ANTIMIKROBIÁLNÍ PEPTIDY Jednou ze základních imunitních odpovědí velké části bezobratlých živočichů je rychlá syntéza antimikrobiálních peptidů a polypeptidů (dále bude pro všechny používáno obecné označení antimikrobiální peptidy – AMP, nezaměňovat s adenosinmonofosfát), které zabíjejí nebo alespoň neutralizují potenciální patogeny. Důležitou vlastností těchto antimikrobiálních peptidů je jejich indukovatelnost. I když se mohou vyskytovat v organismu živočicha konstantně, během mikrobiální infekce se jejich hladina několikanásobně zvyšuje. Průměrná koncentrace AMP v hemolymfě hmyzu se pohybuje přibližně kolem 15 ?mol.l-1 a koncentrace peptidů v aktivním stavu je ještě nižší (Otvos, 2000). Již 2 - 4 hodiny po septickém zranění je však možno detekovat jejich zvýšenou syntézu. Ta je indukována buňkami mikroorganismů nebo pro ně charakteristickými strukturami jako lipopolysacharidy (LPS) nebo peptidoglykany, které se v organismu vážou na proteiny rozpoznávající tyto cizorodé struktury (viz kapitola 5.1). Indukční molekuly potom stimulují signální dráhy vedoucí k syntéze AMP. Exprese genů těchto peptidů dosahuje vrcholu pár hodin po začátku infekce a poté postupně klesá, což může být způsobeno např. postupným odstraňováním volného lipopolysacharidu z hemolymfy (upraveno podle Ponnuvel a Yamakawa, 2002). Nejvyšší koncentraci AMP v tělních tekutinách lze zjistit přibližně 7 - 8 dní po započetí infekce (Turner, 1994). K syntéze AMP dochází u hmyzu primárně v tukovém tělese a dále v menší míře v hemocytech, kutikulárních buňkách, buňkách střeva, slinných žlázách a také v reproduktivním traktu (Vilmos a Kurucz, 1998). U ostatních skupin bezobratlých jsou tyto peptidy vytvářeny především v imunitních buňkách a tkáních funkčně obdobných tukovému tělesu hmyzu. Podobně jako u hmyzu se však i u těchto živočichů podílejí na syntéze AMP také buňky z mnoha jiných částí organismu. Jedinec hmyzu syntetizuje v průměru 10 - 15 AMP, z nichž každý vykazuje poněkud jiné spektrum aktivity. Různé peptidy napadají také různé části cílových buněk a svým synergistickým působením tak vytvářejí dokonalou imunitní odpověď. Většina AMP je aktivní především proti bakteriálním a houbovým patogenům, ale byly popsány také peptidy působící proti virům (Cooper, 2006). V případě antibakteriálních peptidů se rozlišuje ještě aktivita peptidů proti Gram pozitivním (G+) a Gram negativním (G-) kmenům, což je důsledkem rozdílné stavby buněčné stěny těchto dvou typů bakterií (Obr. 2). Hmyzí antimikrobiální peptidy jsou velmi silné a jejich koncentrace potřebná k potlačení bakteriální infekce se pohybuje v submikromolárních nebo mikromolárních oblastech (Otvos, 2000). Ačkoli mají jednotlivé AMP různé oblasti působení a vykazují určité strukturální odlišnosti, lze u těchto peptidů nalézt také mnoho společných vlastností. Ve většině případů se jedná o molekuly kladně nabité, termostabilní, bazické a amfipatické, což znamená, že obsahují jak části hydrofilní tak hydrofobní. Běžnou vlastností AMP je také schopnost permeabilizovat buněčné membrány (zvyšovat jejich propustnost).  Obecný způsob působení antimikrobiálních peptidů Prvním krokem v mechanismu působení je elektrostatická interakce mezi kationickým peptidem a negativně nabitými složkami membrány patogenu. Zvýšení pozitivního náboje peptidu proto obvykle zvyšuje jeho mikrobicidní aktivitu. Kromě náboje peptidu je antimikrobiální aktivita ovlivňována také membránovými charakteristikami jako fosfolipidové složení, obsah sterolu, membránový potenciál nebo přítomnost polyanionů (např. LPS, zbytky sialové kyseliny) (upraveno podle Andreu a Rivas, 1998). Po navázání na membránu cílové buňky v ní pak peptidy vytvářejí kanály nebo jí prostupují dovnitř buňky, kde mohou ovlivňovat syntézu některých buněčných proteinů včetně těch, které se účastní se na tvorbě membrán. Jiné mechanismy působení je těžké odlišit od sekundárních následků permeabilizace buněčných membrán. Patří sem např. již zmíněná inhibice syntézy membránových proteinů, syntéza stresových proteinů, zastavení syntézy DNA nebo její poškozování. Některé AMP mohou také působit jako inhibitory enzymů nebo dokonce indukovat apoptózu eukaryotických buněk a autolýzu buněk prokaryotických. Některé AMP jsou také známy jako molekuly zprostředkovávající chemotaxi a adhezi imunitních buněk (upraveno podle Andreu a Rivas, 1998). Pro své potenciální klinické využití jsou AMP v současné době intenzivně zkoumány.  