Počítání krevních buněk
Principy hematologických analyzátorů
Bourková L., OKH FN Brno
Hematologické analyzátory
• každý má svá jedinečná specifika
• dva základní principy měření:
– optický
– impedanční
• z měření získáváme informace o:
– počtu buněk (kvantitativní analýza)
– velikosti, tvaru a složení buňky (kvalitativní analýza)
• principy měření mohou být na jednotlivých
analyzátorech různě kombinovány
• různé kombinace pak umožňují různě přesnou
kvantitativní i kvalitativní analýzu všech prošlých
buněčných elementů
Principy měření
• absorbční spektrofotometrie
• impedanční analýza
• optická analýza
Poznámka: dle typu analyzátoru lze počítat i více jak 10.000 buněk
Používaná diagnostika
• analýza nesrážlivé periferní krve
– odběr krve do solí EDTA (K, Na)
• ředící roztoky (isotonické roztoky)
– impedanční analýza
vodivý roztok + nevodivá buňka
– optická analýza
opticky inaktivní roztok + opticky aktivní buňka
• lyzační roztoky
hemolýza erytrocytů a dle typu analyzátoru může být
i destrukce jiných krevních elementů
• barvící roztoky
barvení obsahu buňky (granula/enzymy, DNA, RNA)
• čistící roztoky
čištění měřícího systému
Absorbční spektrofotometrie
• Metoda slouží ke stanovování množství
hemoglobinu ve vzorku (cca. λ = 540 nm)
(bezkyanidové metody)
Impedanční analýza - I
• mezi elektrodami je v apertuře standardní vodivost
(vodivost zajišťuje diluentu)
• buňky jsou v jedné kyvetě suspendovány diluentem (s katodou) →
pomocí vakua jsou nasávány malým otvorem (aperturou)
do druhé kyvetky s diluentem (s anodou)
• obě kyvety jsou přes aperturu propojeny vodivým diluentem
• při průchodu buňky aperturou se vodivost naruší/změní: vzniká
impedanční impulz
• četnost impulzu  počet buněk
velikost impulzu  velikost buňky
Impedance RBC and Platelet
 Cells hydrodynamically
focused
 Voltage changes measured
 Passage of cell through the
aperture generates a pulse
 Cell size determined from
pulse amplitude
 RBCs separated from
Platelets by moving
threshold
Impedance technology
Ohm’s Law: V = R x I (constant)
Voltage = Resistance (impedance) x Current
 
V = R x I
 
V = R x I
Impedanční analýza - II
• měření může být doplněno vysokofrekvenční analýzou:
– na stejnosměrné elektrické pole
– je superponováno vysokofrekvenční střídavé elektrické pole
– to pronikne cytoplazmou
– pak se změří vysokofrekvenční vodivost buňky
– ta odpovídá její fyzikálněchemické struktuře
(kvalitativní analýza buňky)
Hydrodynamická fokusace
• využívá unášení jednotlivých buněk proudem dilučního
roztoku
0 Customer Training
dynamic Focusing
Hydrodynamic
Focusing with
Diluent Sheath
8psi
Cells
Aperture
o columns of
ifferent
ents the
uted sample
ow of cells
ng zone
nto single
nsing zone
ects
Optická analýza
• využívá se průtoková cytometrie:
(spolu s hydrodynamickou fokusací)
– každá buňka je ozářena monochromatickým laserovým
paprskem
– po interakci buňky s paprskem se provádí analýza
– analyzuje se samostatně každá buňka v suspenzi
• detekuje se světlo:
– prošlé
– odražené
– depolarizované
– fluorescence
Laser →
Detekce optické analýzy
Analýza prošlého světla
• Detekce paprsku ve směru 0° udává hodnoty:
– počet prošlých buněk
– velikosti jednotlivých buněk
Analýza odraženého a depolarizovaného světla
• Detekce paprsků v různých úhlech (dle typu analyzátoru).
• Analýza může být doplněna cytochemickým
barvením buněk.
– Roztok se substrátem (např. 4-chlor-1-naftol) barví v
leukocytech enzym peroxidázu.
• Reakcí enzymu se substrátem vznikají v buňce barevné
intracelulární sraženiny, které ovlivňují úbytek světla a rozptyl
paprsku.
• Měření slouží k detekci tvaru a velikosti buňky, jádra
a granularity cytoplazmy
Analýza fluorescence
• Obarvení buňky speciálními barvami → ozáření
buňky laserovým paprskem.
• Absorbce světla buňkou → emise světla o vyšší
vlnové délce → detekce emitovaného světla
• Detekce: DNA, RNA nebo povrchové antigeny
(CD znaky).
®
Fluorescence
Red fluorescence is a measurement of the amount of
DNA stained by the dye.
Axial light loss (0º) measures cell size.
NRBC WBC