u Twins med cat Mutant plant Barr body Epigenetic biology Vývojová genetika 2023 hü «. v* 1 Polytene chromosomes Blood smear Epigenetika - definice Studium dědičných mitotických (a meiotických) změn v genové expresi, která se vyskytuje beze změny v primární struktuře DNA M book Epigenetic mechanisms of gene regulation it Robert A Martienssen, Arthur D Riggs, Vincenzo Ettore Aldo Russo H Published in 1996 in Cold Spring Harbor NY) by Cold Spring Harbor laboratory • Ostatní definice nezahrnují nutně epigenetickou dědičnost mitotickým dělením GENETICS mutations inherited germ line species EPIGENETICS I alterations mod rempdeler stable? soma variability Epigenetika jako „vědecký jazyk Mlív'IN DNA GENOVA EXPRESE < > RNA ■ HUMAN EMBRYO AND FETAL DEVELOPMENT Fertilized egg 2-cell stage lA-cell stage Foetus-4 weeks ^ protein NEURON Hemoglobin Dopamin + Myoglobin - o o ČERVENE KRVINKY Hemoglobin + Dopamin -Myoglobin - SVALOVÉ BUŇKY ^^^•^> Hemoglobin -^— "^^r Dopamin - Myoglobin + Epigenetika jako „vědecký jazyk" HUMAN EMBRYO AND FETAL DEVELOPMENT Ľ > DNA GENOVÁ EXPRESE < > RNA ■ Fertilized egg 2-cell stage ló-cell stage Foetus-4 weeks ^ protein • Aktivita specifických transkripčních faktorů • Epigenetické modifikace na úrovni DNA a histonů Čeština využívá 42 písmen (26 latinka), epigenetika v přeneseném slova smyslu funguje stejným principem jako znaménka a formátování textu. Epigenetika jako „vědecký jazyk" a znaménka v cestine? Epigentickemodifikacemohoubytpovazovanyzaznamenkaneboznackyvg enomuaneznalostvyznamutohotojazykajevyzvyvajiciprovsechynzacinaji • Epigenetický kód slouží jako: • Formátování/styl textu (=aktivita nebo represe genu) • definuje mezery mezi slovy (=vyznačuje začátek nebo konec genu) • Definuje znaménka a tedy i význam slov (=jak a kdy mají být geny čteny) • Definuje kapitoly a odstavce (=struktura chromatinu a potažmo celého chromozomu) civedce NEURON Hemoglobin = epigenetický umlčen Dopamin = epigenetický aktivní Myoglobin =epigeneticky umlčen SVALOVÉ BUŇKY Hemoglobin = epigenetický umlčen Dopamin = epigenetický inaktivní Myoglobin = epigenetický aktivní Epigenetická informace jako „epigenetický" krajinný model Differentiation trajectory Epigenetic landscape DNA methylace Genově specifická exprese Buněčná diferenciace Modely ke studiu epigenetických jevů Umlčení X chromozomů mammals Poziční efekt (PEV) Polycomb Drosophila Epigenetická regulace zárodečné linie C. elegans S.cerevisiae Epigenetická kontrola chromatinu OS.pombe Genové umlčování epigenetic model organisms Epigenetické obranné mechanismy . )Neurospora Meiotické umlčování RNAi DNA a histonová methylace Imprinting Paramutace TE genové umlčování maize Chromatin v somatických a Tetrahymena generativních buňkách RNAi DNA a histonové epigenetické regulace Arabidopsis EPIGENETICKE JEVY PŘEDSTAVUJI VÝJIMKY Z MENDELOVYCH ZÁKONŮ Samostatnost alel. Genotyp je soubor samostatných genů určujících znaky. Každý je znak je určen dvojicí samostatných alel. Segregace alel. Princip NEZÁVISLÉ SEGREGACE ALEL : dvojice samostatných alel se při meióze rozcházejí a každá gameta dostává jednu z obou alel Nezávislá kombinace alel. (s výjimkou alel ve vazbě) IDENTITA RECIPROKÝCH KŘÍŽENÍ, (při vzájemném křížení homozygotních rodičů (P) vzniká první filiální generace (Fl) potomků, kteří jsou genotypově i fenotypově jednotní. Zákon o štěpení v potomstvu hybridů. EPIGENETICKÉ JEVY PŘEDSTAVUJÍ VÝJIMKY Z MENDELOVYCH ZÁKONŮ Alely se mohou podrobovat vzájemným interakcím, které mají za následek dědičnou změnu jejich exprese : PARA MUTACE, TRANSVEKCE Některé genomy, chromosomy či lokusy jsou v průběhu gametogeneze sex-specificky reverzibilně modifikovány, což vede k jejich umlčení ve filiální generaci : PARENTÁLNÍ IMPRINTING Para mutace a její funkce Paramutabilní alela - alela, která je exprimována paramutable paramutagenic (1) Paramutagenní alela -umlčená alela, která je schopna ovlivnit (umlčet) druhou alelu Paramutace a její demonstrace u různých modelových organismů :íxl R-st/R-st I R-r/R-r Akumulace anthocyaninu v obilce kukuřice v případě rl lokusu (paramutabilní R-r a paramutagenní R-st) nebo v případě celé rostliny lokusu bl (paramutabilní B-l a paramutagenní B') i R-st/R-r^ r/r R-st/r R-r*/r X Kit""'W/+ I +/+ puramutalion KiťmlA"/+ Kit* (+/+) B Spontaneously ^Jg ^wf ~JĹ> (0.1-10%) ">|^- * ^T, B' \ B-l B/B- B-l B VB'* Slllf/Stllf lethal +/sulf seeclliii" Kil* X +/+ sulf/sulf sector +/sulf plant Kit lokus (tyrosine kináza receptor) - paramutabilní + a paramutegenní KittmlAlf Sulf lokus