Mezibuněčná signalizace
–
úvod
doc. RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi7005 Buněčné regulace / 1 / 20.9.2023
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
2
OSNOVA:
• Mezibuněčná komunikace
• Dosah signálů
• Reakce buňky na signál
• Druhy signálů
• Přenos signálů
• Signální kaskády
• Regulace signalizace
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
3
SIGNALIZACE ≈ KOMUNIKACE
• Převod extracelulárních signálů na intracelulární odpověď
• Převádění jedné formy signálu na druhou = transdukce signálu
• Uplatnění v komunikace mezi buňkou organismem
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
4
KLÍČOVÍ HRÁČI SIGNALIZACE
• Signální molekuly
- hydrofobní
- hydrofilní
• Receptory
- membránové
- cytosolické
• Přenašeče signalizace + druzí posli
• Efektorové proteiny
• Efekt
- rychlý (modifikace proteinů)
- pomalý (modifikace genové exprese)
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
5
Endokrinní signalizace
• Sekrece signální molekuly
• Typicky hormon v buňkách žlázy
• Transport cévní soustavou
• Působí ve vzdálené cílové buňce
Parakrinní signalizace
• Působení signální molekuly v blízkých/přilehlých buňkách
• Transport difuzí extracelulárním prostředím
• Např. neurotransmitery mezi neurony a svalovými buňkami
• Růstové faktory – tvorba gradientu – rozdílný efekt v závislosti na koncentraci
DOSAH SIGNÁLŮ
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
6
Autokrinní signalizace
• Odpověď buňky na vlastní signál
• Obvykle růstové faktory
• Např. buňky in vitro nebo nádorové buňky
Přímá mezibuněčná (cell-cell) signalizace
• Mezi membránovými proteiny dvou buněk
• Receptor – ligand
• Proteolytické štěpení membránového proteinu
-> uvolněné extracelulární části jako solubilního ligandu
Kombinovaná signalizace
• Adrenalin – jako hormon (endokrinní) nebo jako neurotransmiter (parakrinní)
• EGFR – membránově vázaný (cell-cell) nebo solubilní (autokrinní nebo parakrinní)
DOSAH SIGNÁLŮ
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
7
DOSAH SIGNÁLŮ
Signály nervové soustavy
• Působí na velké vzdálenosti (m)
• Směr signálu dán nervovým nebo svalovým vláknem
• Elektrické impulsy (změna membránového potenciálu)
se na synapsích mění na parakrinní signalizaci mediátory
Propojení cytosolů buněk
• Přímá výměna molekul mezi buňkami
• Gap junctions (konexiny) – u živočišných buněk
• Plasmodesmata u rostlinných buněk
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
8
REAKCE BUŇKY NA SIGNÁL
• Žádná buňka v organismu není v izolaci
• Buňky musí vnímat stimuly okolního prostředí a odpovídat na ně
• Velké množství signálů různých druhů
- Sekretované nebo navázané na membránu: hormony, růstové faktory, neurotransmitery, feromony…
- Změna koncentrace metabolitů: plyny, živiny…
- Změna fyzikálních podmínek: světlo, teplo, kontakt…
• Odpovídající velké množství receptorů
• Relativně málo nitrobuněčných přenašečů
• Buněčná odpověď - efekt
• Změna chování buněk
- Aktivace syntézy DNA
- Pohyb
- Diferenciace
- Smrt
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
9
REAKCE BUŇKY NA SIGNÁL
• Citlivost je dána přítomností receptorů
• Z velkého množství exprimuje každá buňka jen některé
• Kombinace signálů – rozdílný efekt
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
10
REAKCE BUŇKY NA SIGNÁL
• Různé typy buněk mohou exprimovat různé receptory pro stejný
ligand -> různá odpověď
• Např.
- Aktivace různých receptorů pro acetylcholin v srdečních, slinných
a svalových buňkách
• Aktivace stejného receptoru na různých buňkách může vézt k jiným
odpovědím = efektorová specifita
• Např.
