Epigenetika 16 Úloha epigenetiky v lidských chorobách Metody Obsah • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Hlavní epigenetické mechanismy odpovědné za chromatin-asociované vývojové poruchy • Narušení DNA methylace nebo chromatinu na imprintovaných lokusech • Ztráta chromatin-regulujících faktorů vede ke změně struktury chromatinu a změně exprese • Změna DNA a změna chromatinu jako zdroj variabilní exprese Monoalelická exprese Změna DNA a/nebo chromatinu=změna exprese MeCP2 – vazba na meCpG, represor i aktivátor Opakování maternální/paternální (UDP) alelické disomie Zoghbi et al. 2016 2x vyšší exprese pouze jedné alelyKaždá alela je exprimována pouze jednou! • Bi-alelická exprese je důsledkem správného maternálního a paternálního imprintingu Prader-Willi a Angelman syndrom • Oba syndromy mohou být způsobeny delecí části lokusu, změnou chromatinu nebo kombinací genetických a epigenetických faktorů Zoghbi et al. 2016 Prader-Willi a Angelman syndrom Monoalelická paternální expreseMonoalelická maternální exprese Zoghbi et al. 2016 Základní rozdělení chorob • Porucha monoalelické exprese – genomický imprinting • Prader-Willi syndrom • Angelmanův syndrom • Změna stavu chromatinu • In cis • Syndrom fragilního X chromozomu • FSHD • In trans • Kabukiho syndrom • DNA methylace • Ztráta regulace onkogen aktivujících genů • Methylace tumorsupresivních genů Přehled chorob související s genomickým imprintingem Přehled chorob související se změnou chromatinu in trans Vals et al. 2014 Přehled chorob související se změnou chromatinu in cis Syndrom fragilního X (Martin-Bell syndrom) • Normální X má 6-60 tripletů CGG (45-55 šedá oblasti, potenciálně nestabilní) v 5'UTR genu FMR1 (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)9 • FMR1 gen je důležitý při vývoji mozkové tkáně, plná porucha se projeví tedy zejména mentální retardací, autismem a změnou v obličejové části (velké uši, protáhlý obličej) • Kauzální mutace je zmnožení počtu a methylace FMR1 • Muži-přenašeči nesou premutaci v počtu 60 a 200 kopií, plná mutace se projeví pouze v synech žen-přenašeček, plná mutace nastává pouze při přenosu ženou Zoghbi et al. 2016 Abnormální alela, mírný nebo žádný projev Možná pozdější neurodegenerativní onemocnění, u žen možné i ovariální dysfunkce Plná mutace, Martin-Bell syndrom Facioscapulohumeralní svalová distrofie (FSHD) • Změna počtu repetic D4Z4 vede k zpřístupnění lokusu pro chromatin-remodelující faktory, změna na aktivní chromatin a expresi genů s myopathickým potenciálem • Obvykle se projevuje kolem 20.roku života, ochabnutí svalů v oblasti ramen a obličeje se může projevit i v dětství, někdy bez těžkého projevu • Choroba se může projevit i u pacientů bez zkrácení chromozomu 4 Zoghbi et al. 2016 Úloha epigenetické regulace v nádorovém bujení • DNA methylace • Histonové modifikace • „Writers“ • „Readers“ • Histonové varianty • Histon-remodelující komplexy • SWI/SNF • ISWI • CHD • INO80 • RNA-interference Baylin et al. 2016 Chromatinové změny při nádorovém bujení • Změna chromatinu zahrnuje hypomethylaci a hypermethylace specifických genů, vazba histone-modifikujících enzymů navozujících in/aktivovaný stav • Změna chromatinu je vidět po barvení hematoxylinu-rakovinné buňky mají větší jádra a více granulovaná Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení • Hypomethylace onkogenaktivujících genů • Hypermethylace tumorsupresivních genů • Mutageneze • C-T tranzice • Vyšší vazba meCpG pro karcinogeny • meCpG UV mutageneze Baylin et al. 2016 Úloha DNA methylace v nádorovém bujení a progrese kolorektálního karcinomu Baylin et al. 2016 • regulate cell growth, function, differentiation, and cell death• a tumour suppressor gene that controls beta-catenin turnover in the Wnt pathway = deletions are associated with colorectal malignancies • DNA damage repair • regulate cell growth and cell division Schéma působení chemoterapeutik na epigenetickou krajinu Zoghbi et al. 2016 Inhibice DNA methyltransferáz (vazba na DNA) Inhibice HDAT • Aktivně proliferující buňky akumulují více látek nebo lokálně dodávané Obsah • ÚLOHA EPIGENETIKY V LIDSKÝCH CHOROBÁCH • METODY Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Bisulfitové sekvenování • Působení hydrogensiřičitanu na cytosin=konverze na U (methylované C zůstávájí stejné) • Nutné porovnání proti referenční sekvenci, kterou analyzujeme • Nutnost referenčního genomu • Pro detekci ostatních modifikací (hmC, caC, fC) jsou nutné specifické reakce-konvenční bisulfitové sekvenování nerozlišuje mC a hmC a caC/fC od