způsobující nedostatek chlorofylu (paramutabilní + a paramutagenní sulf) Pilu 2011 Transvekce - funkce a definice • Edward Butts Lewis • získal Nobelovu cena 1995 za práci na modelu Drosophila a objevení transvekce na bithorax komplexu "Operationally, transvection is occurring if the phenotype of a given genotype can be altered solely by disruption of somatic (or meiotic) pairing. Such disruption can generally be accomplished by introduction of a heterozygous rearrangement that disrupts pairing in the relevant region but has no position effect of its own on the phenotype" • Popsána u lidí, myší, rostlin, nematod, hmyzu a hub Viets et al. 2019 Transvekce - molekulární mechanismus Step 1: Pairing Physical proximity Constitutive pairing Cell-type-specific pairing Strong vs. weak pairing cell types Cell type 1 Cell type 2 Button regions drive homologous chromosome pairing in Drosophila insulator ^^luster TAD TADs and insulators are associated with buttons Strong pairing cell type Weak pairing cell type Transgene: 1 button Chromosome: i Many buttons t PAIRING NO PAIRING PAIRING PAIRING Viets et al. 2019 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy • DNA methylace • RNA interference • Histonové modifikace Methylace DNA • CH3 skupiny jsou umístěny na velké jamce dsDNA • Proteiny jako transkripční faktory, které se mohou vázat na DNA mají často kontakt právě ve velké jamce DNA Prokhortchouk a Defossez 2008 Mechanismus DNA methylace - de novo methylace a udržovací methylace ONA Methyltrans f erase (ĎNMTs) SAM SAH cytosine N O 3 i r^H2 CH3 5-methylcytosine DNA Glycosylase Lyase (Ďemethylase) SAM: S Adénosyl methionine SAH: S Adénosyl Homocysteine MO,-0 Methyl cytosine TTCGCCGA TAA DNA replication G =0= G C DNA melhylation Hemimethylated template =0= G DNA replication CTT3 Cm G L_ Í u -IT1 G G , n -IL, nr G "TP G =0= 'TP L G DNA melhylation Active si RNA or chromatin signal G -in G Chen et al. 2005 De novo methylace, u živočichů DNMT3a Udržovací methylace, DNMT1 Přímý vztah mezi metabolismem a DNA methylací (metabolom x epigenom) ĽASd-Ci Kyselina listová Acidum folicum 800 pg denní dávka Pro zdravy pnibéh téhotenstvi S.10CH, THF NADP' MADPH NAO(H| MctSo NA0(P)H ROS.NO SAM ^ ""{C^C'*' SAH \ X f f MO /f/r SAM je prekurzor všech epigenetických modifikací vyžadující methylovou skupinu • DNA methylace • Methylace lysinových residuí • Methylace argininových residuí SAM cyklus - cyklus produkující, „konzumující" a regenerující SAM molekuly Folátový cyklus - produkce vitamínu B, regenerace DNA a genetického materiálu Důkaz vztahu mezi DNA methylací a metabolismem - Agouti variable methylation region Agouti gene |- female yellow mouse (agouti gene unmethylated and active) diet supplement during pregnancy and nursing with additional methyl groups methylated agouti mftNA briefly mad* during development agouti 9*0» a . . producing ir KNA egoutigene remainder 0*movieMe. eoouthemousefeeipan. heeWiy mouse with brown hr mouse with yelow fur. develops obatity and diabetes during ad Jlhood Offspring mostly brown and healthy; agouti gene methylated and silenced Offipring mostly yellow and unhealthy; agouti gene unmethylated and active Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí a Mouk DNA methylation (fungi for example. Neurospora crassa) b Mosaic DNA methylation (plants, for example. Arabidopsis tMiono) C Mosaic DNA methylation (animals, for example. Gono mteitmola) d Global DNA methylation (animals, for example. Homo sapiens) • Global DNA methylation (plants, for example. Zca mays) Množství repetic Genomově specifická methylace (např. X inaktivace) 999999 9 CpG island OH T t t t gene íntergenic repetitive f Ion1 cut • CpG ostrůvky-většinou nemethylovány (u rostlin v malé míře) • Mezigenové oblasti-většinou methylovány • Repetitivní oblasti-většinou methylovány Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou enomů a jejich velikostí LD rsi O no O LD rsi LD 100 SO 60 40 ' 20 0 Arabidopsistbaliana Arabidopsis thatiana O o LD O LD LD upstream ^^ene^ downstream 100 SO 90 70 60 i>0 Danio rerio upstream ^^peaj downstream 100 au 60 40 20 0 Papufustrichacarpa Popuíus tricbocorpQ IVIus musculus upstream ^^enej downstream 100 90 ao 70 60 bO Mus musculus ■ - upstream | repeat J downstream Feng etal. 2010 Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí, ale existují i druhově-specifické rozdíly! • Včela medonosná má 5 - 8% TEs v genomu, s relativně větším počtem LIR bez protein-kódujících sekvencí (přesto tyto LIR jsou stále zachovalé), podobně