- Aktivace receptoru pro adrenalin u hepatocytů
a svalových buňkách -> rozpad glykogenu na glukózu
- Aktivace stejného receptoru u adipocytů -> hydrolýza a sekrece tuků
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
11
POUŽITÍ AGONISTŮ A ANTAGONISTŮ V MEDICÍNĚ
• Možnost ovlivnění různých signálních drah
• Aplikace syntetických analogů ligandů medicíně
• Agonista (působí pozitivně) – stejná funkce jako ligand, vazba
na receptor -> odpověď
• Antagonista (působí negativně) - vazba na receptor, blokuje
vazbu ligandu -> bez odpovědi
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
12
POUŽITÍ AGONISTŮ A ANTAGONISTŮ V MEDICÍNĚ
Příklad:
• Adrenalin (epinefrin) – produkce dření nadledvin
• Agonista: isoproterenol – vazba (10x silnější než adrenalin) na
adrenalinové receptory buněk hladkého svalstva průdušek -> dilatace
-> léčba astma
• Antagonista: alprenolol – blokátor β-adrenalinových receptorů (βblokátor)
– vazba na adrenalinové receptory buněk srdečního
svalstva -> zpomalení kontrakcí -> léčba arytmií a anginy pectoris
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
13
SPECIFICITA vs. ROBUSTNOST SIGNALIZACE
• Velké množství různých signálních molekul
• Nutnost předejít chybné signalizaci
• Vysoká specificita a afinita mezi proteiny předávajícími si signál
✓ Např. kinázy mají aktivní místo rozeznávající AMK sekvenci okolo fosforylačního rezidua na cílovém
proteinu nebo signalizační enzymy obsahují dokovací místa (mimo místa enzymatické aktivity) pro
interakci s komplementárním místem na cílovém proteinu
✓ Redukce signálního šumu okolí je dána např. větším počtem míst fosforylace
✓ Stálá -ale nízká- hladina aktivních fosfatáz
✓ Aktivace musí být silná aby překonala fosfatázy
• Signální systém musí překonat variabilitu v koncentraci a aktivitě signálních molekul
• Často paralelní mechanismy aktivace cílového proteinu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
14
VARIABILITA VZTAHU SIGNÁL – ODPOVĚĎ
Rychlost odpovědi:
• Závislá na požadavku rychlosti získat odpověď a na typu intracelulárního přenašeče
• RYCHLÁ
- Změna konformace iontového kanálu v synapsi –> změna membránového potenciálu: milisekundy
- Změna fosforylace proteinů: sekundy – minuty
• POMALÁ
- Změna exprese genů a jejich syntéza: minuty – hodiny
- Řízení morfogeneze, dělení, růst: hodiny - dny
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
15
VARIABILITA VZTAHU SIGNÁL – ODPOVĚĎ
Přetrvání odpovědi:
• Závislé na požadavku rychlosti udržet odpověď (synapse: přechodně; vývojové pochody: dlouhodobě)
• Role pozitivní a negativní zpětné vazby
• Závislé na obratu (turnover) konkrétního proteinu
10x zvýšená syntéza10x snížená syntéza
• Proteiny s rychlým obratem (červené) se rychle
degradují/syntetizují po zásahu do exprese
• Proteiny s pomalým obratem (zelené) se pomalu
degradují/syntetizují po zásahu do exprese
• Poločas (half-life) proteinu je doba, za kterou
dosáhnou ½ předpokládaného množství
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
16
VARIABILITA VZTAHU SIGNÁL – ODPOVĚĎ
Zpracování signálu:
• Různorodý typ odpovědi:
- jednoduchý signál -> složitá odpověď
- jednoduchý signál -> opakující se odpověď
• Závislost odpovědi na koncentraci signálu
- Narůstající intenzita odpovědi až do dosažení saturace
signální dráhy (modrá), při regulaci hormony
- Potlačení odpovědi při nízké koncentraci = potlačení
signálního šumu, intenzivní nárůst odpovědi při střední
koncentraci (červená), při násobné fosforylaci proteinu
- Po překročení určité koncentrace, jednoznačná odpověď
