do DNA její další elongaci. Deoxyribosa Dideoxyribosa • Vyžaduje použití iniciálního primeru, DNA polymerázy a směsi dNTPs se značenými ddNTPs • Nasyntetizované řetězce jsou poté separovány pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy nebo kapilární elektroforézy • Možnost plně automatizované separace za použití fluorescenčně značených ddNTPs CORE022 – Farmakogenomika16 Sekvenace dle Sangera – I. generace Throughput/Performance by Run Module XLRseq: 768 samples per day (690 Kbases) LongSeq: 1152 samples/day (980 Kbases) StdSeq: 2304 samples/day (1550 Kbases) FastSeq: 2304 samples/day (1600 Kbases) RapidSeq: 3840 samples per day (2100 Kbases) CORE022 – Farmakogenomika17 Celera Genomics Project ̶ založena vědcem Craig Venterem a v roce 1998 započala sekvenační projekt ̶ celkové náklady 300 mil. dolarů byly hrazeny plně s privátních zdrojů ̶ poprvé použita metoda „whole genome shotgun sequencing“ ̶ k analýze sekvenačních dat použit přístup vyvinutý Gene Myersem ̶ tento přístup však vyžadoval extrémní výpočtové požadavky ̶ finální výpočet prováděn na 7000 procesorech k získání 1000-násobné rychlosti oproti Pentium počítačům ̶ tento inovativní přístup dovolil dokončit sekvenaci již za 9 měsíců CORE022 – Farmakogenomika18 Silná role diplomacie It is hard to imagine today’s politicians reminding scientists that cooperation has as much value as competition. In 26 June 2000, US President Bill Clinton and UK Prime Minister Tony Blair presided over a carefully choreographed piece of scientific theatre. Through a video link connecting Washington DC and London, they announced to the world that scientists had completed a rough first draft of the human genome sequence. Craig Venter (vlevo), Francis Collins (uprostřed), Bill Clinton (vpravo) CORE022 – Farmakogenomika19 Sekvenátory II generace Vzorek DNA – fragmentace (Covaris, fragmentáza) Začištění konců (DNA polymeráza) Ligace adapterů (ligáza) Výběr fragmentů dle velkosti (SPRI) Amplifikace fragmentů Sekvenace (Illumina, IonTorrent) CORE022 – Farmakogenomika20 Sekvenátory II generace (Illumina) Novaseq Miniseq CORE022 – Farmakogenomika21 Sekvenátory III generace ̶ Základem technologie jsou nanopóry ̶ Na začátku sekvenace je NK navázána na nanopór tvořený proteinem ̶ Poté je rozpletena a prochází přes nanopór, což generuje změnu proudu ̶ Na základě pozorované změny jsou odečítání v reálním čase jednotlivé báze ̶ Umožňuje sekvenaci velmi dlouhých úseku (desítky až stovky kilobází) ̶ Nevýhodou je vyšší chybovost, správnost >95%