Výsledek obrázku pro wnt3a catenin RF43 Rspondin Wnt signaling d DVL2 d DVL2 A) V nepřítomnosti ligandů Wnt, nebo v případě zablokování dráhy (DKK1, SFRP) je cytosolický b-catenin konstitutivně fosforylován v destrukčním komplexu (APC, CK1, AXIN, GSK3), následně ubiquitován a degradován v proteasomu. ZNRF3 a RNF43 (E3 ubiquitin ligázy) ubiquitinují, a tak destabilizují receptory Frizzled a LRP, čímž inhibují Wnt signalizaci. B) Vazba ligandů Wnt (Wnt3a) na jejich receptory LRP5/6 a FZD vede k fosforylaci proteinuDVL2, inhibuje se destrukční komplex, b-catenin se akumuluje, translokuje do jádra a umožňuje přepis genů, které mají v promotoru vazebné místo pro TCF/LEF transkripční faktor, na který se b-catenin váže. R-spondin (RSPO) posiluje Wnt signalizaci, protože vytváří ternární komplex LGR proteinů s ZNRF3/RNF43, čímž indukuje autoubiquitinaci ZNRF3/RNF43, což vede k jeho degradaci v proteasomu. Celá reakce je zesílena použitím 1 uM LGK-974 (Stock solution – SS: 1mM), inhibitoru acyltransferázy porcupine, která acetyluje Wnt v ER a umožnuje tak jeho sekreci. V přítomnosti LGK-974 není endogenní Wnt sekretován, proto buňky reagují lépe na exogenní Wnt stimulaci. Očekávané výsledky Wnt3a b-catenin RNF43 RSPO Metody uTransfekce buněk uRT-PCR uWestern blotting uImunoprecipitace uImunofluorescence ulinie odvozená z lidských embryonálních ledvinných buněk (1973), transformovaná (adenovirus 5 DNA) uširoce používaná – rychlý růst, výborně transfekovatelná – využití pro produkci rekombinantních proteinů uexistuje několik variant této buněčné linie, může růst jako adherentní i suspenzní u Modelová buněčné linie - HEK293 (Gibco, 2015; wikipedia.org) adherentní suspenzní Hyršlová Vaculová, 2018 qRT-PCR udynamická regulace hladiny mRNA – detekce změn je zásadní pro studium změn exprese specifických genů; u uKvantifikace exprese proteinů podle množství molekul mRNA využívající reverzní transkripci a PCR u u Reverzní transkripce převede mRNA na cDNA uPrimery oligoT, náhodné hexa-nona oligonukleotidy, specifické primery pro konkrétní RNA u uKvantifikace je umožněna použitím fluorescenčně značených molekul SYBR green – nárůst fluorescence po každém cyklu u uPo každém cyklu je provedena detekce přírůstku = odpadá nutnost kvantifikace pomocí elektroforézy u Izolace celkové RNA uRneasy total RNA isolation kit (Quiagen) uhttps://www.youtube.com/watch?v=8zVGVFCs2mA uPodrobný návod: uhttps://www.qiagen.com/cz/resources/resourcedetail?id=14e7cf6e-521a-4cf7-8cbc-bf9f6fa33e24&lang=en u1x10*6 – 1x10*7 buněk opláchnutých PBS RLT pufr + 1% 2ME RW1 pufr, 2x RPE pufr RNAse free H2O Kvantifikace RNA a výpočet pro zpětnou transkripci 1.Kontrola kvality RNA 1.Absorbance 260 by měla být 0,2-1,2 jinak naředit 2.Poměr A260/280 by měl být kolem 2 - 2,1 3.Poměr A260/230 by měl být kolem 2, pod 1,8 nevhodné pro RT 2.Odečet koncentrace RNA 3.V kolika ul je 1000 ng? 1000/91,6 = 10,9 ul RNA odebereme na RT, doředíme do 12 ul RNase free H2O 4. Přidáme 1 μl 20 mM Oligo(dT) 5. Inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). 6. Připravíme reakční mix: 1 vzorek x vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RevertAid RT 1 ul 7. Připipetovat ke směsi RNA a oligo dT po 7 ul (celkový objem 20 ul) 8. Inkubace při 42 °C po 1 h (PCR cykler) 9. Ukončení reakce denaturací RT při 70 °C/10 min http://www.u.arizona.edu/~gwatts/azcc/InterpretingSpec.pdf Princip revezní transkripce Reverse transcriptase (RT)-PCR: Principles, Applications • Microbe Online https://microbeonline.com/rt-pcr-principles-applications/ Real time PCR mix Sybr green 1. primer 2. primer