Karel Souček Biofyzikální ústav AV ČR, Masarykova Univerzita, FNUSA-ICRC Průtoková cytometrie a sorting Tyto částice mají něco společného … Algae ChromosomesBlood cells Protozoa … určité parametry těchto částic mohou být měřeny pomocí průtokové cytometrie. Komerční zařízení a vývoj Cytometry Publications/Year Data taken from Years 197619771978197919801981198219831984198519861987198819891990199119921993199419951996199719981999200020012002200320042005200620072008200920102011201220132014201520162017 No.Papers(MEDLINE/PubMed,log) 0 1 10 100 1000 10000 100000 1000000 flow cytometry confocal microscopy all Co je průtokový cytometr? Signal processing time analogsignalintesity VOLTAGE FSC ~ cell size FL-1 (530/30nm) ~ green fluo. FL-2 (585/42nm) ~ red fluo. Analog/digital conversion Height Width Area ( ∫ ) FL- (H, W, A) FL-1(H) FL-2 (H) dot plot 0 1000 1000 Zesílení signálu (!) lin nebo log K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? Počítat částice v suspenzi Oddělit živé částice od neživých Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu Kvantifikovat rozptyl světla, a intenzitu fluorescence pro jednotlivé buňky (částice) Fyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 new automatic cell cloning assay (ACCA) for determination of clonogenic capacity of CSCs single cell/well up to 384 well plate re-culture after sorting (2D, 3D) analysis: CyQuant, ATP, xCelligence, microscopy Jaké jsou principy?  Rozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy  Detekce specifické flurescence  Hydrodynamicky zaostřený proud částic  Elektrostatická separace částic  Možnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Stain Your Own Cell Historie barvení biologických materiálů Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení svalových buněk www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Rozptyl světla Hmota rozptyluje světlo vlnových délek které není schopna absorbovat Viditelné spektrum je 350-850 nm proto malé částice a molekuly (< 1/10 λ) spíše viditelné světlo rozptylují Pro malé částice byl popsán tzv. Rayleightův rozptyl (scatter) jehož intenzita je ~ stejná všemi směry Rozptyl větších částic charakterizuje tzv. Mieův rozptyl. Jeho množství je větší ve směru v jakém dopadá světlo na ozářenou částici  na tomto principu je založeno měření velikosti částic pomocí průtokového cytometru Shapiro p.106http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/atmos/blusky.html George Gabriel Stokes (1819 – 1903) Anglický fyzik a matematik působící na univerzitě v Cambridge http://www.nndb.com/people/131/000097837/ 1852 – popsal fluorescenci Název vznikl z anglického slova fluospar (fluorit, kazivec = nerost CaF2) - ke svému pozorování použil roztok chininu, jako zdroj světla sluneční paprsky, jako excitační filtr sloužilo tmavě modré okenní sklo a jako emisní filtr byla použita sklenice bílého vína G. C. Stokes „On the Change of Refrangibility of Light“ Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1852, vol. 142, p. 463.) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční spektra Fluorescenční proces je cyklický. Kromě fluorochromu nevratně zničeného (photobleaching - „vysvícení“) může být opakovaně excitován. Excitation of a fluorophore at three different wavelengths (EX 1, EX 2, EX 3) does not change the emission profile but does produce variations in fluorescenceemission intensity (EM 1, EM 2, EM 3) that correspond to the amplitude of the excitation spectrum. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce fluorescence Vybavení pro fluorescenci (1) zdroj excitace (2) fluorochrom (3) vlnové filtry pro izolaci emitovaných fotonů od excitovaných (4) detektory pro registraci emitovaných fotonů Fluorescenční přístroje - spektrofluorometer měří průměrné vlastnosti objemu vzorku v kyvetě. - fluorescenční mikroskop popisuje fluorescenci jako jev v prostorovém systému souřadnic - flow cytometer měří fluorescenci v proudícím toku, umožňuje detekovat a kvantivikovat subpopulace uvnitř velkého vzorku Fluorescenční signál - spektrofluorometer je flexibilní, umožňuje měřit v kontinuálním spektru excitačních a emisních vlnových délek - flow cytometr potřebuje fluorescenční značky excitovatelné určitou vlnovou délkou. Fluorescence pozadí - endogení složky - autofluorescence - nenávazané nebo nespecificky vázané značky = reagenční pozadí Vícebarevné značení - dvě a více značek, zároveň monitoruje různé funkce - nutné: vhodně zvolit značky zdroj excitace a separační filtry K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescence Output of Fluorophores Comparing Different Dyes F-actin ~ BODIPY FL phallacidin anti-ß tubulin ~ Texas Red goat anti–mouse IgG DNA ~ DAPI Mouse 3T3 λ Hind III propidium iodide K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Technické součásti Zdroje světla Detekční systémy Fluidní systém Separace Sběr dat Analýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Wallace Coulter Wallace Coulter - Coulter orifice - 1956 (patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Originální patentová aplikace W.Coultera 1953 Photo by J.Paul Robinson J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jak počítat buňky? Hemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 Rozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200 Leukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky Statistická chyba: koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% chyba pipetování a ředění je ~ 10% Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Roche Innovatis Cedex Coulter Counter První komerční verze CC Coulter Counter © CC Beckman Coulter Multisizer™ 3&4 COULTER COUNTER® Roche Innovatis CASY TT Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970). Technické součásti Detekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní 4-8 (12-18) Diody detekce rozptylu světla (light scatters) Zdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Mack