Blokové cvičení z Metod aplikované biochemie a buněčné biologie 2023 Jméno: Stanovení aktivity b-cateninu Modelový systém: HEK 293 – Human Embryonal Kidney – epiteliální charakter https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=cz d DVL2 d DVL2 Agonista antagonista https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301468117300774 A) V nepřítomnosti ligandů Wnt, nebo v případě zablokování dráhy (DKK1, SFRP) je cytosolický b-catenin konstitutivně fosforylován v destrukčním komplexu (APC, CK1, AXIN, GSK3), následně ubiquitován a degradován v proteasomu. ZNRF3 a RNF43 (E3 ubiquitin ligázy) ubiquitinují, a tak destabilizují receptory Frizzled a LRP, čímž inhibují Wnt signalizaci. Wnt3a b-catenin RNF43 RSPO B) Vazba ligandů Wnt (Wnt3a) na jejich receptory LRP5/6 a FZD vede k fosforylaci proteinuDVL2, inhibuje se destrukční komplex, b-catenin se akumuluje, translokuje do jádra a umožňuje přepis genů, které mají v promotoru vazebné místo pro TCF/LEF transkripční faktor, na který se b-catenin váže. R-spondin (RSPO) posiluje Wnt signalizaci, protože vytváří ternární komplex LGR proteinů s ZNRF3/RNF43, čímž indukuje autoubiquitinaci ZNRF3/RNF43, což vede k jeho degradaci v proteasomu. Celá reakce je zesílena použitím 1 uM LGK-974 (Stock solution – SS: 1mM), inhibitoru acyltransferázy porcupine, která acetyluje Wnt v ER a umožnuje tak jeho sekreci. V přítomnosti LGK-974 není endogenní Wnt sekretován, proto buňky reagují lépe na exogenní Wnt stimulaci. Ve zkratce: > > Vzorky: 1. –CTR bez LGK-974 = catenin kontrolní hladina před ovlivněním exportu Wnt (450 ul DMEM) 2. CTR = catenin kontrolní hladina (450 ul DMEM + 0,45 ul LGK) 3. WNT3a = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 0,45 ul LGK) 4. RSPO = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM RSPO + 0,45 ul LGK) 5. WNT+ RSPO+ = catenin (150 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 150 ul CM RSPO + 0,45 ul LGK) [INS: :INS] [INS: :INS] PROTOKOLY Transfekce buněk Buňky vysejeme den předem (50x10*3 b na jamku v 24W desce - do 0,5 ml DMEM) Zkontrolovat, jestli je konfluence 70 – 80 % Příprava transfekčních směsí – na 1 jamku: SS plazmidu 500ng/ul 1. 100 ul DMEM pure + 150 ng každého plazmidu (celkem 0,45 ug DNA) výpočet: 500 ng…. 1 ul 150 ng…. 0,3 ul 2. 100 ul DMEM pure + 1,35 ul PEI (poměr DNA : PEI = 1:3, tj. 0,45x3 = 1,35) pRLtkLuc Super8X TOP Flash pmax GFP Výpočet: DMEM pure 345 368 251 PEI 1 jamka 100 0,3 0,3 0,3 1,35 ul 5+1 jamek 600 1,8 1,8 1,8 8,1 ul Připravené transfekční směsi důkladně zvortexujeme, krátce stočíme a necháme 10 minut inkubovat při RT. Obě zkumavky smícháme, důkladně promícháme a opět 10 minut inkubujeme při RT. Do každé jamky přidáme 203 ul výsledné transfekční směsi. Po 3 hodinách odsajeme vše z jamek, přidáme do vzorků 150 ul DMEM s 0,45 ul LGK (2,25 ul LGK + 750 ul DMEM) a 150 ul kondiciovaného média (CM) s WNT3a (W+) nebo R-spondinem (R+) (dle rozpisu vzorků). Doplníme do 450 ul DMEM. Do kontroly bez LGK přidáme jen 450 ul DMEM. Kontrolu označenou 0 vůbec nezpracováváme – je to kontrola bez ovlivnění. Vše inkubujeme přes noc v inkubátoru 37°C. Stanovení účinnosti transfekce Mikroskopicky - Fluorescenci vzorků způsobenou expresí plazmidu pMAX s GFP nafotíme na fluorescenčním mikroskopu kombinací modrého světla a zeleného filtru při zachování mírného osvětlení průchozím světlem, abychom byli schopni určit jak množství svítících buněk, tak počet všech buněk v zorném poli. Výsledek je poměr pozitivních buněk ku všem buňkám. Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. Pomocí ELISA readeru – lyzát vytvoření pro metodu TopFlash změříme na fluorimetru Hidex Sense při excitační vlnové délce 480 nm a emisi 509 nm. Srovnáme s netransfekovanou kontrolou. Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. Metoda TopFlash = Dual Luciferase Assay (kit Promega ) Odsajeme médium Přidáme opatrně 1 ml PBS, odsajeme, na sucho inkubujeme v -80 °C/ 5-10 min Rozmrazíme pufr LAR II a Stop & glow buffer Naředíme si 5x lyzační pufr – 1 jamka 50 ul, 6+1 jamek 350 ul, tj. 280 ul MQ H[2]O + 70 ul 5x lysis buffer Přidáme 50 ul 1x lyzačního pufru do každé jamky a inkubujeme 15 min/RT na třepačce Naředíme si 100x Stop & glow reagent v Stop & glow buffer (25 ul na jamku, 6+2 vzorky tj. 200 ul) Výpočet: ul Stop & glow buffer + ul Stop & glow reagent = 200 ul Nachystáme si luminometr Hidex Sense a stripy na měření Do jamek stripu nakapeme 20 ul lyzátu z každého vzorku (důkladně zhomogenizovaného) U luminometru velmi rychle přikápneme 25 ul LARII substrátu pro firefly (FF) luciferázu Změříme chemiluminiscenci Přidáme Stop & glow roztok pro renilla (R) luciferázu (inhibice aktivity FF luciferázy, substrát pro R luciferázu) Změříme chemiluminiscenci Výslednou hodnotu spočítáme jako podíl FF luciferázy a R luciferázy Výsledek: qRT-PCR Izolace mRNA Den předem byly vysety buňky (150 x 10^3 v 150 ul) a k buňkám byla přidána CM a LGK dle rozpisu. Vzorky opatrně opláchneme PBS a poté přidáme 0,5 ml Trypsin/EDTA, 5 min inkubace v 37 °C. Buňky přeneseme do eppendorfky, stočíme (200g/5 min), odstraníme supernatant. K peletu přidáme 350 μl lyzačního pufru RLT s 1 % merkaptoethanolem (Sigma Aldrich), důkladně zvortexujeme 30 sec, rychle stočíme a necháme inkubovat v RT 5 min. Výpočet: 5+1 vzorků = ul RLT + ul merkaptoetanolu K izolaci mRNA použijeme návod z komerčního kitu CatchGene - Cell and tissue kit. Přidáme 350 ul pufru RB, důkladně zvortexujeme 30 sec, rychle stočíme a znovu inkubujeme 5 min v RT. Vzorky přeneseme do kolonky vložené do 2 ml sběrné zkumavky. Centrifugace na max/1 min, vyměníme sběrnou zkumavku (RNA navázána na kolonku). Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace na max/1 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace na max /1 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 700 ul pufru RW2, centrifugace na max /1 min, vyměníme sběrací zkumavku (promývání) Centrifugujeme na max /3 min Vyměníme 2 ml zkumavku za 1,5 ml zkumavku, přidáme 30 ul RNase-free H[2]0, inkubace 2 min v RT Centrifugujeme na max /1 min (eluce) Eluát ještě jednou naneseme do kolonky a znovu zcentrifugujeme na max /1 min Naředíme si 1 ul vzorku + 9 ul RNase free H[2]O a změříme koncentraci vyizolované mRNA na spektrometru NanoDrop® ND-1000 Spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Izolovanou celkovou RNA uchováváme v –80 ˚C. Přepis mRNA do cDNA = reverzní transkripce Reverzní transkripce slouží k vytvoření templátu DNA (cDNA = complementary DNA), který bude vstupovat do polymerázové řetězové reakce (PCR). Celý proces je založen na použití reverzní transkriptázy, což je RNA dependentní DNA-polymeráza. Po celou dobu práce je nutné vzorky uchovávat na ledu kvůli jejich nestabilitě. PRÁCE NA LEDU! Z celkové RNA odebereme 1 ug (výpočet), který doplníme RNase free H[2]O do objemu 12 ul. Přidáme 1 μl 0,5 ug/ulM Oligo(dT), inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). Přidáme 4 μl 5x RT reakčního pufru, 2 μl 10 mM směsi nukleotidů dNTP a 1 μl (200 U) RevertAid reverzní transkriptázy (vše Thermo Fisher Scientific). Zamícháme a krátce centrifugujeme, inkubace hodinu při 42 ˚C a dalších 10 minut při 70 ˚C pro denaturaci enzymu, čímž ukončíme reakci. Vzorky cDNA jsou skladovány při -20 ˚C. Výpočet: Vzorek koncentrace RNA 1 ug RNA (ul) H[2]O (do 12 ul) Reakční mix pro RT: 1 vzorek 5+1 vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RevertAid RT 1 ul Real