i Chlamydomonas obsahuje pouze 15 - 20% TEs v celém genomu • Včela rovněž má i nižší procento genů s imunitní odpovědí, které jsou naopak kompenzovány velmi uspořádaným sociálním životem a hierarchií Coelomata Chordata Euteleostomi Viridiplantae Magnoliophyta Rosids CG CHG CHH Apis mefiifera 0.93% 0.26% 0.17% Ciona intestinafis 31.1% 0.17% 0.12% Mus musculus 74.2% 0.30% 0.29% D arito rerio 80.3% 1.22% 0.91% Chiamydomonas reinhardtii 5.33% 2.59% 2.49% Oryza sativa 59.4% 20.7% 2.18% Arabidopsis thaliana 22.3% 5.92% 1.51% Populus trichocarpa 41.9% 20.9% 3.25% Feng et al. 2010 DNA methylace se liší mezi geny a transpozony (H = T. A or C) Gene bodies Arabidopsis leaves T 5' CHH 3' 3* GHH 5- @ Transposable elements and repeats 100 3? 80 60 40 20 o 3 Chromosome 2 CG CHG CHH centromere 10 15 Mb Adapted from Cokus et al . Nature 2008 Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí, u rostlin však odpovídá i množství TEs Genomic landscapes in plants ISOOOMb r>04 CO •MOnuiMwl try tain non lltlltl-i Gana number remains constant In plants 1 !..-.•:■ Umlčení repetic = stabilita genomu a potlačení škodlivých inzercí human maize arabidopsis ľEs : 45% TEs : 85% TEs : 17% Retrotransposons ONA transposons Non transposons • S větší procentem repetitivní DNA roste úměrně množství inaktivního chromatinu (dříve fakultativní heterochromatin) a tím se mění i chromozomální distribuce epigenetických značek gbM kont rove rze a vliv na genovou expresi Negative Positive gbM je hypotetický pozitivní regulátor genové exprese = pokud není methylace rozmístěna mezi promotory a cis-regulačními oblastmi • Může regulovat pre-mRNA splicing • Ovlivňuje pool aberantní mRNA • Může chránit geny před TE inzercí Muyle et al. 2022 Unmethylated gene (a) >■ - r m 10 (c) < o -z. \ en _c Species 1 Species 2 Species 3 p- (d) Abefranl TSS TSS Aberrant TTS TTS c O tu < A Defiant antisense TSS Normal pre-mRNA 1 Aben Ipre-m Aberrant RNA (e) TSS Exon 1 ■ -. 3'UTR Exon 2 I— I— Gene OD o — i/l O. & l/l >- OJ _ - o (f) — l/l > ,0J Normal mRNA Aberrant mRNA Exon 1 Exon 2 Exon 1 Retained Exon 2 . intron Deleterious TE insertion Gene body methylated gene CG methytation T T T TTT TT TT T T ♦ TT f T TT ■Ail n Species 2 L* ytř) Species 3 |~* /mv T ' T T'T TT 'T T ' T" TT 'T T ■ -j— Gene Normal pre-mRNA r—" Intron 5' UTR T TTT T........T TTT T 3' UTR I -1- Exon 1 I "T ' TTT Ex0n 2 1- I Gene Exon 1 Exon 2 ■ T TTT T........T TTT T Exonl ""*" *'* Exon 2 f Specifita DNA methyltransferáz - divergence rostlin a živočichů Plant DRM2 Mouse DMMT3B Plant MET1 Mouse DMMT1 [ DMAP Binding Plant DNMT2 Mouse DNMT2 CMT3 (plant-specific) ■ UBA2 III V UBA1 U B A3 VI IX X I II IV III V X nnnnnn—mr P'vVVVP C-RICH III IV VI IX L?.V- BAH ZF BAH BAH IV VI VIII BAH □ N-terminal domains I Methyllransferase domain Chen et al. 2005 • DOMAINS REARRANGED METHYL TRANSFERASE (DRM) -methylace CHH • METHYLTRANSFERASE 1 (MET)-methylace CG • CHROMOMETHYLASE (CMT) - methylace CG • DNA methyl transferase (DNMT)- methylace CG(?) =Specifická pouze pro rostliny Methylace cytosinu se liší u e u ka ryot i c kých genomů, odpovídá i zmiňované struktuře genomu Dočtena Fungi f Protozoa Nematodes Animals fs/iotojoo Insects Mammals Plants DNA methylation Described £ coli MR systems De novo Maintenance N. crassa Yes Oim2 Dim2 5. pombe No T. brucci Yes - - C. elegance NO A. meIhf er a Yes Dnmt3 On mtl. 1 Uhrfl |d. mela no gaste r No | - Dnmt3a Onmtl Uhrfl M. m us cuius Yes Dnmt3b Dnmt 31 Metl A. thationa . Yes Drm2 Cmt3 Drm2 Nedetekovatelná 5mC methylace, výskyt na cytosinu 38 tRNA-Asp a tRNA-Glu ^ Nedetekovatelná 5mC methylace, výskyt 6mA ^ Ortholog TET enzymů, pouze malé procento genomu (0.01%) Evoluce DNA methyltransferáz u rostlin a v • v • i o živočichu .... DNMTIMETl : k • » * I I pt ^ n RiO i;c.vi < f0 Animals Mostly CG Plants CG, CHG, CHH Eukaryotes □ TE Methylation (CG) □ TE Methylation (CG, CHG, CHH) □ Gene Body Methylation (CG) Ueda 2020 Evoluce a divergence DNA methyláz u rostlin Komplexita 5mC regulace a exprese se liší mezi vyššími a nižšími rostlinami Ztráta DNMT3 a duplikace CMT a DRM genů pro CG methylaci až u vyšších rostlin Zelené řasy Green Algae Mechorosty Bryophytes Plavuně Kapraďorosty Nahosemenné Krytosemenné Lycophytes Monilophytes Gymnosperms Angiosperms DRM2 CMT2 DNMT3 Enhanced RdDM de novo and euchromatic methylation activities Heterochromatic-CHH methylation by CMT2 Complete loss of DNMT3 Yaari et al. 2019 Proč je DNA methylace dědičná? • DNA methylace je dědičná, protože DNMT1 rozpoznává hemi-methylovanou DNA na