Fulwyler- sorter Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Richard Sweet Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Mack Fulwyler- sorter Mack Fulwyler- sorter K. Souček K čemu to všechno je… například… K čemu to všechno je… například…  43 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO)  ročně zemře ~ 2 miliónu lidí na HIV/AIDS (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků)  kvantifikace CD4 T lymfocytů je klíčový parametr při monitorování léčby  Průtoková cytometrie je „zlatý standard“  Optimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250 vzorků / den)  Aydogan Ozcan: „Kill the cost, safe live“ Způsoby pro zobrazení dat K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 color 4 color 5 color Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ upraveno podle J.P.Robinson Cell tracking and proliferation Approaches Cell cycle analysis DNA synthesis analysis Cell tracking Buněčný cyklus • One of the oldes application of flow cytometry, analysis of the cells in cell cycle phases based on the quantification of DNA • flow cytometry is convenient method for quick and relatively precise determination of cell cycle • DNA is simply labeled using fluorescent dye specific for DNA • Propidium iodide • 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - fluorescence increases after binding to DNA. Membranes have to be permeabilized. • Hoechst 33342 • Vybrant® DyeCycle™ • DRAQ5 • Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - labeling of live cells (possible cytotoxicity) Cell cycle analysis G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2M DNA Analysis DNA content C o u n t 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Cell cycle histogram: how to analyze? It is not recommended to statistically analyze it using simple gating in the histogram It is necessary to use software tolls for modeling of distribution of cell cycle phases Channels 0 50 100 150 200 250 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Analysis of synchronized cells Analysis if BrdU incorporation  Bromodeoxyuridin (BrdU) is incorporated into DNA instead of thymidine during S-phase  BrdU is detected using specific antibody after the fixation and partial denaturation of DNA (acid, DNAse)  DNA can be stained in the last step Analysis if BrdU incorporation File: HL60 K/24h Region % Gated R1 100.00 R2 35.48 R3 10.25 R4 47.87 R5 1.32 R4 R2 R3 R5 Click azide/alkyne reaction Click-IT (Invitrogen) applications analysis of DNA synthesis (EdU - 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine) Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT™ EdU Click-iT™ EdU Click-iT™ Edu • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Flow cytometry most common application Viability assays (propidium iodid, CalceinAM, …) Proliferation (BrdU, EdU, mitosis - pH3) DNA damage ( yH2AX,…) Cell Death analysis (AnnexinV, Cleaved Caspase3, …) Cell Cylcle (DNA content, Cell cycle modulation after treatment) Immunophenotype characterisation of the cells (CSCs markers, differentiation, …) Example of final set-up Parametr Marker Fluorochrome Cell Surface Marker CD44 APC/Cy7 Cell Surface Marker Trop-2 AF488 Viability LIVE/DEAD kit Yellow DNA synthesis Click-iT EdU AF647 Cell Cycle DNA content PO-PRO-1 DNA damage yH2AX PE Apoptosis Cleaved Caspase 3 AF494 Example of final results (DU-145) Viability and Immunophenotype Cell cycle and Proliferation Example of final results DNA damage and Apoptosis The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescent proteins bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - jellyfish Blue bioluminescence. Ca2+ interacts with aequorin photoprotein. Blue light excites green fluorescent protein. Renilla reniformis – coral luminescence appears after degradation of coelenterazine in the presence of luciferase enzyme. Blue light excites green fluorescent protein Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescent proteins Osamu Shimomura 1961 discovered GFP and aequorin http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Science. 1994 Feb 11;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescent proteins  Douglas Prasher  Martin Chalfie Fluorescent proteins http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Roger Tsien ~ 2002 – mutated FP = wide spectrum of colors http://www.tsienlab.ucsd.edu/ Channels 0 50 100 150 200 250 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Channels 0 50 100 150 200 250 Analysis of synchronized cells Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Nature Methods - 5, 283 (2008) Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 S, G2, M- SCFSkp2 Fucci http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html CONTROL SCH900776 MU380VEHICLEGEMCITABINE Summary DNA analysis Require fine sample preparation, debris elimination, sw tool for precise analysis of histograms It is possible to combine with analysis of other parameters e.g. DNA synthesis Cell division enumeration Mostly for synchronized populations Fluorescent proteins Fucci – elegant tool for in vitro a in vivo experiments Trendy: instrumentace Spectral flow cytometry J.P. Robinson, Purdue University Spectral flow cytometry Conventional vs. spectral analysis Single Cell Mass Cytometry Cells were covalently labeled with a bifunctional compound, maleimido-mono-amide-DOTA (mDOTA). This compound can be loaded with a lanthanide(III) isotope ion, and reacts covalently with cellular thiol groups through the maleimide moiety. Single Cell Mass Cytometry Seven unique lanthanide isotopes were used to generate 128 combinations, enough to barcode each sample in a 96-well plate. The seven lanthanide isotopes, their masses and their locations on the 96well plate are shown. Personální systémy Trendy: Reagencie PrimeFlow™ RNA Assay Briliant Violet polymers Shrnutí přednášky průtoková cytometrie: nabízí široké spektrum aplikací; rychlý způsob analýzy a separace heterogenních populací; separace populací; multiparametrové analýzy