Klasifikace antimikrobiálních peptidů Do dnešní doby bylo izolováno a popsáno více než 500 antimikrobiálních peptidů (polypeptidů) a z toho přibližně 200 u hmyzu (Nappi a Ottaviani, 2000). Jejich názvy byly většinou odvozeny od jmen druhů, z nichž byly izolovány, a proto je obtížné odvodit z nich strukturní a funkční vztahy s ostatními peptidy. Podle strukturální a sekvenční podobnosti, kterou mohou sdílet i peptidy z velmi rozdílných organismů, jsou proto AMP rozdělovány do skupin, podskupin a peptidových rodin (Tab. 1).  Cyklické antimikrobiální peptidy AMP, v jejichž molekulách se nachází jeden nebo více disulfidických můstků, bývají označovány jako cyklické. Ke vzniku disulfidické vazby dochází mezi dvěma cysteinovými zbytky a podle počtu takto vzniklých intramolekulárních vazeb se cyklické AMP dále rozdělují do několika podskupin (Tab. 1). Vzhledem k poměrně vysokému obsahu aminokyseliny cysteinu v molekulách, bývají někdy cyklické AMP nazývány také jako na cystein bohaté (cysteine-rich) peptidy.   Defenziny Defenziny jsou hlavními zástupci cyklických antimikrobiálních peptidů. V jejich molekule se nachází šest konzervativních cysteinových zbytků, které mezi sebou vytvářejí tři pro defenziny charakteristické disulfidické můstky. Molekulová hmotnost těchto peptidů se pohybuje kolem 4 kDa, což je řadí mezi středně velké AMP velikostně srovnatelné např. s cecropiny (Vilmos a Kurucz, 1998). Stejně jako cecropiny jsou i defenziny syntetizovány ve formě prepropeptidu, který je aktivován proteolytickým štěpením. Defenziny se zdají být nejrozšířenější skupinou inducibilních peptidů. Do dnešní doby jich bylo popsáno u různých druhů hmyzu kolem třiceti. Jednotlivé analogy hmyzích defenzinů jsou označovány jako sapecin, defenzin, royalisin, phormicin apod. Byly izolovány ze zástupců hmyzích řádů Odonata, Diptera, Hymenoptera, Coleoptera, ze štíra Leiurus quinquestriatus a tzv. big defenzin z ostrorepa amerického Limulus polyphemus (Andreu a Rivas, 1998; Otvos, 2000). Kromě členovců byla defenzin kódující cDNA naklonována také např. z měkkýše druhu Chlamys farreri (Cooper, 2006). Velké množství defenzinů bylo popsáno i u savců a rostlin. Tyto peptidy však nejsou homologní s defenziny hmyzu. Narozdíl od většiny ostatních AMP, které působí převážně proti G- kmenům bakterií, defenziny selektivně zabíjejí G+ bakterie. Po navázání na peptidoglykanou vrstvu v jejich buněčné stěně působí na cytoplazmatickou membránu těchto buněk a formují v ní membránové kanály. Narušení membránové propustnosti vede k vážnému poškození cílových buněk a nakonec k jejich lyzi (upraveno podle Vilmos a Kurucz, 1998). AMP nazývaný big defenzin, který byl izolován např. z hemocytů ostrorepa druhu Tachypleus tridentatus, obsahuje ve své molekule tzv. clip domény. Identické domény byly nalezeny také v amino-koncové části dvou složek koagulačního systému korýšů - faktoru B a prosrážecím proteinu. Tato clip doména je z molekul uvolňována během proteolytického štěpení a může působit jako antimikrobiální složka podobně jako clip doména některých profenoloxidázu aktivujících enzymů (viz kapitola 5.1) (upraveno podle Jiravanichpaisal et al., 2006).  