Epigenetika 15 Mechanismus dávkové kompenzace a jeho evoluce Vývojová genetika 2022 Strategie vyrovnávající dávkově senzitivní expresi u rozdílných pohlaví Evoluce proto-pohlavních chromozomů, „X aneuplodie“ a X-vázaná nedostatečnost X up-regulace v samcích X up-regulace X inaktivace Mat-X upregulace Pat-X inaktivace X upregulace v X0 deregulace v XX Muyle et al. 2022 Historie - objev dávkové kompenzace • 1949 – Murray L. Barr a Ewart G. Bertram identifikovali strukturu blízko jaderné laminy v jádře, která nebyla přítomna v samčím jádře („sex chromatin)“ • 1959 – Ohno popsal Barrovo tělísko jako kondenzovaný X chromozom • 1961 – „Lyon hypothesis=law“ • X inaktivace v samičím jádře jako nástroj dávkové kompenzace • Náhodný výběr X-chromozomu • Různé počty X chromozomů • XX,44 – diploid, normální karyotyp, 1 X • XY, 44 – diploid, normální karyotyp, 0 X • XXX, 44 – X trisomie, abnormální vývoj, 2 X • XXY, 44 – Klinefelterův syndrom, abnormální vývoj, 1 X • XXXX, 88 – tetraploid, abnormální vývoj, 2 X S. Ohno M. F. LyonM. Barr a E. G. Bertram Fenotypový projev dávkové kompenzace • U koček gen ginger (G) odpovědný za oranžové zbarvení (phaeomelanin), recesivní alela (g), nulová (b) – „black color“ (eumelanin) – X vázaný gen • Kocouři = oranžové zabarvení nebo hnědo-černé (pruhované velmi vzácné, často XXY), kočky = pruhování G g g G MM MFF Neplést – gen pro zrzavé vlasy (MCR1) je na chromozomu 16! Genotyp Calico kočky a Tortie kocourů • Calico kočky se liší od Tortie tím, že mohou mít genetickou konstituci s bílým zbarvením („piebalding“) = absence melanocytů v některých oblastech kůže a srsti = autozomálně dominantní, dědičné • Piebald fenotyp není albinismus! (ztráta tvořit pigment) Dvě formy X inaktivace u savců • Náhodná • Během gastrulace (epiblast) • Inaktivace maternálního nebo paternálního chromozomu, dědičná do dceřiných buněk • Důvod pruhovaného zabarvení u koček • Imprintovaná X inaktivace • Paternální X chromozom • Pre-implantační perioda embrya a extra-embryonální tkáň • U vačnatců, zřejmě vývojově původnější/primitivnější mechanismus Imprintovaná X-inaktivace Pre-implantační doba Paternální X chromozom, stádium 2-4 buněk Imprintovaná X-inaktivace Extra-embryonální tkáň Paternální X chromozom Náhodná inaktivace E5.5 u myši v buňkách epiblastu Kafer 2020 Náhodná inaktivace Udržovaná u somatických buněk během celého života Imprintovaná X-inaktivace Pre-implantační doba Paternální X chromozom, 2- 4 buněk Imprintovaná X-inaktivace Extra-embryonální tkáň Paternální X chromozom Náhodná inaktivace E5.5 u myši v buňkách epiblastu Kafer 2020 Náhodná inaktivace Udržovaná u somatických buněk během celého života Vnitřní buňky – dva X chromozomy aktivní Izolace ES buněk Zárodečné buňky – dva X chromozomy aktivní Fáze X chromozom inaktivace u savců • Počítání, založeno na mechanismu X:A dávky • Výběr, který chromozom bude inaktivován • Iniciace, inaktivace chromozomu, Xist exprese z X inaktivačního centra (XIC) • Šíření, in cis podél inaktivovaného chromozomu • Kompletní umlčení, stabilizace X inaktivace, Xist je umlčen • Udržení inaktivace, během života a buněčného dělení, klonální populace buněk Determinace počtu X chromozomů • Úloha XIC kontrolní oblasti a Rnf12/Rlim proteinu • XIC je nezbytná pro X inaktivaci • Oblast zahrnující elementy regulující Xist RNA • Xist polyadenylovaná 17kb RNA, nemá proteinový produkt • Pouze z jednoho chromozomu (determinace Xp/m inaktivace, první známka procesu) • Xist RNA pokrývá celý chromozom • Tsix, DXPas34, Xite a Tsx přímo i nepřímo negativně reguluje Xist expresi • Tsix reguluje overexpresi Xist a brání letalitě plodu během ranného vývoje • Ftx (lncRNA, inhibice methylace Xist DNA promotoru) a Jpx (lncRNA, upregulace) pozitivně reguluje expresi + + - - - RepA, vazba PcG2 komplexu Tsix enhancer lncRNA, váznam pro ESc Tsix enhancer Determinace počtu X chromozomů • Ne zcela popsáno, konsensus – X-vázané faktory a autozomální faktory determinují počet (X:A) • Delece X-vázané oblasti (nekódující RNA) blízko Xist elementu vede k neúspěšné inaktivaci, autozomální faktory nejsou známy • Gen Rnf12 X-vázaný gen