time PCR 1. Do každé jamky (20 ul) patří: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl[2]) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) vypočítej výslednou koncentraci: 1,7 ul MgCl[2] (SS 25 mM) vypočítej výslednou koncentraci: Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H[2]O Detekované geny: HPRT, ZNRF3, Axin2, cyklin D1 Sybr green 1. primer 2. primer MgCl[2] H[2]O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul 10+4 vzorků 42 5,25 5,25 23,8 182,7 ul Do jamek na dno napipetovat v duplikátu (vedle sebe) master mix pro daný gen Přidat 1,5 ul cDNA všech vzorků (podle rozpisu) jako kapku na horní část jamky HPRT ZNRF3 Axin2 CD1 Zcentrifugovat 5 min/4 °C, vložit do LC 480 (Roche) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A -CTR B CTR C W D R E W+R F G H Dopiš do obrázku teploty a dobu pro jednotlivé fáze cyklu 40 cyklů Vyhodnocení podle maxima 2. derivace křivky Výsledek: Western blotting Příprava SDS lyzátů Den předem byly vysety buňky (150 x 10^3 v 150 ul) a k buňkám byla přidána CM a LGK dle rozpisu. Ze vzorků odsajeme médium a opatrně přidáme 0,5 ml PBS, které také odsajeme Přidáme 100 ul Laemmli lyzačního pufru (sodium dodecyl sulfate, 2 % SDS, 10 % glycerol a 100 mM TRIS pH 6,8, 0,05 % bromfenolová modř, 25% merkaptoetanol). Inkubujeme 10 minut na ledu a následně přeneseme do zkumavek (vzorky je možné uchovávat v -20 °C). PRÁCE NA LEDU! Rozbití buněčných struktur a DNA provedeme sonikací a vařením na 95 °C/5 min v bločku. SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) 2x polyakrylamidový gel 8 %, tloušťka 1,5 mm, 15 jamek Před nanesením vzorků na gel je důkladně zvortexujeme. Do každé jamky v gelu napipetujeme 20 μl z každého vzorku a do krajních jamek napipetujeme 1,5 μl barevně značeného proteinového standardu (PagerRuler Plus Prestained Protein Ladder, ThermoScientific) dle rozpisu. Elektroforéza 130 V 1 hodinu (proteiny, jež díky SDS získaly záporný náboj, migrují ke kladné elektrodě). Wet blotting Přeneseme gely s proteiny rozseparovanými podle MW na metanolem aktivovanou PVDF (Polyvinylidene difluoride) membránu (Immobilon-P membrane, Merck, Kenilworth, USA), vyrobíme tzv. sandwich, důležité je myslet na to, že proteiny migrují ke + elektrodě a musí přitom přejít z gelu na membránu. 7 Složení použitých roztoků: Transferujeme proteiny na PVDF 100 V/70 minut, membránu vyjmeme, opláchneme promývacím pufrem. Blokujeme nespecifické vazby protilátek pomocí inkubace 20 minut v blokačním pufru (5 % roztok netučného sušeného mléka rozpuštěného v promývacím pufru). Imunodetekce Nařežeme membránu na proužky podle markeru molekulární hmotnosti tam, kde předpokládáme výskyt hledaných proteinů podle barevných standardů. Proužek vložíme do 50 ml falcon zkumavky, ve které jsou 3 ml roztoku blokačního pufru s příslušnými specifickými I. Ab protilátkami v příslušné koncentraci (viz obrázek). kDa 250 130 100 72 55 35 Total LRP6 150-250 kDa (1:1000) DVL2 90-95 kDa Tubulin alfa 55 kDa (cs-5335S, 1:1 000) R Inkubujeme přes noc 4 °C, na rolleru Studenti Kontrola kDa 250 130 100 72 55 35 pS1490-LRP6 150-250 kDa (cs-2568, 1:1 000) R Aktivní b catenin (ABC), 92 kDa (Millipore5665, 1:1000) M CK1 45 kDa M TCL IgG FlagMTCL IgG FLAGM –K K W R WRM Doplňte chybějící informace o výrobci Ab a ředení, a druhové specifitě. Membrány druhý den přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Připravíme nové falconky s 3 ml blokačního pufru se sekundárními protilátkami (II. Ab), konjugovanými s křenovou peroxidázou, ředěnými 1:5 000. Do II. Ab vložíme opláchnuté membrány (dle druhové specifity I.Ab) a inkubujeme na rolleru 60 minut/RT. Membrány přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Nachystáme