Další cysteine-rich antimikrobiální peptidy Kromě defenzinů, které jsou hlavní rodinou na cystein bohatých AMP, patří do této skupiny ještě mnoho dalších izolovaných peptidů. Jejich molekulová hmotnost se pohybuje přibližně mezi 2 - 6 kDa a všechny obsahují minimálně jeden disulfidický můstek jako např. thanatin. Tento peptid byl poprvé izolován ze zástupce řádu Hemiptera druhu Podisus maculiventris a vykazuje významnou sekvenční podobnost s brevininy – AMP z žabí kůže (Otvos, 2000). Dalšími zajímavými molekulami z této skupiny jsou dva AMP theromacin a theromyzin, které byly izolovány z coelomové tekutiny pijavice druhu Theromyzon tessulatum (Cooper, 2006). Theromyzin představuje první anionický AMP nalezený u bezobratlých živočichů. Oba jsou aktivní proti G+ bakteriím, obsahují ve své struktuře pět disulfidických můstků a jsou syntetizovány ve velkých tukových buňkách, které jsou v kontaktu s dutinou  coelomu. Přítomnost genů těchto AMP u zástupce kroužkovců a jejich exprese ve specifické tkáni funkčně odpovídající tukovému tělesu hmyzu představuje první důkaz antibakteriální odpovědi podobné hmyzu u této skupiny bezobratlých živočichů. Stručný přehled dalších cyklických AMP včetně jejich oblasti působení a druhu, z něhož byly poprvé izolovány, je uveden v Tab. 1.  Lineární antimikrobiální peptidy AMP, u nichž nedochází k vytváření intramolekulárních disulfidických vazeb, jsou řazeny do skupiny lineárních antimikrobiálních peptidů. Jako v případě cyklických AMP i lineární peptidy je možno rozdělit do několika podskupin v závislosti na struktuře jejich molekul. Základní podskupiny těchto peptidů jsou dvě (Andreu a Rivas, 1998): * lineární peptidy inklinující k přijetí ?-helikální konformace * lineární peptidy s neobvyklým složením (bohaté na AMK prolin, arginin nebo výjimečně tryptofan) Obě tyto podskupiny jsou dále členěny podle sekvenční podobnosti a oblasti svého působení do peptidových rodin (Tab. 1). V následujících kapitolách budou popsány alespoň základní podskupiny lineárních AMP.  Cecropiny Cecropiny jsou kationické, teplotně stabilní peptidy o molekulové hmotnosti přibližně 4 kDa (35 - 39 AMK). Jsou syntetizovány ve formě neaktivního prepropeptidu o velikosti 62 - 64 AMK, který je následně posttranslačně upraven několika proteolytickými štěpeními nejdříve na propeptid a nakonec na aktivní peptid. Jedná se o vůbec první indukovatelné antibakteriální peptidy, které byly izolovány a popsány. Jejich název byl odvozen od jména motýla druhu Hyalophora cecropia, z jehož hemolymfy byly poprvé získány. V primární aminokyselinové sekvenci cecropinů chybí cysteinové zbytky, které by umožňovaly tvorbu disulfidických můstků, a proto se cecropiny řadí mezi lineární antimikrobiální peptidy. Jejich struktura je tvořena dvěma amfipatickými ?-helixy vzájemně spojenými pantovou oblastí. Na karboxy-konci bývají cecropiny často posttranslačně modifikovány amidací, která brání štěpení karboxypeptidázami a poskytuje další vodíkovou vazbu pro vytvoření alfa-helixů (upraveno podle Otvos, 2000). Kromě již zmíněného druhu H. cecropia se cecropiny v různých izoformách nacházejí také u dalších zástupců řádu Lepidoptera a u druhů z řádu Diptera. Cecropinům izolovaným z jiných druhů hmyzu než H. cecropia byly dány různá jména jako např. bactericidin, ceratotoxin, sarkotoxin apod. Tyto peptidy bývají někdy uváděny jako cecropiny a někdy jako samostatné antimikrobiální peptidy, všechny jsou si však strukturně příbuzné. Do rodiny cecropinů patří také dva antimikrobiální peptidy savců, z nichž jeden byl izolován ze střeva prasete (cecropin P1) a druhý z bovinních nadledvin (Vilmos a Kurucz, 1998). Cecropiny jsou aktivní jak proti G+ tak proti G- bakteriím. Mechanismus jejich působení je založen na interakci ?-helixů s membránami cílových bakteriálních buněk, ve kterých indukují tvorbu napěťově závislých iontových kanálů. Následkem toho dochází k postupnému rozpadu membránových struktur a nakonec k lyzi buňky (upraveno podle Otvos, 2000).  