MgCl2 H2O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul x vzorků Celkem 20 ul v jamce: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl2) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) 1,7 ul MgCl2 (SS 25 mM) Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H2O Pipetování reakcí: https://www.youtube.com/watch?v=0rCxdtlXNj8 Princip reakce real time PCR Real Time PCR Process https://microbeonline.com/rt-pcr-principles-applications/ https://www.intechopen.com/media/chapter/70299/media/F3.png Teplota annealingu primerů •Čím větší délka a vyšší obsah GC párů, tím je teplota nasedání vyšší •Teplota nasedání primerů musí být dostatečně vysoká, aby nedošlo k nespecifickému nasedání primerů k templátové DNA, pokud by ale byla příliš vysoká, primery by nenasedaly vůbec. •Je třeba, aby teplota nasedání byla optimální pro oba primery a obsah GC párů v obou primerech byl srovnatelný, tzn., aby byla srovnatelná teplota nasedání obou primerů. • Pro výpočet teploty primerů můžete použít některý ze SW – oligo •Se zvyšující se koncentrací Mg2+ se zvyšuje annealingová teplota Co zohlednit při navrhování primerů: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?ORGANISM=9606&INPUT_SEQUENCE=NM_004996.4& LINK_LOC=nuccore PCR product size: SybrGreen 100-500, sonda UPL (Roche) cca 70-150 Exon junction span: Primery musí přesahovat exon-exon junction Zatrhnout: Allow primer to amplify mRNA splice variants Hodnocení kvantitativní real time PCR uUrčení Ct (Cp) – manuálně nebo pomocí maxima 2. derivace - bod, kde dochází k strmému stoupání amplifikační křivky vzorku uČím vyšší Ct, tím méně molekul mRNA bylo ve vzorku u https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/ Výsledek obrázku pro q real time PCR Model PCR plot Real time PCR Templátová DNA: 1,5 ul cDNA do každé jamky Primery: pro 25 µl reakci použijeme 0,25-2,5 µl z obou primerů. Množství primerů musí být optimální. Příliš vysoká koncentrace vede k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA nebo párování primerů navzájem. Příliš nízká koncentrace primerů může vést k nedostatečnému množství produktu. dNTP směs: je směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Obvyklá koncentrace každého dNTP v reakci je 200 µM (0,2 mM). MgCl2: obvyklá koncentrace je 1,5 mM. MgCl2 je nutný pro procesivitu a přesnost Taq polymerázy. Koncentrace MgCl2 se odvíjí od koncentrace dNTP a platí, že pro specificitu reakce musí koncentrace MgCl2 převyšovat koncentraci dNTP. Pro zvýšení specificity reakce zvyšujeme koncentraci MgCl2, a to až k 5 mM, přičemž koncentraci dNTP držíme stále na stejné úrovni. Někteří výrobci Taq polymerázy dodávají MgCl2 zahrnuté do reakčního pufru. SybrGreen: Interkalační barvivo je součástí reakčního pufru, ale v rámci šetření ředíme. Kontroly: Používáme negativní a pozitivní kontrolu, pokud je to možné. V negativní kontrole použijeme místo testovaného vzorku vodu, tzn., negativní kontrola neobsahuje testovanou DNA. Pozitivní kontrola naopak obsahuje takovou DNA, která nám zajistí vznik požadovaného produktu. Křivka tání (melting curve) uNa konci reakce proběhne postupné zahřívání celé reakce, po dosažení bodu tání Tm dojde k degradaci DNA (pokles fluorescence) uSpecifitu reakce ilustruje křivka tání (melting curve) – u musí mít jen jeden vrchol = jeden produkt u http://labguide.cz/metody/real-time-pcr/ Více info: https://theses.cz/id/go0fw3/Bakalarska_praceEliska_Ruzickova.pdf ######## Samples MeanCp hprt myo D DCp 2^-DCp x10 na K 1 k 1d A1, B1 19,75474 19,58113 0,17361829 0,8866163 8,866163 1 1 a26 1d A2, B2 20,6692 19,33026 