„všechno nebo nic“ (zelená), při výběru mezi dvěma stavy
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
17
VARIABILITA VZTAHU SIGNÁL – ODPOVĚĎ
Senzitivita k signálům:
• Závisí na koncentraci ligandu (hormony: nízká koncentrace = citlivé receptory; neurotransmitery: vyšší
lokální koncentrace = méně citlivé receptory)
• Vliv vnitrobuněčné amplifikace
Dynamické rozpětí signalizace:
• Závisí na senzitivitě a druhu buněčné odpovědi (vývojové pochody: úzké rozpětí koncentrace ligandu;
metabolická odpověď na hormony: široké rozpětí závislé na koncentraci ligandu)
Regulace zpětnou vazbou – regulace většiny biologických procesů
• Pozitivní zpětná vazba – výstup stimuluje svou produkci
• Negativní zpětná vazba – výstup inhibuje svou produkci
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
18
Pozitivní zpětná vazba
• Typicky pro sigmoidní a „všechno nebo nic“ odpověď
• Po spuštění odpovědi není původní signál už potřeba
• Systém má dvě pozice ON/OFF a signálem se zapíná
• Přechodný signál -> dlouhodobá odpověď
• Např. diferenciační kroky
Zkreslení buněčné odpovědi vzhledem k buněčné populaci
• Odpověď „všechno nebo nic“ může být zkreslena populací
• Variabilita mezi buňkami
• Nutnost studia odpovědi na úrovni buňky
• Příklad: aktivace MAPK progesteronem u oocytů
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
19
Negativní zpětná vazba
• Zkracuje a limituje hladinu odpovědi
• Účinnější proti výkyvům
• Různé způsoby zpětné vazby -> různá odpověď
• Krátké zpoždění zpětné vazby -> rychlé utlumení odpovědi
• Při vzrůstu intenzity signálu -> opět potlačení -> adaptace
• Dlouhé zpoždění zpětné vazby -> oscilace odpovědi
• Oscilace mají často jak negativní, tak pozitivní zpětnou
vazbu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
20
Adaptace (desenzitizace) = ukončení signálu
• umožňuje odpovídat na změny intenzity signálu spíš než na celkové množství signálu
příklad: zprostředkování vidění, nezávisle v širokém rozmezí intenzity světla
• nutnost inhibice v průběhu signalizace -> redukce odpovědi
- Negativní zpětná vazba s krátkým zpožděním – např. inhibice upstream kinázy
- Stejný signál aktivuje současně i pomalejší inhibiční dráhu
- Deaktivace receptoru – samovolně (vazba arrestinu blokuje G protein), endocytóza, destrukce
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
21
VARIABILITA VZTAHU SIGNÁL – ODPOVĚĎ
Integrace:
• odpověď se integruje z více signálů; závislost na
vnitrobuněčných přenašečích; uplatnění pro složité
buněčné procesy (růst, proliferace, diferenciace..)
Koordinace:
• více buněčných procesů je řízeno jedním extracelulárním
signálem; např. růstový faktor -> růst a dělení; nutnost
distribuce signálu k různým efektorům -> tvorba signálních
větví
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
22
PRŮCHODNOST MEMBRÁNY PRO LIGANDY
• rozhoduje velikost a chemická povaha signální molekuly
• velké a hydrofilní molekuly nemohou membránou projít aktivují
povrchové receptory
• malé a hydrofobní molekuly difundují membránou a vážou se
na nitrobuněčné receptory
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
23
• hydrofobní a nízkomolekulární
• procházejí membránou
• vážou se na receptory v cytosolu nebo jádře
• jejich receptory fungují jako regulátory genové
exprese závislé na ligandech
• vazba ligandu - změna konformace receptoru změna
schopnosti vazby DNA nebo aktivace
exprese cílových genů
SIGNALIZACE STEROIDNÍMI A THYROIDNÍMI HORMONY
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
24
VAZBA LIGANDU NA RECEPTOR