Proline-rich peptidy Jak už napovídá samo označení této skupiny, jedná o peptidy, v jejichž molekulách se nachází velké množství AMK prolinu, vždy alespoň 25%. Molekulová hmotnost těchto peptidů se pohybuje v rozmezí 2 - 4 kDa a typické jsou pro ně opakující se sekvenční motivy Pro-Arg-Pro nebo Pro-His-Pro (Otvos, 2000). Vzhledem ke struktuře svých molekul jsou na prolin bohaté peptidy řazeny do nadskupiny lineárních AMP s neobvyklým složením. Pro tuto rodinu AMP je typická O-glykosylace na threoninových zbytcích ve středu řetězce. Tato posttranslační modifikace spočívající v navázání jednoho nebo více oligosacharidů byla zjištěna u všech na prolin bohatých peptidů s výjimkou abaecinu a apidaecinu a zdá se být nezbytnou pro jejich biologickou aktivitu. Jak bylo dokázáno, inkubace některých glykosylovaných peptidů s O-glykosydázou způsobuje ztrátu jejich antimikrobiální aktivity. Kromě udržování antimikrobiální aktivity byly pro glykosylaci navrženy také další funkce jako ochrana před proteázami nebo specifické rozpoznání mezi patogenem a peptidem. U apidaecinů dochází podobně jako u cecropinů k posttranslační úpravě amidací (upraveno podle Andreu a Rivas, 1998). Mezi proline-rich peptidy patří molekuly izolované z hmyzích řádů Diptera, Hemiptera Hymenoptera a Lepidoptera. Podobně jako např. cecropiny i tyto peptidy mají svou obdobu také u vyšších živočichů. Jedná se o AMP syntetizované ve střevě prasete a bovinních leukocytech, které ovšem nejsou homologní s hmyzími peptidy bohatými na prolin (Vilmos a Kurucz, 1998). K nejvýznamnějším členům této peptidové rodiny patří tři blízce příbuzné peptidy drosocin, pyrrhocoricin a apidaecin. Drosocin je i ve velmi malých koncentracích aktivní proti většině dosud studovaných G- kmenů bakterií a pyrrhocoricin vykazuje navíc aktivitu také proti G+ bakteriím. Mechanismus jejich působení spočívá pravděpodobně v proniknutí do mikrobiální buňky, kde poté deaktivují některé regulatorní proteiny důležité pro život bakterie. Tyto peptidy zřejmě nenarušují membránovou integritu nespecificky jako defenziny nebo cecropiny, ale spíše se váží na cílové bakteriální proteiny stereospecificky. Apidaeciny pronikají také dovnitř buněk, kde se nachází jejich konečný cíl, kterým je pravděpodobně některá ze složek mechanismu syntézy proteinů (upraveno podle Otvos, 2000). Dalšími důležitými AMP bohatými na prolin jsou abaeciny a lebociny, které zatím neznámým mechanismem napadají bakteriální membrány. Antibakteriální aktivita lebocinů je slabá a k tomu aby ji mohly vykazovat, potřebují prostředí o nízké iontové síle. Mohou primárně sloužit k redukci minimální inhibitorové koncentrace ostatních AMP za fyziologických podmínek (Ponnuvel a Yamakawa, 2002).  Glycine-rich peptidy a polypeptidy Charakteristickým pro tuto skupinu AMP je vysoký obsah AMK glycinu v jejich molekulách. Na glycin bohaté peptidy byly nalezeny u zástupců hmyzích řádů Diptera, Lepidoptera a Coleoptera. Základ této podskupiny AMP tvoří dvě hlavní peptidové rodiny. Ataciny jsou polypeptidy o molekulové hmotnosti přibližně 22 kDa, které jsou vysoce účinné proti Escherichia coli a několika dalším G- bakteriím. Typickým pro ataciny je výskyt jedné nebo více kopií tzv. G domény (Vilmos a Kurucz, 1998). Spolu s blízce příbuznými sarkotoxiny II tvoří tyto antibakteriální látky jednu ze základních rodin patřících do skupiny glycine-rich peptidů. Ataciny ovlivňují mechanismus buněčného dělení tak, že inhibují syntézu proteinů vnější membrány a jsou proto účinné pouze proti rostoucím bakteriím. Diptericiny byly, jak už jejich název napovídá, popsány u druhů z řádu Diptera a tvoří druhou hlavní rodinu na glycin bohatých AMP. Jsou přibližně 9 kDa velké a kromě atacinové G domény a na glycin bohaté karboxy-koncové oblasti obsahují také na prolin bohatou oblast na amino-konci (Vilmos a Kurucz, 1998). Z tohoto důvodu je jejich zařazení mezi glycine-rich peptidy stále sporné. Jejich způsob působení je také