obou řetězcích • TET enzymy jsou specificky demethylovány pouze během specifického období během vývoje X inaktivace jako příklad mitotické dědičnosti DNA methylace • X inaktivace je epigenetický mechanismus dávkové kompenzace u savců (samci a i samice mají stejnou dávku genové exprese X chromozomu) • Během vývoje dochází k náhodné X inaktivaci v období gastrulace v embryu, tento jev je posléze předáván do dceřiných buněk Female XX Male XY ft A* á 4 ,BER) 5caC(->BER) U rostlin MEDEA, ROSÍ (TET orthology prozatím neposány, ALE! Modifikace se v genomu výskytují-jiné enzymatické dráhy?) Reduced TET enzyme process vi:y Oxi-mC-faciliCatnd passive DNA dcmcthylation f NH, "N 'O I sugar □ NMT Cytosine NH2 x TET OH NH2 LA ťl I Fe(ll), 20G, Gr i 1 sugar i sugar 6mC ftlirriC TET H 1 NH2 TET N N O Fe(ll). 2OQ,02 HO NH2 M sugar C sugar 5caC Hydroxy lace oxidace oxidace TDG \ / TDG BER mediated active DNA demethylatíon OH I sugar Abasia site BER-„base excision repeair" TDG - ^thymine DNA glycosylase" AID - ^activation induced deaminase" nebo APOBEC (5mC -> T+thymine glycosylase MB4 -> BER) An et al. 2017 Udržení genomové integrity • Dnmtl linie vykazují vysokou genomovou instabilitu • Umlčení nejenom repetitivních elementů, ale i kryptických promotorů a alternativních míst sestřihu • Mutace v místě repetic (meC = T) jako prevence transpozice • Umlčení repetic a jejich transkripční interference • Potlačení ilegitimní rekombinace normal karyotype abnormal karyotype due to genomic Instability Deletions Insertions Reciprocal translocations Ľ r4 gag protein - Ktural proteins LTR long leimiňji ripest pol protein - reverse _A transcriptase, Integrase. průTftase ^J^y^5 -H- LTR „Genome defence model" - DNA methylace je mutagenní, proto musí mít pozitivní vliv na stabilitu (prof. Timothy Bestro) gbM slouží jako evoluční klíčový element a m relativně silný adaptivní potenciál M ethy lati on Rate of change per generation SNPs ~io-9 Gene duplication -10-6 slower Original sequence Adaptive potential Genetic adaptation via changes in DNA sequence ..... " ■ Point mutation —► 1 II I Í Genetic adaptation via changes in gene copy number Gene switched "ON' Gene switched "'OFF" O Genie CG methylation -10-3 - io-4 Epigenetic adaptation via shift in gbM allelic state Genie CHG or CHH methylation 99 faster Epigenetic acclimation or short-term adaptation via environmental orTE-induced shift in CHG or CHH methylation Muyle et al. 2022 Úloha DNA methylace ve významných procesech a rozdílná úloha v podobných orgánech u rostlin (a) Methylation Demethylation _o Balanced before ripening .vCÔ c Q. I t. '4* (b) Tomato # Methylation Demethylation DML2 upregulated Whole-genome hypomethylation (c) Strawberry Methylation Demethylation RdDM downregulated Whole-genome hypomethylation (d) Sweet orange Methylation Demethylation Demethylase downregulated Whole-genome hypermethylation Tang et al. 2020 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy DNA methylace RNA interference Histonové modifikace RNAi susm Výskyt a diverzita malých RNA protein-coding RNA 2% non-coding RNA 98% Housekeeping ncRNAs tRNAs 50-200nt rRNAs snRNAs 50-200nt ncRNAs snoRNAs 50-200nt Regulatory ncRNAs miRNAs 20-24nt - 21-22 — pi R N As 24-32nt (absent in plants. siRNAs 20-24nt IncRNAs >200nt Figure 1. Classification of non-coding RNAs (ncRNAs). Housekeeping ncRNAs include; tRNAs-transfer RNAs, snRNAs-small nuclear RNAs, rRNAs-ribosomal RNAs, snoRNAs-small nucleolar RNAs. The adulatory ncRNAs consist of miRNAs-microRNAs, siRNAs-short interfering RNAs, piRNAs-pivvi-interacting RNAs, and IncRNAs-long non-coding RNAs. Waititu et al. 2020 Klíčové momenty RNAi a genového umlčování Prekurzor - dsRNA Štěpení proteinovým komplexem DICER nebo DICER-like Sestavení RISC komplexu, vazba sRNA ARGONAUTE proteiny Vazba RISC na základě homologie Umlčení Repeat-associated transcripts (centromeres, transposons) Viral RNAs Hairpin RNAs Environmentally, experimentally, or clinically introduced dsRNAs Convergent transcripts and other sense-antisense pairs Gene/pseudogene duplexes Transgene transcripts Tasi RNAs í siRNA amplification ' by RdRP RISC Gene silencing RISC komplex • PAZ • PIWI • AGO • sRNA Carthew, Sontheimer 2009 Původ a rozdíl siRNA vs. miRNA • siRNA • Deriváty nezávislé na genomu (obsaženy vzácně)-mRNA, transponovatelné elementy, viry • Vznik z dlouhých molekul RNA a jejich prodloužených sekund. RNA struktur • Nespecifická produkce siRNA molekul (nespecifický prekurzor) • Konzervativní oblasti poměrně vzácné, siRNA „auto-silecing" efekt • miRNA • Deriváty genomické RNA (obsaženy v genomu) • Vznik z lokálních transkribovaných sekund. RNA struktur (vlásenka) • Syntéza miRNA:miRNA duplexů • Konzervativní genové oblasti příbuzných organismů • miRNA „hetero-silencing" efekt Biogeneze miRNA • Autonomní miRNA zahrnují ve svých produktech elementy potřebné pro regulaci a iniciaci transkripce • Ostatní miRNA jsou závislé na svých pri-mRNA, u kterých probíhá „parazitický" proces • Syntézy nových krátkých úseků katalyzovány RNA polymerázou II a III • Většina miRNA kata lyžovaných pol RNA II a rovněž většina živočišných miRNA nemá typický signál pro polyadenylaci kladní rozdíl syntézy miRNA u rostlin a živočic miRNA gene "'W'mm'ii.....u; i^C „„im .miii.ntír,!. iii.n^ miRNA gene Pri-miRNA 101........" . JUHMI III ...... ni"ilp Pre-míRNA ii'iiiiiinn i'ir'V III M 1 'Tn* Pre-miRNA Mature miRNA within mINI» fllll.....l""ll" Pri-miRNA "KČ 'llllllllll'r T^Tr^V- ^'1111111111 <<» c Pre-miRNA Nucleus Cytq n 11 r 11111111111 * 111 ............'r miRNA:miRNA* duplex n Mature miRNA within RISC Target mRNAs from loci unrelated to miRNA gene Exogenous dsRNA, transposon, virus, ... Illlllllllllllllllllllll- TITT ......................................1 Long dsRNA ©^ ©^ © niimiiiiiimiiiiii "".....1.....1.....r pi siRNA duplexes i pnnnrnmTTT^flt*^H lllllllllililllll^JMMi^^^j^ Allllllllmllllll ^Jllllllllllllllp ^^^^^^ Mature siRNAs within RISC Bartel 2004 Diverzita funkce sRNA Živočichové Rostliny u UG ca-ua a u u A u c a c u-g Ví* U-Gf 1 Gi i g-c g-c u-a U-A g-c a-u ag_cc < c-g * u-g -a a-u < u-g Z g-c 0Ĺ u-a _ c -g T c c s a-u g-c u-a ■š g-u S g-u a-u g-c Vs uc-g c-g :í ,C-Gu ., a - c a-u ug-cc u-a c-g c-g g a g c - u u-a •í-í c-g c - g u— a 51 31 5' 31 < .-c a-u A-u C-G U-A U - A g-c c-g c-g c \-uu Va^ cau u A A A U-a A-u u-g c-g„ uuuc a c u u a-u c-ga uc ua r r C>C-ug aag u-g c u a-u u-g a-u a-u u-g g-c a-u u-a c-g c-G, c-g ua_u A-U a - u a-u u-a a-u A-u <;-g u-g u-a a-u :/ A-U C-g £ a gu-a t A-u 3 u-a U-G c-g _ g-c - H-tŕ a-u u-a n i g-uaa-u Va=a !C8 u-a a-u g-C A g a u u a-u A g A u g a g-u u-a ,a_uug A-yuA cuG-c g-u % A-8 W CC-ga u-a C-g A-U U-A ::' g- u-A g-1 A-u c-G M g-C A c & c-g JhL °u-aa a ~g cu"*c ä-U g-C c-g u-g A a g-C g-C s B 5 u-g cn g-C ■ u U u u u — a a-u c-g a a c-g u-a u-a a-u s IS s a-u r4 u-g m u-a ca-u c-g u-a U u a-u — c-g ^ c-g n H:' 1 A-u 5 g g u-a u-ä c-g, g a a a 8:8 c-g ô 8 g -u c-g c-g u-a c a g-c u-a a-u-a c-gl A-u «:8 c-g rt pf u-a a-u A C g-c g-g-c g-c a c g-c u-A c-g c a a-u c-g g-c a — c g g-c c a g U c-g P 8: A-u g-C a C g-C a-u c — g a-U 5' 3* g—c g-c 5' 3' c-g c-g 5" 3' u-A g-c s y g-c a a 5" 3" g-c Bartel 2004 • Funkce v různých vývojových procesech, „micromanagement" exprese Table 2. MicroRNAs and Their Functions: Examples for which Strong Evidence for the Validity of the Regulatory Target Has Been Reported but the Phenotypic Consequences of Disrupted or Ectopic miRNA Regulation Are Not Yet Known nuRNA Target Gene(s) Biological Role of Target Gene(s) Refs Insects miR-7 Dm HLHm3 basic HLH transcriptional repressor Dm hairy basic HLH transcriptional repressor Dm m4 Brd family protein miR-14 family Dm grim antagonist of caspase inhibitor Dm reaper antagonist of caspase inhibitor Dm sickle antagonist of caspase inhibitor Mammals miR-1 Hs Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Hs Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) miR-19a Hs Ptdlns(3,4,5)P3 phosphatase (PTEN) miR-23a Hs Stromal cell-derived factor 1 {SDF-f) Hs BRN-3b POU-domain transcription factor miR-26a Hs SMAD-1 transcriptional co-modulator miR-34 Hs Deltal transmembrane protein Hs Notchl transmembrane receptor for Delta miR-101 Hs ENX-1 polycomb gene Hs N-MYC basic HLH transcription factor miR-130 Hs Macrophage colony stimulating factor-1 (MCSF) Plants miR170/171 At SCL6-III, -IV & related transcription factors miR156/157 At SPL2 & related transcription factors miR160 At ARF10, AP.F17 & related transcription factors miR167 At ARF8 & ARF6 transcription factors miR164 At CUC1, CUC2 & related transcription factors miR169 At CBF-HAP2 DNA-binding proteins miR162 At DCL1 Dicer-like RNase III Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 1,2 Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 2 Interprets Notch-mediated decisions in neuronal development 2 Promotes apoptosis 2 Promotes apoptosis 2 Promotes apoptosis 2 Growth factor neuronal development 3 Oxidative stress resistance 3 Tumor suppressor gene 3 Growth & localization of hematopoietic progenitor