1,33894189 0,3953105 3,953105 0,445864 1 a30 1d A3, B3 19,99559 19,50746 0,4881269 0,7129501 7,129501 0,804125 Hodnocení kvantitativní real time PCR Velmi důkladné video o celé RT PCR https://www.youtube.com/watch?v=9UWKIFGh0h0 Ředění primerů 1. Když k lyofylizátu přidáme 267 ul dostaneme koncentraci 100 pmol/ul = 100 uM (uM/l) 2. Ředíme na výslednou koncentraci 0,1-1 µM podle toho, aby se nám to vešlo do lahvičky (2 ml) 20 uM, 40 uM nebo Transfekce uPlazmidy (i jinou nízkomolekulární DNA) je možné množit pomocí kompetentních bakterií a následně izolovat pomocí kolonkových kitů (mini-, midi- a maxiprep) u uHeat shock kompetentních bakterií E. Coli plazmidem zájmu uRůst bakterií na selekční půdě (antibiotikum) uIzolace rezistentní kolonie a její namnožení v selekčním LB médiu uIzolace nízkomolekulární DNA pomocí kolonkového kitu: uLyzace bakteriálního peletu a RNA uPrecipitace proteinů a genomové DNA uPřenos supernatantu na kolonu a vazba plazmidu na pryskyřičné kuličky (promytí) uEluce plazmidové DNA a její přečištění u u u u Izolace plazmidové DNA u video návod on line https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4.video ke stažení https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4 Kontrola kvality DNA - nanodrop Izolace DNA pomocí kolonkového kitu A260 max 1.0 (10x ředit vzorky) DNA: A260/A280 ~ 1,8 A260… nukleové kyseliny A280… proteiny A230… příměsi \\ha-bay.ics.muni.cz\homes prihlasovaci jmeno je> UCN\uco (VCETNE UCN\) Vektor pMaxGFP (AMAXA) uGen pro GFP izolovaný z planktonového korýše Pontellina Plumata, konstitutivně přepisovaný plazmid slouží pro kontrolu účinnosti transfekce Promotor z cytomegaloviru gen zájmu polyA konec z SV40 viru Gen pro rezistenci Počátek replikace Plazmid 368 - M50 Super 8x TOPFlash https://www.addgene.org/12456/ 181170_map Beta-cateninový reportér. 8xTCF/LEF vazebných míst před promotorem pro Fire Fly (FF) luciferázu Plazmid 345 - pRLtkLuc Výsledek obrázku pro pRLtkLuc https://worldwide.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-l ines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/?catNum=E2231 Konstitutivní exprese Renilla luciferázy (R) poskytuje vnitřní kontrolu, na kterou se může přepočítat exprese FF luciferázy, protože oba vektory se transfekují se stejnou účinností. PEI (polyetylenimin) DNA:PEI = 1:4 uKationické polymery jsou hydrofilické, a proto jsou rozpustné ve vodě uJsou schopné velmi efektivně kondenzovat DNA (záporný náboj) uKomplexy DNA/PEI musí být malé (< 100 nm) uInternalizace endocytózou uAkumulace v endosomech a lyzosomech kolem jádra uJen malé množství komplexů z těchto organel unikne a dostane se do jádra Cationic polymers differ from cationic lipids in that they do not contain a hydrophobic moiety and are completely soluble in water. Given their polymeric nature, cationic polymers can be synthesized in different lengths, with different geometry (linear versus branched). The most striking difference between cationic lipids and cationic polymers is the ability of the cationic polymers to more efficiently condense DNA. There are three general types of cationic polymers used in transfections: Linear (histone, spermine, and polylysine) Branched Spherical Cationic polymers include polyethyleneimine (PEI) and dendrimers www.nano-lifescience.com http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html Postup transfekce uPříprava transfekčních směsí – na 1 jamku: u100 ul DMEM pure + 150 ng každého plazmidu (celkem 0,45 ug DNA) uvýpočet: SS plazmidu 500ng/ul u500 ng…. 1 ul u150 ng…. 