• Molekulární komplementarita – definuje sílu interakce
✓ Afinita (síla chemické vazby) - nekovalentní (slabá)
vazba: iontová vazba, van der Waalsovy síly,
hydrofobní interakce
✓ Tvar molekul
• Vazebná specificita – udává schopnost
receptoru vázat/nevázat podobné molekuly
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
25
VAZBA LIGANDU NA RECEPTOR
• Vazba ligandu na extracelulární doménu/y (platí pro membránový receptor)
• Indukce konformačních změn v molekule receptoru
• Transformace na intracelulární signál
• Aktivace vnitrobuněčných přenašečů
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
26
HLAVNÍ TYPY MEMBRÁNOVÝCH RECEPTORŮ
• Extracelulární signály - vazba na receptor - nepronikají do buňky
• Receptory fungují jako přenašeče signálu (signal tranducers)
• Změna z extracelulárního signálu na intracelulární
❑ Receptory spřažené s iontovými kanály (Ion-channel-coupled receptors, ionotropní receptory)
❑ Receptory spřažené s G-proteiny (G-protein-coupled receptors, GPCRs)
❑ Receptory spřažené s enzymem (Enzyme-coupled receptors)
Receptory spřažené s iontovými kanály
• Rychlá signalizace na synapsích pomocí neurotransmiterů
• Přechodné otevření/zavření iontového kanálu
• Změna permeability membrány mění excitabilitu postsynaptické cílové buňky
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
27
Receptory spřažené s G-proteiny
• Nemá vlastní enzymatickou aktivitu
• Řídí aktivitu dalších membránových proteinů:
- enzymů
- iontových kanálů
• Prostřednictvím membránového G-proteinu (GTP-binding regulatory protein)
• Aktivace cílového proteinu:
- mění koncentraci intracelulárních signálních molekul
- permeabilitu membrány
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
28
Receptory spřažené s enzymem
• Mají vlastní enzymatickou aktivitu nebo jsou přímo spojeny s enzymaticky aktivním proteinem
• Obecná struktura:
- extracelulární doména: vazba ligandu
- transmembránová doména: většinou jen 1x
- intracelulární doména: vlastní katalytická aktivita nebo vazba enzymu
• Často funkce proteinkinázy nebo spojení s proteinkinázou
• Transdukce signálu fosforylací
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
29
INTRACELULÁRNÍ SIGNALIZAČNÍ KOMPLEXY NAVAZUJÍCÍ NA MEMBRÁNOVÉ RECEPTORY
• Velké proteinové komplexy v blízkosti/na receptorech
• Proteiny jsou blízko sebe –> zvýšení specificity interakce
• Interakce především mezi sebou –> snížení signálního šumu okolí
• Např.: sestavení na „scaffold“ proteinech, sestavení na receptorech, sestavení na fosfoinositidových
dokovacích místech
Sestavení signalizačního komplexu na „scaffold“
proteinech
• Tvorba signálních komplexů ještě před přijetím
signálu
• Receptor + navazující signální proteiny
• Vysoká lokální koncentrace zapojených proteinů
• Specificita signalizace
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
30
Sestavení signalizačního komplexu na receptoru
• Přechodné sestavení
• Závislé na extracelulárním signálu
• Tvorba přímo na receptoru
• Vazba proteinů na fosforylovaná rezidua receptoru
• Rozpad po odeznění signálu
Sestavení signalizačního komplexu na fosfoinositidových
dokovacích místech
• Aktivace receptoru modifikuje membránové fosfolipidy
• Fosfoinositidy (fosfatidylinositol-mono/di/tri-fosfáty)
• Vazba a aktivace signálních molekul
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
31
INTERAKCE MEZI SIGNÁLNÍMI PROTEINY POMOCÍ
MODULÁRNÍCH DOMÉN
• Při tvorbě signalizačního komplexu – těsná interakce proteinů
• Sestavení komplexu závisí na malých, vysoce konzervovaných