cells 3 Nueronal development 3 Regulates TGF-dependent gene expression 3 Activates Notch during cell-fate decisions 3 Cell-fate decisions during development 3 Proliferation of hemotpoeitic cells and other gene regulation 3 Proto-oncogene; cell differentiation & proliferation 3 Mononuclear phagocytic lineage regulation 3 Related to genes for root radial patterning 4-7 Related to genes for floral meristem identity 6,8 Related to genes for auxin response & development 6,8 Related to genes for auxin response & development 6,8,9 Shoot apical meristem formation & organ separation 6,8 unknown 6 miRNA biogenesis 10,11 The metazoan regulatory targets listed were predicted computationally then supported experimentally. The plant regulatory targets listed were predicted computationally then supported with independent phylogenetic and/or experimental evidence. Species abbreviations: Drosophila melanoqaster, Dm; human, Hs; Arabidopsis thaliana. At. Specifikace exprese miRNA • Různé hladiny regulace genové exprese miRNA zajišťující dokonalý systém kontroly de-novo vzniklých transkripčních jednotek • Závislá na druhu buňky, momentální úlohy a vývojového stádia • Počet jednotlivých miRNA v daném stavu buňky ovlivněn mírou exprese daného lokusu a tvorby pri-/pre-mRNA (50 000 molekul miR-2, miR-52 x 800 molekul miR-124) • Vysoká x nízká úroveň exprese na počet buněk (vysoká exprese důsledkem specializace pouze několika málo buněk, nízká produkce na úrovni např. celého organismu) Molekulární mechanismus funkce RISC - dvě cesty regulace genové exprese • Na úrovni mRNA - RISC komplex a štěpení RNA nebo regulace na úrovni translace (neúplná komplementarita) • Na úrovni DNA - methylace DNA, inaktivace chromatinu Extensive complementarity in coding region or UTR Q Short complementary segments in 3'-UTR Q Interaction with DNA 'aP-^^^^^^^tZi^ L^MIMi^i^M Active chromatin Cap mRNA specifické štěpení regulace na úrovni translace An ^ Histone methylation "k k ie k "k Silent chromatin vazba na DNA (methylace) Bartel 2004 Regulace genové exprese epigenetickými mechanismy DNA methylace RNA interference DNA Accessible, Gene Active ••■ DNA Inaccessible, Gene Inactive Historie Tail Historie Tail Methyl Group • Histonové modifikace Histonové modifikace Chromatin a DNA - struktura • DNA+histony (H2A, H2B, DNA H3, H4)= chromatin • Chromatin umožňuje svinutí DNA do jádra • Vyšší organizace chromatinu ovlivňuje regulaci genové exprese a přístupnost transkripčních nebo DNA reparačních N-aminokyselinový konec proteinů Vyšší organizace chromatinu "Korálky na .,. , Dvoušroubovice Nukleozom provázku" _30 nm vlákno_ _Aktivní chromozom Metafázický chromozom Vyšší organizace chromozomu záleží kromě dalších faktorů na kontaktech Hl Struktura chromatinu ovlivňuje transckripci • Více sbalený chromatin - DNA je méně přístupná transkripčním faktorům • Volný chromatin - DNA je dostupná pro transkripční faktory = genová exprese Heterochromatin vs. euchromatin • Euchromatin - otevřený, méně kondenzovaný ^™ • Heterochromatin - kondenzovaný, nízká nebo žádná genová exprese • Fakultativní - liší se na typu buňky nebo časové organizace (X inaktivace, specifické geny aj.) • Konstitutivní - kondenzovaný chromatin ve všech buňkách • Centromery, telomery, část Y chromozomu I • Genové umlčování, udržení integrity genomu (5mC, represivní histonové modifikace) • Centromery, telomery, část Y chromozomu ^Nedostatečná nomenklatura z hlediska epigenetiky a významu jednotlivých modifikací! Synapse epigenetických modifikácia organizace chromatinu • Thomas a Christoph Cremer - 2020 „ functional nuclear organization depends on still unexplored movements of genes and regulatory sequences between ANC and INC" ANC-aktivní jaderné komponenty INC - inaktivní jaderné komponenty Cremer et al. 2020 Vztah mezi organizací chromatinu a epigenetickými modifikacemi ANC active nuclear compartment enriched in nuclear bodies, splicing speckles nascent RNA, RNAP II, H3K4m3, active regulatory sequences Cremer et al. 2020 INC inactive nuclear compartment enriched in H3K27m3, H3K9m3 inactive regulatory sequences 3D rekonstrukce DAPI barvených jader a intenzita ve vztahu k aktivním a represivním modifikacím Úloha histonových modifikací • Většina modifikací na N-terminálních koncích • Více než 50 AA může být modifikováno, více než jedním typem modifikace (mel/me2/me3) • Nejvíce prostudovány H3, H4, méně H2A a H2B • Kombinace umocněny kombinatoriální komplexitou = histonový kód The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Histonové