Experimentální a aplikovaná toxikologie a ekotoxikologie– hodnocení křivek dávka-odpověď Jiří Novák Závislost dávka-odpověd •Na řadě úrovní •Molekulární úroveň (receptory, kanály,…) •Organismální (odpověď ano/ne, kontinuální škála) •Populační • http://uploads.webflow.com/5318f33ba240be9d1000000f/532c6f5119388d646e00006a_Patch%20Clamp%20pic.pn g http://o.quizlet.com/HXkWjfli4HADYmUMtYyo4A.jpg Křivky dávka-odpověď •Dávka vyjádřena např. mg/kg živé váhy, nebo mg/l •Řada důležitých údajů: •Prahová hodnota toxicity/dávka bez toxických účinků (pro nekarcinogenní účinky) •Dávka vyvolávající plný efekt (např. 100% toxicitu) • práh? dávka •Je možné se otrávit vodou? •10 g kofeinu vyvolává křeče a zvracení (1 šálek kafe ~ 150 mg kofeinu) •NaCl ~ 250g smrtelná dávka •Způsob redukce křivky na jediné číslo: • •LD50 (střední letální dávka; lethal dose) dávka, která zabije 50 % populace v testu •LC50 (střední letální koncentrace; lethal concentration) koncentrace, která zabije 50 % populace v testu • •ED50 (střední efektivní dávka; effective dose) dávka, která vyvolá 50% účinek u pokusného modelu •EC50 (střední efektivní koncentrace; effective concentration) koncentrace, která vyvolá 50% účinek u pokusného modelu Křivky dávka-odpověď Křivky dávka-odpověď práh? Dávka 100% 50% LD50 = 50% jedinců exponovaných dané koncentraci zemře (expozice per os) mg/kg LC50 = 50% jedinců exponovaných dané koncentraci zemře (vodní organismy, expozice vzduchem) mg/l nebo mg/m3 LC/LD50 LC/LD100 Prahová dávka – první výskyt toxicity, překonání kapacity organizmu detoxikovat/opravit poškození Křivky dávka-odpověď Důležité parametry křivky ØPotence- toxicita/efektivita ve srovnání s jinými látkami ØEfektivita/maximální efekt ØSklon křivky (slope) ØVariabilita - Data po normalizaci (% maximální odpovědi) Normalizovaná data po zlogaritmování koncentrace zkoumané látky Surová data Normalizace dat •Normalizovaná hodnota •Škála 0-1 nebo 0-100% •Indikuje softwaru, kde čekat horní a dolní asymptotu křivky dávka odpověď • Normalization Formula | Step By Step Guide with Calculation Examples •X normalized normalizovaná hodnota •X surová data k normalizaci •X minimum – průměrná data z kontroly (solventové, negativní) •X maximum – průměrná hodnota dat maximální odpovědi referenční látky či • • Obsah obrázku text, bílá tabule Popis byl vytvořen automaticky 1. Způsob hodnocení -Lineární regrese •Proložení exponenciálního modelu lineární částí křivky dávka-odpověď v excelu •jednoduchý ale nepřesný •Vhodný pro odhad EC50 u „hezkých“ křivek •Nevhodný pro odhad EC10 či EC20 (oblast křivky, která se odchyluje od linearity) • 100% 2. Způsob hodnocení –probitová transformace •Probitová transformace linearizuje křivku a umožňuje snazší odhad EC50 •jednoduchý ale ne vždy přesný – vychází z normálního rozložení citlivosti •Vhodný pro odhad EC50 u „hezkých“ křivek • Tabulka pro probitovou transformaci 3. Způsob hodnocení – Nelineární regrese (logit) •– zahrne celou křivku dávka-odpověď, pokryje i okrajové části, je zpravidla lepší/spolehlivější, hlavně pokud počítáme hodnoty blízko okrajových částí křivky (EC20, EC80 –kde je větší pravděpodobnost odchylky od linearity) •Důležité je, jak podrobně je proměřená křivka dávka odpověď ! •více bodů – lepší regrese •Je třeba specializovaný nástroj (GraphPad Prism; R; …) • GraphPad Prism – •Dostupná 30 denní zkušební verze Výsledek obrázku pro r GraphPad Prism 5 –odhad EC50 GraphPad Prism –odhad EC50 •Create a new data file •New Project File •XY •Y: Enter 3 replicate values … (v případě triplikátů) •Create • •Vložíme data: •X – koncentrace testované látky/vzorku (v log formě (log C)) •A, B,… Datové sady (opakování jsou vedle sebe (triplikáty))- vložit normalizovaná data •POZOR popisujte všechno, aby tomu rozuměli i ostatní GraphPad Prism –odhad EC50 •Analýza: •XY analyses •Nonlinear regression (curve fit) •Log(agonist) vs normalized response GraphPad Prism –odhad EC50 1 2 3 GraphPad Prism –odhad EC50 GraphPad Prism –NOEC/LOEC GraphPad Prism –NOEC/LOEC •Porovnání statisticky významného rozdílu mezi daty •T-test – porovnání dvou datových sada •ANOVA – analýza rozptylu mezi 3 a více sadami dat •! Data musí mít normální rozložení a homogenní rozptyl napříč daty! •Pomocí post-hoc testu identifikujeme, mezi kterými kategoriemi jsou rozdíly GraphPad Prism –NOEC/LOEC Porovnání statisticky významného rozdílu mezi daty * * * * koncentrace C1 NOEC nejvyšší koncentrace s nevýznamným efektem C2 LOEC nejnižší koncentrace s významným efektem •