doménách = moduly
• Vazba modulu jednoho proteinu na odpovídající strukturální
motiv druhého proteinu nebo lipidu
• Motiv: peptidová sekvence, kovalentní modifikace (fosforylace
AMK), proteinová doména…
• Využití interakce modulárních domén -> evoluce nových
signálních drah
• Zařazení modulu/ů bez poškození funkce -> nové interakce ->
zařazení do nové signální dráhy
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
32
INTERAKCE MEZI SIGNÁLNÍMI PROTEINY POMOCÍ MODULÁRNÍCH DOMÉN
• Velké množství různých domén
• Vazba proteinů mezi sebou nebo na membránu
• Příklady domén:
- Src homology 2 (SH2) a phosphotyrosine-binding (PTB)
- Vazba na fosforylované tyroziny aktivovaných proteinů
- Src homology 3 (SH3)
- Vazba na aminokyselinové sekvence bohaté na prolin
- Pleckstrin homology (PH)
- Vazba na polární části membránový fosfoinositidů
• Adaptorové proteiny
- Dvě a více domén
- Propojení proteinů do dráhy
- Někdy vlastní signální aktivita
Signální komplex navázaný
na insulinový receptor
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
33
TRANSDUKCE SIGNÁLU – MOLEKULÁRNÍ PŘEPÍNAČE (molecular switches)
• Přenos intracelulárního signálu často skrze „přepínací“ proteiny
• Dvě pozice ON/OFF
• Signál převádí stav přenašeče z neaktivního do aktivního stavu
• proteinkinázy/fosfatázy - připojení nebo odpojení zbytku kyseliny fosforečné
• GTPázy - připojení nebo odpojení GTP/GDP
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
34
TRANSDUKCE SIGNÁLU – PROTEINKINÁZY/FOSFATÁZY
Proteinkinázy:
• Enzymy - fosforylují cílový protein
• Rozpoznání cílového reziua a okolních aminokyselin
• Kovaletní vazba fosfátové skupiny na –OH specifické aminokyseliny
• Tyrozin (Tyr, Y), serin (Ser, S), treonin (Thr, T)
• Vznik fosfo-proteinu
• Změna náboje, popř. konformace -> vliv na lokalizaci, aktivitu, stabilitu,
vazbu s jinými proteiny či DNA, tvorbu komplexů,
schopnost podléhat dalším modifikacím
• Lidský genom: ≈ 500-600 proteinkináz = kinom
• Několik velkých skupiny podle příbuznosti
Tyrozin
Serin
Threonin
https://www.cellsignal.com/learn-and-support/protein-kinases/human-
protein-kinases-overview?_requestid=2628551
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
35
TRANSDUKCE SIGNÁLU – PROTEINKINÁZY/FOSFATÁZY
Fosfatázy:
• Enzymy - hydrolyzují fosfátové skupiny
• Protihráč proteinkináz
• Lidský genom ≈ 100 fosfatáz = fosfatom
http://phosphatome.net/3.0/
Společně:
aktivace/deaktivace cílového proteinu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
36
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
37
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
38
TRANSDUKCE SIGNÁLU ZPROSTŘEDKOVANÁ KINÁZAMI
Model:
• Proteinkináza navázaná na receptor
• Cílový protein - transkripční faktor
1) Vazba ligandu -> aktivace receptoru -> aktivace kinázy
2) Aktivace kinázy -> fosforylace cílového proteinu
3) Fosforylace cílového proteinu -> dimerizace
4) Dimerizace -> transport do jádra -> efekt
5) Efekt -> aktivace jaderné fosfatázy -> konec efektu
6) Konec efektu -> inaktivní cílový protein do cytoplasmy
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
39
REGULACE SIGNÁLU ZPROSTŘEDKOVANÁ KINÁZAMI
• Signální dráha = řada aktivačních kroků
• Většina kroků je regulovatelná/inhibovatelná
• Dva inhibiční kroky po sobě -> aktivace
Např.: ligandem aktivovaná kináza může
inhibovat protein (fosforylací), který
inhibuje určitou buněčnou odpověď
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
40
TRANSDUKCE SIGNÁLU – GTPázy (GTP FOSFOHYDROLÁZY )