0,3 ul u100 ul DMEM pure + 1,35 ul PEI (poměr DNA : PEI = 1:3, tj. 0,45x3 = 1,35) u pRLtkLuc TOP Flash pmax GFP uVýpočet: DMEM pure 345 368 251 PEI u1 jamka 100 ul 0,3 0,3 0,3 1,35 ul u5+1 jamek u Připravené transfekční směsi důkladně zvortexujeme, krátce stočíme a necháme 10 minut inkubovat při RT. uObě zkumavky smícháme, důkladně promícháme a opět 10 minut inkubujeme při RT. uDo každé jamky přidáme 203 ul výsledné transfekční směsi. Inkubujeme 3 hodiny v termostatu. uOdsajeme médium, přidáme do vzorků 150 ul DMEM s 0,45 ul LGK (2,25 ul LGK + 750 ul DMEM) a 150 ul kondiciovaného média (CM) s WNT3a (W+) nebo R-spondinem (R+) (dle rozpisu vzorků). Doplníme do 450 ul DMEM. Do kontroly bez LGK přidáme jen 450 ul DMEM. Kontrolu označenou 0 vůbec nezpracováváme – je to kontrola bez ovlivnění. Inkubace přes noc. u Top Flash assay uDual Luciferase Assay (kit Promega ) uOdsajeme médium uPřidáme opatrně 1 ml PBS, odsajeme, na sucho inkubujeme v -80 °C/10 min uRozmrazíme pufr LAR II a Stop & glow buffer uNaředíme si 5x lyzační pufr – 1 jamka 50 ul, 6+1 jamek 350 ul, tj. 280 ul MQ H20 + 70 ul 5x lysis buffer uPřidáme 50 ul 1x lyzačního pufru do každé jamky a inkubujeme 15 min/RT na třepačce uNaředíme si 100x Stop & glow reagent v Stop & glow buffer (25 ul na jamku, tj. 6+2 = 200 ul) uNachystáme si luminometr a stripy na měření uDo stripu nakapeme 20 ul lyzátu z každého vzorku (důkladně zhomogenizovaného) uU luminometru velmi rychle přikápneme 25 ul LARII substrátu pro firefly (FF) luciferázu uZměříme chemiluminiscenci uPřidáme Stop & glow substrát pro renilla (R) luciferázu (inhibice aktivity FF luciferázy, substrát pro R luciferázu) uZměříme chemiluminiscenci uVýslednou hodnotu spočítáme jako podíl FF luciferázy a R luciferázy WB uizolace buněčných proteinů – lyze buněk, specifické pufry, centrifugace ustanovení koncentrace proteinů v jednotlivých vzorcích, naředit vzorky na stejnou koncentraci uke vzorku proteinů se přidává: uTris pufr – zajištění optimálního pH uSDS, beta-mercaptoetanol, DTT – denaturace proteinů uglycerol – zvýšení hustoty vzorku, lépe se udrží v jamce v gelu ubromfenolová modř – vizualizace pohybu proteinů v gelu uPOSTUP uDen předem byly vysety buňky (150 x 103 v 150 ul) a k buňkám byla přidána CM a LGK dle rozpisu. uZe vzorků odsajeme médium a opatrně přidáme 0,5 ml PBS, které také odsajeme uPřidáme 100 ul Laemmli lyzačního pufru (sodium dodecyl sulfate, 2 % SDS, 10 % glycerol a 100 mM TRIS pH 6,8, 0,05 % bromfenolová modř, 25% merkaptoetanol). uInkubujeme 10 minut na ledu a následně přeneseme do zkumavek (vzorky je možné uchovávat v -20 °C). uPRÁCE NA LEDU! uRozbití buněčných struktur a DNA provedeme sonikací a vařením na 95 °C/5 min v bločku. u u u u u u u u u Příprava lyzátu na Western blotting www.wikipedia.org Hyršlová Vaculová, 2018 uLaemmliho (Tris-glycinový) diskontinuální systém pufrů - dva pufry o různém pH pro přípravu zaostřovacího a rozdělovacího gelu a jeden pufr tvořící elektrolyt udenaturované proteiny jsou pipetou vnesené do jamek polyakrylamidového gelu, které jsou vyplněné vhodným pufrem unásledně je do gelu vpuštěn elektrický proud, díky kterému proteiny záporně nabité pomocí SDS migrují skrz gel směrem k anodě una základě jejich velikosti se každý protein pohybuje gelem rozdílnou rychlostí umenší proteiny pronikají póry v gelu snadněji než větší, které se střetávají s větším odporem uproteiny se rozdělí podle své molekulové hmotnosti umenší proteiny postoupí dále než větší, které jsou blíže počátku, u kam byly proteiny aplikovány uPOSTUP: u2x polyakrylamidový gel 8 %, tloušťka 1,5 mm, 15 jamek uPřed nanesením vzorků na gel je důkladně