odlišný od atacinů, ale stejně jako ony jsou aktivní pouze proti G- kmenům bakterií. Mechanismus působení diptericinů spočívá v narušení integrity bakteriálních membrán a zvýšení jejich propustnosti. Podobně jako u cecropinů dochází i u těchto peptidů k posttranslační modifikaci amidací a stejně jako některé na prolin bohaté peptidy jsou diptericiny O-glykosylovány (upraveno podle Otvos, 2000). Z dalších AMP bohatých na glycin je zajímavý především antifungální peptid holotricin-3 izolovaný z brouka Holotrichia diomphalia, který vykazuje sekvenční podobnost s cyklickým antifungálním peptidem drosomycinem a také s rostlinnými antifungálními peptidy (Vilmos a Kurucz, 1998).  Rozšíření antimikrobiálních peptidů mezi bezobratlými Ačkoli je z hlediska AMP nejzkoumanější skupinou bezobratlých hmyz, mnoho těchto peptidů bylo nalezeno také u ostatních skupin bezobratlých živočichů. Jedním z nich je např. Ascaris suum antibakteriální faktor zkráceně ASABF, který byl, jak už jeho název napovídá, izolován ze škrkavky prasečí patřící do kmene Nematoda. Tento peptid, jehož geny byly zjištěny také v genomu druhu Caenorhabditis elegans, je aktivní zejména proti G+ bakteriím a je důkazem toho, že jsou AMP využívány už u hlístic (upraveno podle Andreu a Rivas, 1998). U evolučně starších živočichů z kmenů Porifera, Cnidaria a Platyhelminthes zatím nebyly obdobné peptidy s imunitní funkcí nalezeny. Přirozeně se vyskytující antibakteriální faktory byly nalezeny také u kroužkovců např. u mnohoštětinatce Glycera dibranchiata nebo máloštětinatce Eisenia foetida andrei. Glycera antibakteriální faktor zkráceně GAF je velký glykoprotein o molekulové hmotnosti 2,5 – 4,5 x 105 kDa a je baktericidní zejména pro G- bakterie. V coelomové tekutině E. foetida andrei bylo zjištěno hned několik antimikrobiálních faktorů o molekulové hmotnosti 20 až 175 kDa (upraveno podle Turner, 1994). AMP byly nalezeny také u některých druhů měkkýšů, ostnokožců a pláštěnců. Jejich příkladem mohou být např. defenziny izolované z hřebenatky Chlamys farreri nebo antibakteriální peptid clavanin nalezený u sumky druhu Styela clava (Cooper, 2006; URL 4). Jak již bylo zmíněno, velké množství AMP bylo izolováno ze zástupců členovců a to především z hmyzu. Příklady těchto peptidů jsou uvedeny v Tab. 1. Kromě bezobratlých živočichů se AMP nacházejí také u obratlovců a mnoha druhů rostlin.  Stanovení aktivity antimikrobiálních peptidů Studium AMP je prováděno na imunizovaných zvířatech, kterým byla injikována např. směs bakterií nebo jiný antigenní činitel. Tato injekce indukuje u pokusných živočichů syntézu AMP, které jsme schopni následně detekovat např. pomocí sodium dodecyl sulfát polyakrylamidové elektroforézy (SDS-PAGE). SDS je anionický detergent, který denaturuje proteiny a udílí jim negativní náboj, což má za následek, že při elektroforéze v polyakrylamidovém gelu se proteiny rozdělují pouze na základě své molekulové hmotnosti (nezávisle na náboji nedenaturovaného proteinu). Porovnáním výsledků SDS-PAGE se vzorky neimunizovaných zvířat a se standardy jsme nakonec schopni určit proteinové frakce, jejichž hladina syntézy se změnila nebo se nově objevily u imunizovaných živočichů včetně jejich molekulové hmotnosti (upraveno podle Hyršl a Šimek, 2005). Velmi důležitou charakteristikou AMP je stanovení jejich aktivity a oblasti působení. Jednou z nejčastěji používaných metod pro toto stanovení je metoda jednoduché radiální difúze v agarózovém gelu, která byla popsána v kapitole 3.1.1. Pro účely stanovení aktivity AMP jsou do gelu přidáváni zástupci různých kmenů mikroorganismů a do jamek je pipetován sledovaný vzorek, jímž může být např. odebraná hemolymfa zbavená buněk a s přidanými krystalky fenylthiomočoviny, která zabraňuje melanizaci. Kalibrace se provádí obvykle pomocí roztoků antibiotik o známé koncentraci (upraveno podle Mak et al., 2001; Meylaers et al., 2006).