modifikace tvoří významnou část genové regulační dráhy ac ac ac ac ac ac ph me me me me me ^^WSl N ac ac ac ac ac me ac K5 K 121 ub ac Active marks Historie acetylations, H2Bub H3K4me3, H3K36me2/3 Repressive marks H3K9me2/3, H3K27me3, H3T3ph, H2Aub, symmetric H4R3 N ac K6> Druhově specifická funkce a distribuce Ueada and Seki 2020 Histone (lysine) methylation NH, H3C AAA 7- Lys (KmeOI Km»l Decreasing hydrogen bonding capacity aAA Km*2 CH3 I CH, Kmti Increasing hydrophobicity H3K4me • aktivní modifikace • Promotorova oblast a exony H3K9me • Inaktivující modifikace • v genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin H3K27me • Inaktivující modifikace, • V genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin • H3K27me3 důležitá pro regulace vývojových genů u rostlin i živočichů Methylace H3 závisí na velikosti genomu a druhové diverzitě H3K4me =všechny kombinace mají u rostlin i živočichů většinově aktivující charakter H3K9mel, H3K9me2, H3K27mel =značky inaktivního chromatinu H3K27me2/me3 =druhově specifické, spíše inaktivující charakter DAPI Met(K9)H3 merge Cardamine amara (a) 1C=290 Mbp Triticum aestivum (b) <* 1C=16 6640 Mbp Ricinus communis (c) | * * lC=515Mbp Orzya sativa Id) i. 1C=490 Mbp hetrochromatin euchromatin Small genome plant © H3K9me Houban et. al. 2003 -1 'Velikost genomu>500 Mb vede ke změně distribuce aktivních a represivních modifikací! Acetylace lysinových reziduí NH, Bromodomain l protein lysine • O NH actyllysine on Histone deacetylase (HDAC) Histone z mm mm mm off Koreluje spíše s genovou aktivitou (např. H3K9ac) Redukuje pozitivní náboj histonových aminokyselin = DNA je více dostupná pro další enzymy Spekulativní jako epigenetická modifikace, spíše chromatinová modifikace Některé ac-skupiny postrádají mitotickou dědičnost, závislé na např. na cirkadiánní rytmu Velice proměnlivé Fosforylace sehnu, threoninu a tyrosinu lihosfihosfrin*1 • Nejvíce prostudovaná modifikace, z hlediska centromer • V závislosti na umístění=rozličná funkce • Závislá na buněčné cyklu, důležitá pro kondenzaci chromatinu threonine phosphothreonine CenH3-1 CenH3-2 H3T3ph H3S28ph H2AT120ph tubulin phosphotyrosine • H3S10ph(+H3S28ph) • V oblasti pericentromer (opak u živočichů - H3T3ph and H3Tllph) • H3Atl08(120)ph • Vnitřní část centromery Neumann et. al. 2016 H3Sl0ph H3T11ph Fuchs et. al. 2012 Diverzita histonových modifikací a jejich funkce Histone modification Which residues? Functions Methylation (me, mono, di or tri me) Lysines (K) and Arginines (R) Transcription, Repair (K) Acetylation (ac) K Transcription, Repair, Replication, Condensation Ubiquitination (ub) Transcription Sumoylation (su) K Transcription ADP-ribosylation Glutamate (E) Transcription Phosphorylation (Ph) Serine (S) and Threonine (T) Transcription, Repair, Condensation Citrullination (Cit) R converts to Cit Transcription Molekulární evidence kombinatoriální komplexity A - H3K9me3 B - H3S10ph A - H3K4me3 B - H3K16Ac Nízký afinita Nízká exprese Vysoká afinita Vysoká exprese Vysoká afinita Nízká exprese Nízký afinita ■ Vysoká exprese BPTF („Nucleosome-remodeling factor subunit") HP1 (heterochromatin protein, důležitý pro vazbu DNMT1) Rando 2012 U Arabidopsis, CMT3 (CHH methylace) se preferenčně váže k dimeru H3K9me3H3K27m3. Histon-rozpoznávající domény histon-methylace, -acetylace a -fosforylace • Příklady proteinů obsahující chromodoménu • CHDl - ATP-chromatinový remodeler • HP1 - protein typický pro inaktivní heterochromatin, vazba DNMT1 • CBX2 - část PrC proteinu, ubiquitinace H2AK119 Neznámá hierarchie jednotlivých faktorů • HPl vazba na H3K9me3 • HPl vazba s DNMT • HPl vazba HMT a šíření H3K9me3 • DNMT může vázat HDAC =není jasné, které elementy jsou na vyšší regulační úrovni (a) Udržení gbM probíhá skrz interakci mezi CMT3 methylázou a H3K9me2 modifikací • CMT3 methyluje CHG místa v oblastech sousedících s inaktivním chromatinem - CHG methylace je signálem pro H3K9me2 CHG H3K9me2 • DNA replikace vede ke snížení CHG/CHH methylace, CGm jsou udržovány MET1 Muyle et al. 2022 CD O ro CL) e o > 0 1 OJ Cl u ro > O ro ±- >u T3 >. O e ro in ro CD = ro c ~ .5p q_ 'l/> CD ro i- +-> -ro < O M (b) (c) 1 (d) (e) LS. (f) L CMT3 de novo CHG methylation CHG - H3K9me Self-reinforcing feedback loop ? ? _í CMT3 CHH and CG de novo methylation IBMl transcription coupled histone demethylation )1??T?3)?? DNA replication and MET1 mCG maintenance L DNA methylation J CG f CHG CHH • H3K9me2 Histonové modifikace jsou odlišně distribuovány mezi geny a TEs III IIIIII II ■IIIIII 