nemethylovaného C Výstup bisulfitového sekvenování Frekvence methylanovaných bp na celkový počet všech contigů Výpočet úrovně methylace na jenotky bp Vytváření methylomových map Průměrná úroveň methylace na chromozom Průměrná methyla na TEs, gen, kb, Mbp atd. MSAP • Restrikce pomocí methylačně sensitivních enzymů • MspI a HpaII neštěpí sekvenci, pokud první C methylován • Pre-selektivní PCR amplifikace • Ligace se specifickými primery • Selektivní PCR amplifikace • Amplifikace specifických produktů • PCR produkt screening • PAA nebo kapilárová elektroforéza • Případně další sonikace a příprava NGS knihovny • Výsledek • Získání DNA methylace analyzovaných vzorků, v případě NGS nutní reference MSAP+NGS technologie • Identifikace regionů s odlišnou methylací (DMRs) • Nutnost specifických softwarů • Po specifické PCR-preamplifikaci • Tvorba NGS knihovny • Sekvenování • Analýza produktů Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování BSA, případný enzymatický treatment Příprava vzorku Fixace Permeabilizace membrány Blokace aj. Inkubace protilátky Vizualizace Pletivo/tkáň, buněčné útvary aj. PFAM, Glutaraldehyd, EtOH… Detergent Monoklonální vs. polyklonální Mikroskopie Princip imunolokalizace Přímé a nepřímé barvení • Dražší • Nižší citlivost • Nižší pozadí • Levnější • Vyšší citlivost • Nižší i vyšší pozadí Becheva et al. 2018 Monoklonální protilátky • Ve srovnání s pAbs dražší • Rozpoznají jeden epitop (váže se na specifické místo) • Tvořeno jednou protilátkou Polyklonální protilátky • Levné pro produkci • Mix různých protilátek • Váží se na různé oblasti jedné molekuly • Tolerantní na malé změny v epitopu cílené molekuly Bártová et al. 2019 Chip-seq analýza Nakato et al. 2014 Koncentrační řada pro Mnasové štěpení Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování ATAC-seq („assay for transposase-accessible chromatin“ • Nukleozomové mapování • Vazba transkripčních faktorů • Detekce faktorů související s nemocemi • Komparativní epigenomika • Regulace buněčné specifikace gDNA je exponována vysoce aktivní transposáze → fragmentace DNA v otevřených oblastech → tagování se sekvenčními primery Illumina official website MNase-seq („micrococcal nuclease digestion“) Wikipedia commons Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Chemická genetika • Aplikace chemických látek pro studium fenotypu nebo genové regulační dráhy • Chemická epigenetika neinterferuje s DNA (ne primárně) Kawasumi 2007 Chemické látky ovlivňující DNA Liu 2014 Chemické látky ovlivňující chromatin a DNA methylaci Liu 2014 Analýza nových genů regulujících epigenetické procesy u myší • Analýza X-chromozomové inaktivace • Existence 4 XCE alel (a, b, c, d) s různou expresí=pravděpodobností X chromozom inaktivace (d=nejsilnější alela, slabá IC) • Analýza ENU ovlivněných myší ukázala změnu v první X inaktivaci (E6.5 – 7.5) a změnu v maternální selekci X • Nalezené mutace umožnili nalézt 3 autozomální oblasti, které nepřímo ovlivňují X-vázané geny s neúplnou inaktivací nebo geny odpovědné za volbu parentálního X • Momme ENU • vysoce toxický mutagen působící 1 mutaci/700 různých oblastí • Účinky hlavně ve spermatocytech Momme – hledání genů odpovědných za epigenetické reprogramování • Vystavení specifický GFP linií ENU chemické mutagenezi v pozadí variabilní exprese (úroveň exprese je nižší v důsledku metastabilní epigenetické variability=podobné pozičnímu efektu u octomilky) • Objev 30 možných kandidátů regulujících různé úrovně epigenetických změn, dominantní mutace Momme – genetické mapování kauzálních mutací • Mutantní potomstvo s různou úrovní transgenní exprese je použito pro genetické mapování • Bodová mutace je analyzována pomocí exomového čtení (myší DNA exonové sekvence jako proby pro odhalení lokusu v kombinaci s NGS) Blewitt et al. 2013 Výsledek Momme mutantní linie Seznam kandidátních mutací Wild-type varianty jsou aktivující Wild-type varianty jsou represivní Obecné rozdělení • DNA methylační analýza • Bisulfitové sekvenování, MSAP…. • DNA-protein interakce • Imunolokalizace, Chip-seq • Chromatinová analýza • ATAC-seq, MNase-seq • Chemická genetika • 3D modelování Epigenetické in silico modelování a 3D rekonstrukce jádra • Analýza genomu • ChIP-seq • Hi-C • Simulační analýza • Model biopolymeru • Jednotlivé chromozomy • 3D modelování • Celý genom • Validace dat • Hi-C data • Mikroskopie • TADs • Jedná se o propojení všech uvedených metod a jejich in silico vizualizace, možné u modelových organismů! Stefano et al. 2021 Doporučená literatura/online kurzy Děkuji za pozornost!