si substrát pro peroxidázu s obsahem peroxidu vodíku a luminolu (Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate, Merck Millipore) – smícháme obě složky v poměru 1 ml : 1 ml. Membrány uspořádáme do původní podoby a zalijeme substrátem, který špičkou rovnoměrně rozmístíme a překryjeme fólií. Detekci signálu provedeme pomocí programu FusionSL a zařízení s CCD kamerou (Fusion SL, Vilber), které detekuje chemiluminiscenci vzniklou oxidací luminolu po rozštěpení peroxidu vodíku peroxidázou. Výsledek přiložte jako samostatnou přílohu Imunofluorescenční analýza translokace beta-cateninu do jádra (IF) Buňky A375 GFP (melanom kůže) vysejeme dva dny předem (50x10*3 b) na krycí sklíčka. Den předem přidáme kondiciovaná média dle rozpisu a inkubujeme přes noc. Odsajeme média a třikrát propláchneme PBS (sklíčka leží na dně jamek). Přidáme 4 % paraformaldehyd, inkubujeme 10 min/RT. Opláchneme v PBS, přidáme 250 ul 1% BSA v PBS na 30 min/RT. Permeabilizujeme v 0,1 % Tritonu X-100 v PBS 10 min/RT, opláchneme v PBS. Přidáme 250 ul I. protilátky mouse anti-total β-cat (BD) ředěné 1:1000 v 1% BSA, inkubace 2h/RT nebo ON/4 °C. Oplach v PBS 3x. Přidáme 250 ul II. Protilátky anti-mouse-Alexa 568 ředěné 1:600 v 1% BSA+ DAPI 1:1000, inkubace 1 h/ RT. Oplach PBS a zamontování do DAKO media (bodově přilepit lakem na nehty). Na konfokálním mikroskopu Leica SP8 pozorujeme zeleně zbarvené buňky, modrá jádra a červeně označený beta catenin, který by se měl po stabilizaci kumulovat v jádře. Výpočet: 10 ml 1 % BSA (prášková forma) v PBS: 2 ml 1 % TRITON X-100 (viskózní tekutina) v PBS: I. protilátka 5+1 vzorků = II. protilátka + DAPI: 5+1 vzorků = Výsledek: Imunoprecipitace vazebných partnerů Dvl Dva dny předem vysejeme HEK na 10 cm misku, tak abychom druhý den dosáhli 80 % konfluence, druhý den ráno provedeme transfekci pomocí PEI (poměr DNA : PEI = 1:3). 1. Smícháme 5 ug plazmidu DVL2-Flag s 500 ul DMEM pure – vortex výpočet: SS plazmidu (300 ng/ul) 2. Smícháme 15 ul PEI s 500 ul DMEM pure - vortex 3. Počkáme 10 min 4. Smícháme obě připravené směsi – vortex 5. Počkáme 30 min PRACUJEME NA LEDU!! Vychladíme předem centrifugu! Výslednou směs přidáme po kapkách k buňkám a po 6 hodinách vyměníme médium za nové. Další den odsajeme médium, opláchneme buňky PBS a odsajeme PBS. Zamrazíme buňky na sucho v -80 °C (aspoň 10 min). Přidáme 2 ml IP lyzačního pufru, přeneseme lyzát do zkumavky, jemně sonikujeme. Následuje centrifugace 12 000 g/12 min, 4 °C. Odebereme 100 ul supernatantu jakožto celkového buněčného lyzátu na WB. Zbytek supernatantu rozdělíme na 2 části. Do části A přidáme 1 ug (SS 1 ug/ul) I. protilátky mouse anti-FLAG M2. Do části B přidáme 1 ug nespecifické protilátky mouse anti-IgG (SS 1 ug/ul). Inkubujeme na rolleru 4 °C/ ON. Další den připravíme kuličky Protein A beads tak, že pufr, ve kterém jsou uchované, vyměníme za lyzační pufr: Odebereme dobře protřepané kuličky - 1 vzorek = 20 ul suspenze kuliček (slurry) a přidáme do 1 ml IP lyzačního pufru, centrifugujeme 200g/2 min/ 4°C. Odsajeme supernatant, přidáme 1 ml IP lyzačního pufru a opět centrifugujeme 200g/2 min/ 4°C. Přidáme stejné množství beads do FLAG i kontrolní IgG IP reakce. Inkubace 6 h, 4 °C. Promýt 4x pomocí IP lyzačního pufru a centrifugace 200 g/1 min/ 4°C, po poslední centrifugaci odsát co nejvíce. Přidat 200 ul 2x Laemmli buffer. Detekce vazebných partnerů DVL2 pomocí WB. Výpočet: Lyzační pufr (100 ml) 50 mM Tris pH 7.4 (SS 1M ) 150 mM NaCl (SS 5M NaCl) 0,5 % NP40 (SS 100% NP40) 1 mM EDTA (0,1M EDTA) přidat před použitím (10 ml): 1uM DTT (SS 1M) PIC (protease inhibitors coctail) 2 ul do 100 ul roztoku Výsledek viz Western blotting. Závěr: Napište, jak odpovídají naše výsledky předpokladům