1 111 III II ■1 1 III Gene mRNA H3K4me H3K4me is associated with actively transcribed genes and mRNA. H3K9me [J ■III mi mi mu i mi in Me-C Transposon J H3K9me is associated with methylated DNA (Me-C) and transposons. Red = high correlation Green = low correlation Distribuce histonových modifikací v genových oblastech • H3K27me3 - modifikace typická pro genovou inaktivitu (vývojové důležité geny) • H3K4me2/me3 a H3K9ac - značky typické pro genovou expresi a aktivitu (promotor) • H3K36me3 - značka typická pro genovou expresi (exony) (a) Serial Active gene (b) Promoter NDR (C) Inactive gene (d) Bart et al. 2010 5' Promoter Diverzita histonových variant a změna struktury chromatinu • Různé varianty H2A, H3, H4 • Každá varianta obsahuje specifické AA, měnící jejich funkci • Zvýšená stabilita • Výskyt AA, které mohou být modifikovány • Úloha v reparačních mechanismech, funkce centromer aj. Telomere H3.3 Pericentromeric heterochromatin canonical H2A, H2A.X H2A.W, H3.1 CenH3 Centromere canonical H2A, H2A.X H2A.Z, H3.1, H3.3 Euchromatin vs. Heterochromatin centromere Euchromatin TSS TE body TTS TSS gene body TTS H2A.W, H3.1 H2A.Z Canonical H2A H3.3 H2A.X, H3.1, H3.3 TSS gene body TTS H2A.Z, H3.1, H3.3 Rozdíl genů a repetic TEs Genes with high expression Genes with low expression Histonové varianty jsou životně nezbytné • Buněčná regulace cyklu (DNA reparacem formace „sex body" a MSG) • Regulace genové exprese (ANC vs INC) • Chromatinové skládání a členění (X chromozom inaktivace) • Buněčná dědičnost (pluripotence a dozrávání buněčných linií) • Úloha v lidských chorobách a imunitě • Úloha při stárnutí Late zygotene sycps neo-PAR cent A Early pachytene t * B —v neo-PAR .1 V. Early-mid pachytene ' y —<* X fc_ neo-PAR Y . c O c- ' \ Late pachytene cx ^— i nun PA P llcU rHr\ IV Y f mm Fernandez et al. 2020 Identita centromery je definována cent-specifickým histonem • Pro většinu eukaryotických genomů je centromera definována chromatinovými a epigenetickými značkami • Aktivita centromery definována zejména H3-specifickou variantou (CENH3, Cse4, CENP-A) • Historicky definována jako konstitutivní heterochromatin, dnes zejména aktivní a represivní modifikace s jasnou hierarchií =centromerické satelity částečně nutné pro vazbu histonové varianty, druhově specifická DNA sekvence (speciace?) MWMt:t H3K9Me3/H2A.Z HJK9JYle2 CENP-A H3K4Me2 H5K4Me2 / H2A.Z Inner Kinetochore Outer KiiieKK hoře Mk rol u bule Budding ycast Drosophila Human Hexameric: Nucleosome Tetťánieric Nucleosorne Oclameric Nucleosome Human Specifita centromerické histonové varianty spočívá v divergenci N-terminální domény Největší variability centromerického histonu v AA N-terminálním konci S. latifolia ProtScale output for user_sequence ProtScale output for user_sequence H. I u pul us AA-specific CENH3 N-konec X AA konzervovaná doména Consensus Identity 1. A thaliana sp | Q8RVQ91HTR12_ARATH 2. Beta vulgaris subsp. vulgaris tr|A0A0J8BDX61A0A0J8BDX6 BETVU 3. Brassica napus tr | E2IPK91 E2IPK9_BRANA 4. Brassica oleracea tr | D1MH571D1 MH57_BRAOL 5. Cicer arietinum tr | X5GE291 X5GE29_CICAR 6. Clipboard Contents 7. Daucus carota tr | A0A068CMC2 | A0A068CMC2_DAUCA 8. Hordeum vulgare subsp. vulgare tr | G1APU31 Gl APU3_HORW 9. Lathyrus sativus tr | A0A0D3QLT71A0A0D3QLT7 LATSA 10. Melilotus albus tr | A0A0D3QLV6 | A0A0D3QLV6MELAB 11. Oryza satvia subsp. japonica tr IQ6T3671 Q6T367_ORYSJ 12. S latifolia FMHP01017919 - ORF 1 (frame 1) translation 13. Secalecerealetr|A0A2l6RN92|A0A2l6RN92_SECCE 14. V u subsp. sesquipedalis LC490907-1 | BBM60645.1 11481 Vigna 15. V u subsp. sesquipedalis LC490908-1 j BBM60646.1 11431 Vigna 16. Vicia peregrina tr| A0A0E3KS29| A0A0E3KS29_9FABA 17. Vigna u subsp. unguiculata LC490905-1 |BBM60643.1 1148 | Vigna 18. Vigna u subsp. unguiculata LC490906-1 j BBM60644.1 j 143 | Vigna 19. Vigna unguiculata LC490903-1 |BBM60641.1 11581 Vigna 20. Vigna unguiculata LC490904-1 | BBM60642.1 11531 Vigna Úloha histonové varianty H2be při dozrávání fero m o n-detekujíc ich chemoreceptorů • Olfaktorické neurony jsou smyslové buňky v nose vnímající pachy a čich (v membráně neuronů jsou čichové receptory citlivé na pachy)-umístěné v olfaktorickém epitheliu v čichové sliznici • H2be se liší 5 AA od H2b (není methylován/acetylován na K5) • Aktivace neuoronů vede ke snížení exprese H2be a prodlužuje životnost (aktivované buňky mají nízkou hladinu exprese této histonové varianty) • H2be mimo jiné aktivuje apoptózu a tedy determinuje životnost neuronů Lomvardas et al. 2016 Děkuji za pozornost!