• Velká superrodina proteinů: heterotrimerické G proteiny, malé GTPázy, translační faktory, a další…
• Regulují funkce: syntéza proteinů, transport proteinů, tvorba váčků, fúze váčků, reorganizace cytoskeletu…
• Fungují jako přepínač ON/OFF
• Váží GTP (guanozintrifosfát) = aktivní forma (ON)
– mění aktivitu cílového proteinu
• Hydrolyzují GTP na GDP (guanozindifosfát) = inaktivní forma (OFF)
– nemění aktivitu cílového proteinu
• Délka aktivace - závisí na GTPázové aktivitě
Regulační proteiny
• GEF (guanine nucleotide-exchange factors) - podporují aktivitu
• GAP (GTPase-activating proteins) - podporují hydrolýzu GTP
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
41
GTPázy (GTP FOSFOHYDROLÁZY )
Heterotrimerické G proteiny
• Složené ze 3 podjednotek
• α, β, γ (všechny mají několik variant)
• Navázané na receptor (transmembránový) – funguje jako GEF
• Aktivace receptorem
• Po aktivaci – uvolňují GDP, váží GTP
Malé monomerické G proteiny
• Homologní k alfa podjednotce
• Např. Ras, Ras-like
• Interakce s receptorem přes adaptorové proteiny a GEFs
• Změny v konformaci po navázání GTP/ hydrolýze
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
42
PŘEPÍNÁNÍ MONOMERNÍHO G PROTEINU (RAS)
ON:
• 2 domény (Switch I a II) – vazba s fosfátem GTP
• Konformační změna proteinu
• Domény Switch interagují s cílovým proteinem
OFF:
• Po hydrolýze fosfátu –relaxace Switch domén
• Konformační změna proteinu
• Domény Switch NEinteragují s cílovým proteinem
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
43
AKTIVACE HETEROTRIMERICKÉHO G PROTEINU
• Může být s receptorem přímo asociovaný nebo až po aktivaci receptoru
• 3 podjednotky: α, β, γ
• V neaktivní stavu – Gα váže GDP
• Po aktivaci receptor funguje jako GEF
(guanine nucleotide-exchange factors)
• Výměna GTP za GDP
• Konformační změna α podjednotky
• Uvolnění G proteinu od receptoru
• Disociace Gα od dimeru Gβγ
• Gα aktivuje efektorový protein
• Gβγ také může přenášet signál
• Hydrolýza GTP -> GDP uvolní Gα z efektoru
• Znovusestavení G proteinu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
44
EXPERIMENTÁLNÍ PRŮKAZ RYCHLOSTI AKTIVACE G PROTEINU
Pomocí metody FRET - Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer
• studium interakce fluorescenčně značených molekul
• měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami (1-10 nm)
• 2 fluorofory: donorový + akceptorový navázané na 2 proteiny
• Podmínka: překryv emisního spektra donoru s excitačním spektrem akceptoru
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
45
UKONČENÍ SIGNALIZACE
Desenzitizace G proteinu
• Vazba regulačních proteinů (např. RGS , regulator of G protein signaling)
• Urychluje GTPázovou aktivitu, ukončuje signalizaci
Desenzitizace receptoru
• Fosforylace kinázami (PKA, PKC, GPCR kinázy)
• Vazba arrestinu
• Zabraňuje interakci s G proteinem, váže proteiny pro endocytózu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
46
Alfred G. Gilman Martin Rodbell
The Nobel Prize in
Physiology or Medicine
1994
"for their discovery of G-proteins and
the role of these proteins in signal
transduction in cells"
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
47
Receptory spřažené s G-proteiny
jako cíle léčiv
• Velké množství receptorů reguluje velké
množství buněčných procesů
• Podíl na různých patologiích
• Cíle léčby: použití antagonistů i agonistů
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
48
21
EFEKTOROVÉ PROTEINY G PROTEINŮ
• iontové kanály
• membránové enzymy zodpovědné za tvorbu sekundárních přenašečů
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