zvortexujeme. uDo každé jamky v gelu napipetujeme 20 μl z každého vzorku a do krajních jamek napipetujeme 1,5 μl barevně značeného proteinového standardu (PagerRuler Plus Prestained Protein Ladder, ThermoScientific) dle rozpisu. uElektroforéza 130 V 1 hodinu (proteiny, jež díky SDS získaly záporný náboj, migrují ke kladné elektrodě). u u u u u u u u u Vlastní SDS PAGE (Laemmli) https://ww2.chemistry.gatech.edu/~lw26/course_Information/4581/techniques/gel_elect/gel.jpg Hyršlová Vaculová, 2018 udetekce a identifikace proteinů přenesených na membránu s využitím specifických protilátek uněkolik základních kroků: uodmytí blokačního agens upřidání primární protilátky uodmytí nadbytečné primární protilátky upřidání sekundární protilátky uodmytí nadbytečné sekundární protilátky udetekce signálu – intenzita úměrná množství detekovaného proteinu (různé možnosti) u u u u u u u u Imunodetekce – hlavní fáze http://www.bio-rad.com http://www.merckmillipore.com/ https://www.cusabio.comg Hyršlová Vaculová, 2018 unejčastější způsob imunodetekce po western blottingu uširoká škála detekčních kitů založených na chemiluminiscenční reakci uprincip reakce: ucílový protein – neznačená primární Ab - sekundární Ab je konjugovaná s HRP (peroxidáza) – sem se přidá luminol uHRP katalyzuje oxidaci luminolu - vícekroková reakce, při které je emitováno chemiluminiscenční světlo (428 nm) ujeho množství je úměrné množství HRP (tj. množství sAb, pAb a cílového proteinu) uintenzitu reakce je možné zesílit (až 1000x) přidáním modifikovaných fenolů (p-iodofenol), které stimulují transfer elektronů mezi luminolem a HRP uúčinnější detekce signálu, zvýšení citlivosti detekce uenhanced chemiluminescence (ECL) – řada komerčně dostupných kitů u Detekce – chemiluminescence http://www.abnewswire.com/uploads/b294aa9327f379773b0b49445841e6e8.png (Geschwender et al., 2013) luminol Hyršlová Vaculová, 2018 Imunoprecipitace IP of Flag®-tagged proteins from a cellular extract Overexprese proteinu zájmu - DVL2, označený FLAG proteinem. Přes protilátku k FLAG z lyzátu „vytáhneme“ DVL2 v komplexu dalších proteinů, které se na něj vážou Pomocí WB tyto vazebné proteiny identifikujeme. Imunofluorescence uMísto buněk HEK (nejsou vhodné pro tuto aplikaci) použijeme buňky A375, ve kterých se konstitutivně exprimuje GFP (zelená) uVysejeme na krycí sklíčko (umístěné v jamce), další den přidáme Wnt a RSPO uDalší den pomocí protilátky k celkovému beta kateninu pozorujeme jeho translokaci do jádra. Tuto primární protilátku vizualizujeme pomocí II. protilátky s navázanou fluorescenční barvou Alexa 568 (emise v červené oblasti) uJádro nabarvíme pomocí DAPI (interkalační barvivo, modrá) uNa konfokálním mikroskopu Leica SP8 pozorujeme translokaci beta kateninu do jádra po působení Wnt. Počítání uKoncentrace bez přepočtu jednotek uSS 40 mM a a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM uTrojčlenka: 20 uM…..100 ul u 40 mM…. x ul u x/100=0,02/40… 0,0005.100=x uŘeděním I: 40 mM…. 100 ul u 20 mM…. 50 ul u 20 uM……50 nl = 0,05 ul uŘeděním II: 40 mM/0,02 mM = 2000 x ředěné u 100/2000 uVzorečkem: c1.V1=c2.V2 (pozor! Nutné stejné jednotky) u 40x=0,02.100 ul u uKoncentrace s přepočtem jednotek u SS: 40 mg/ml a potřebujeme 100 ul WS: 20 uM u Nutné znát Mr látky (např 80) u 1 M … 80 mg/ml u 0,5 M … 40 mg/ml u uŘedění buněk u Spočítáme si, že máme 0,35x10*6/ml = 0,7x10*6 b v 2 ml u A) chceme mít 1x10*6/1ml u zjistíme, kolik máme buněk celkem (0,7x10*6), Centrifugace a pak to doředíme 0,7 ml pufru u B) chceme odebrat 2x10*5 buněk = 0,2x10*6 buněk u 0,2/0,35=0,57 ml vezmeme z původní suspenze