lokalizován před XIC • Rnf12/Rlim protein a jeho hladina jsou nutné pro pokračování inaktivace • E3 ubiquitin ligáza, motiv zinkové prstu Úloha Rnf12/Rlim a determinace počtu X chromozomů • Počátek X inaktivace pro daný X chromozom se již nemění • Rnf12 aktivuje Xist expresi (?) • X inaktivace snižuje hladinu Rnf12=druhý chromozom již nemůže být inaktivován • Neznámý autozomální faktor nebo další faktory-Rnf12 musí být přímo zahrnuty v determinaci počtu, ale samotný Rnf12 zcela nevysvětluje celý jev 2 X aktivní 1 X aktivní Determinace počtu X chromozomů • Rnf12 aktivuje expresi Xist • Pluripotentní faktory – pluripotentní stav buňky (ES, PGC aj.) • Oct4, Sox2, Nanog… • Represe Xist (vazba do intronu) • Aktivace regulujících elementů (Tsix, vazba DXPas34 a Xite) • Represe Rnf12 (Rnf12 aktivuje Xist) „X-chromosome kissing“ - výběr • X chromozomy přicházejí do své blízkosti a párují se přes XIC a přiléhající oblasti, stabilizující expresi pouze z jednoho XIC • Výměna informace, které dávají volbu (vazebné faktory) • Kritické pro funkci – ektopické párování X:X vede k poruše exprese Xist • Výměna dalších zatím neznámých faktorů? Epigenetická dědičnost X-inaktivace a důvod zabarvení Callico koček Iniciace a šíření X-inaktivace • Iniciace zahrnuje Xist expresi a pokrytí celého chromozomu touto RNA • Xist exprese setrvává po celý život buňky • X inaktivace je závislá na Xist expresi a je reverzibilní, během buněčné determinace se stává neměnná (epigenetický krajinný model) • Pro úspěšné umlčení je Xist dostatečný pouze v několika buněčných typech (další faktory?) • Šíření X inaktivace zahrnuje odstranění RNA PolII a umlčení repetic • „sex body“ formace se objevuje před umlčením genů • Akumulace inaktivních epigenetických značek • Úloha LINE elementů v TADs (autozomy obohacené uměle o LINE-1 elementy jsou umlčeny)-similarita s Xist RNA Iniciace a šíření X-inaktivace LINE elementy Další faktory nutné pro inaktivaci Úloha genů, které nejsou inaktivovány? Umlčení a udržení X-inaktivace • Není zcela přesně determinováno (nejasné rozhraní) • Založení trvale umlčeného chromatinu • Ztráta aktivních chromatinových modifikací (H3K4me, H4ac) • Akumulace represivních modifikací (H3K27me3, H3K9me2) • Vazba PRC2 (H3K27me3) a PRC1 (H2AK119Ub) • Funkce RepA (Repeat A) jako vazebný faktor Neúplná X-inaktivace • Nejsou zahrnuty v „sex chromatin body“ • Geny PAR • Non-PAR mají 2x vyšší expresi • Poruchy regulace genů, které přiléhají k XIC, jsou zdrojem X-vázaných chorob • Rettův syndrom • Mutace nebo ztráta genu MeCP2 – mentální poruchy, důležitý v nervových buňkách pro regulaci specificky methylačně obohacených oblastí Faktory ovlivňující DC a neúplnou X-inaktivaci • Evoluční historie X chromozomu (geny starší oblasti) – geny s neúplnou inaktivací podléhají konzervovaným elementů • PcG • ANC • TADs + CTCF vazebná místa • DC sensitivní geny (geny spojené s onemocněním) a geny nemající Y- homolog • Neúplná/nedokonalá evoluce X-umlčovacího mechanismu? Shrnutí X-inaktivace a hlavních událostí • Pro udržení nutná aktivita Dnmt1, vazba Smchd1 (SMC třída proteinů) Dávková kompenzace u drozofily a háďátka De-regulace obou chromozomů • Úloha SMC proteinů (kondenziny a kondenzin-like proteiny-podobnost se Schmd1?) • Meiotické a proliferující buňky – regulace transkcripce chromatin remodelujícími proteiny MES („maternal effect sterile“=PcG→H3K27me2, H3K27me3) • Epigenetické značky (jiné pro jeden X chromozom u samečků v důsledku nepárování)-role? Up-regulace samčího X chromozomu • Úloha nekódující RNA (roX1 a roX2) • Zahrnuje histon acetyltransferázy, RNA/DNA helikázy • Založení aktivní jaderné domény obohacené o transkripční jednotky Funkce dávkové kompenzace v C. elegans Meyer et al. 2005 • Xol-1 je master gen, který kontroluje pohl. determinaci i DC • V hermaphroditech (XX), 2x vyšší dávka XSE reprimuje xol-1 aktivaci (srkze ASEs) • Represe xol-1 umožňuje expresi/aktivitu XX-specifického proteinu SDC-2, který stabilizuje SDC-3, snižující expresi obou X chromozomů o ½ (lokus her-1 až 20x) • DPY-30 je podjednotka SMC proteinu, který interaguje s COMPASS komplexem (methylace histonů = „writer“) • V X0 samcích, XSEs-dávka jednoho chromozomu není dostatečná pro vazbu a překonání ASEs, nedochází k umlčení X-chromozomu a her-1 lokusu Dávková kompenzace u Drosophily melanogaster • Samčí MSL komplex se tvoří během ranné embryogeneze a je asociován přímo s Xvázanými geny • U samiček nedochází k expresi MSL2, proto se netvoří MSL komplex, nedochází 2x vyšší expresi X chromozomu Ferre et al. 2017 Cesta vedoucí k překonání X-vázané „haploinsuficience“ a DC mechanismu • X up-regulace je typický příklad jak se buněčný mechanismus vyrovnává s nerovnou dávkou genové exprese mezi pohlavími (u savců)“Ohno´s hypothesis“=kvůli Y degeneraci, X alely mohou být potencionálně haploinsuficientní • K překonání této genové dávky a její nerovnosti, organismy mají různé typy, z nichž evolučně jednodušší se jeví X chromozom up-regulace nejdříve v obou pohlavích, posléze de-regulace nebo inaktivace v homogametickém pohlaví Evoluce šíření X-chromozom DC vazebných míst • Z hlediska evoluce DC vazebných elementů byly předpovězeny 4 různé modely • Regulace přes Cis-acting elementy na dlouhé vzdálenosti • Více „cis-acting“ elementů a šíření dalšího umlčování lokálně • Více „cis-acting“ elementů bez šíření inaktivace • Vícenásobné šíření inaktivace in-cis na krátké vzdálenostiMeyer et al. 2005 Podobnost specifikace DCC vazby a šíření mezi modelovými organismy Ercan et al. 2015 • Podobně jako TFs, DCC s váže do oblastí s nízkou nukleozomální hustotou (MSL se váže na více otevřená místa chromatinu, označená H3K36me3) • Není známo, jak přesně je DCC lokalizován na X chromozom, možná role několika faktorů • Histonová varianta (H2A.Z) • Pol II – „pushing“ • Chromozomální interakce • sRNA(?) Similarita DC a kondenzin komplexu, jeho funkce v C. elegans • DC-kondenzin geny v C. elegans mají podobnost s geny kódující 13S kondenzin komplex, který je esenciální pro rozlišení a organizaci mitotických a meiotických chromozomů u člověka, kvasinky a dalších druhů = využití existujícího mechanismu • DC komplex v Caernohabitis se vyvinul ještě s dalšími podjednotkami, které určují jeho specifitu (SDC-2, SDC-3, DPY-30) Strome et al. 2014 C. elegans X-chromozom vazebná místa a Xchromozom inaktivace • X chromozom obsahuje několik XRE (X rozpoznávajících elementů) • XRE se liší od ostatních míst v genomu změnou v bp, tak aby DCC specificky rozpoznal pouze X chromozom • DCC po vazbě na XRE se šíří in cis na další místa X chromozomu Meyer et al. 2005 Podobnost a rozdíly DCC vazebných míst mezi Drosophilou a C. elegans • XRE – X chromozom rozpoznávající element • MRE – motiv obohacený na X chromozomu • MRE (21bp) a MEX (12bp) jsou obohaceny na X chromozomu, mají vyšší obsah GA a jsou esenciální pro vazbu DCC • MRE a MEX se nacházejí v genomu, oproti autozomálním motivům došlo k sekvenční divergenci, mají 2-4x vyšší hustotu na X chromozomu • DCC v C. elegans sdílí 4/5 podobnost s kondensinem I zatímco DCC v Drosophile zahrnuje několik podjednotek vázajících non-coding RNA roX Ercan et al. 2015 Celkové srovnání X chromozom inaktivace mezi modelovými druhy podporuje model vzniku šíření in cis a kontaktů na dlouhé vzdálenosti Ercan et al. 2015 Koevoluce DC mechanismů a možné varianty u ostatních organismů – model dichotomie DC mechanismu u monarchy stěhovavého • Ancestrální část Z chromozomu má nižší expresi a nižší úroveň H4K16ac („C. elegans like DC“) • Nové neo-Z oblasti jsou up-regulovány = jsou obohaceny H4K16ac („Drosophila like DC“) • Mechanismus rozporující evoluční hypotézu – nové pohl. chromozomy získávají DC mechanismus ancestralního typu Gu et al. 2019 Duan et al. 2019 DC mechanismus u rostlin – mladé pohlavní chromozomy jsou ideálním modelem pro studium kompenzačního mechanismus • Pro studium DC a jeho skutečného efektu je nutné porovnat ancestrální stav exprese pohlavně-vázaných genů s jejich ortology (autozomální stav) Ancestral gene A Ancestral gene A gene A1 gene A2 gene A1 (XY) gene A2 (A) gene A1 (A) gene A2 (A) gene A Arabidopsis V optimálních podmínkách se exprese X(Z) senzitivních alel zvyšuje s mírou úrovně Y(W) degenerace Muyle et al. 2022 Děkuji za pozornost!