49
NAPOJENÍ G PROTEINŮ NA MEMBRÁNOVÉ ENZYMY
• Transdukce signálu do cytosolu – tvorba druhých poslů
• Typ Gα určuje typ efektoru
• Enzymy:
- Adenylátcykláza – cyklický adenosinmonofosfát (↑↓ cAMP)
- Fosfolipáza C – inositoltrifosfát (↑IP3), diacylglycerol (↑DAG)
- cGMP fosfodiesteráza – cyklický guanosinmonofosfát (↓cGMP)
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
50
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
51
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
52
Adrenalin a stresová reakce organismu "fight-or-flight"
• Adrenalin se váže na různé receptory různých buněk
• Aktivace β1-adrenergního receptoru buněk srdeční
svaloviny -> Gαs -> tvorba cAMP -> zvýšení kontrakce a
krevního zásobení
• Aktivace α1-adrenergního receptoru buněk hladké
svaloviny v trávící soustavě, kůži a ledvinách -> Gαq ->
tvorba druhých poslů DAG a IP3 -> zúžení cév, snížení
průtoku krve, rozpad glykogenu
• Aktivace α2-adrenergního receptoru u jiných skupin
somatických buněk -> Gαi -> inhibice tvorby druhého
posla cAMP
Integrovaná odpověď organismu s cílem zásobovat svaly
energií, ostatní tkáně omezeny, srdeční stimulace,
mobilizace cukrů a tuků, roztažení dýchacích cest
RECEPTOR A G-PROTEIN URČUJE BUNĚČNOU ODPOVĚĎ
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
53
BAKTERIÁLNÍ TOXINY JAKO INHIBITORY FUNKCE G PROTEINŮ
Cholera toxin
• produkován původcem cholery Vibrio cholerae
• prochází plasmatickou membránou epiteliálních střevních buněk
• Katalyzuje kovalentní změny Gαs
• Gαs stále aktivní –> aktivuje adenylát cyklázu bez aktivace receptoru
• Neustále zvýšená produkce cAMP -> ztráta iontů (Cl-) a vody z buněk do střeva
• Průjem = typický příznak cholery
Pertusový toxin
• produkován původcem černého kašle Bordetella pertussis
• prochází plasmatickou membránou buněk epitelu dýchacích cest
• Modifikuje Gαi - brání uvolnění GDP
• Gαi zůstává v inaktivním stavu -> neinhibuje adenylát cyklázu
• Neustále zvýšená produkce cAMP -> ztráta iontů a vody z buněk, tvorba hlenu
• Dávivý kašel = typický příznak černého kašle
• Oba toxiny – použití ve výzkumu, zjištění, zda jde signalizace přes Gαs nebo Gαi
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
54
TRANSDUKCE SIGNÁLU PRVNÍM A DRUHÝM POSLEM
První posel (1st messenger)
• Extracelulární ligand – relativně velký protein (INS, EGF: 6-7 kDa; FGF2, TGFβ: 20-30 kDa)
• Velký počet různých ligandů
• Vazba na membránový receptor
Druhý posel (2nd messenger)
• Malé molekuly (Ca: 40 Da; fosfoinositidy: ≈1 kDa)
• Omezený počet (6 u živočichů)
• cAMP; cGMP; 1,2-diacylglycerol (DAG); Ca2+;
• inositol 1,4,5-trisphosfát (IP3); fosfoinositidy
• Rychlá difuze cytoplasmou k cílům
• Usnadňuje amplifikaci signálu
Insulin
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
55
TRANSDUKCE A AMPLIFIKACE SIGNÁLU
• Signální dráha – kombinace signálních proteinů
• Každý stupeň transdukce může amplifikovat signál
• Vznik amplifikační kaskády
• Aktivace/inhibice velkého množství cílového proteinu
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
56
TRANSDUKCE A AMPLIFIKACE SIGNÁLU
Příklad: Adrenalinová signalizace -> glykogenolýza v hepatocytech
• Adrenalin (epinefrin) - velmi nízká koncentrace v krvi
• Vazba na β-adrenergní receptor (spřažený s G-proteinem)
• Aktivace adenylátcyklázy
• Syntéza cAMP (druhý posel) - 10.000x víc molekul než signálu
• Další 3 katalytické kroky - 10.000x zesílení
• Celkem: 108 x zesílení signálu -> štěpení glykogenu -> produkce glukózy
Bi7005 Buněčné regulace / 01 / 20.9.2023
57