5 Regulace buněčné adheze a polarity
prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi7005 Buněčné regulace / 05
2
Buněčná adheze
Bi7005 Buněčné regulace / 05
3
CO JE TO BUNĚČNÁ ADHEZE?
 Fyzická interakce buňky s extracelulární matrix nebo mezi dvěma buňkami navzájem.
 U adhezí rozlišujeme:
 Dobu/sílu interakce (tranzientní vs. stabilní)
 Typ molekul, které adhezi zprostředkují (cadheriny, integriny, jiné…)
 Funkci adheze (signalizace, pohyb, mechanotransdukce, transport, izolace)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
4
ORGANIZACE BUNĚČNÝCH SPOJŮ - JEDNOVRSTEVNÝ EPITEL
Těsné spoje
• spojují membrány sousedících buněk
• hlavní funkce je izolační, není u všech
epitelů
• claudiny, occludin
Kotvící spoje – zajišťují propojení s
cytoskeletem (mechanické vlastnosti)
A. mezibuněčné – zprostředkované
kadheriny
1. adhezní spoje – s aktinovým c.
2. desmozomy – s intermed. fil.
B. buňka k ECM – zprostředkované integriny
A. fokální adheze – s aktinovým c.
B. hemidesmozomy – s intermed. f.
Vodivé spoje – gap junctions
• umožňují intercelulární transport malých
rozpustných molekul (do 1,5 kDa)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
5
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Kadheriny a jejich regulace
6
KADHERINY
 Velká rodina proteinů, obsahujících více tzv. kadherinových domén
 Extracelulární Ca2+ (Cadherin) je vyžadován jako kofaktor pro vazbu mezi Nterminálními
doménami
 Vazba je tzv. homofilní (vazebným partnerem je pouze jiný kadherin)
 Klasické kadheriny (propojení s aktin. filamenty): E, N, P-cadherin
 Desmozomální (propojení s interm. filamenty): desmogleiny, desmocolliny
 Protokadheriny (mnoho, různé funkce) – např. Fat (buň. polarita)
 Nekonvenční kadheriny (další) – např. CELSR/Flamingo, T-cadherin
Bi7005 Buněčné regulace / 05
7
 Klasické kadheriny mají do 5 kadherinových
domén, neklasické mohou mít až 30.
 Kadheriny se také velmi liší ve svých
intracelulárních doménách:
 Flamingo/Celsr má 7 transmembránových
domén, čímž se podobá GPCR receptorům
 T-cadherin je v membráně zakotvený pouze
glykosylfosfatidylinositolovou kotvou
Bi7005 Buněčné regulace / 05
8
PROPOJENÍ KLASICKÝCH KADHERINŮ S CYTOSKELETEM
https://www.nature.com/articles/ncb3457
Propojovací komplex tvoří 3 vrstvy:
1. Signalling layer (SL)
• β- a p120-catenin
• Adaptérové molekuly nezbytné pro aktivaci
kadherinu
2. Force-transduction layer (FTL)
• α-catenin, vinculin
• Zvýšení tenze adheze vede k fosforylaci
vinculinu a změně jeho konformace
(rozbalení), aktivaci a přenosu specifických
aktinových regulátorů do vrstvy aktinového
kortexu (VASP, zyxin) a jeho přestavbě.
Výsledkem je zesílení adheze.
3. Actin regulatory layer (ARL)
• α-actinin, eplin, palladin a další...
• Vrstva aktinového kortexu s jeho regulatory
schopnými modulovat jeho mechanické
vlastnosti a tím regulovat pevnost a sílu
adheze. Bi7005 Buněčné regulace / 05
9
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Integriny a jejich regulace
10
INTEGRINY
 Heterodimery - alfa a beta podjednotky (kódované zvláštními geny)
 U člověka 24 typů (18 genů pro α-podj., 8 genů pro β-podj.)
 Heterofilní interakce, často více ligandů
 ECM: fibronectin, collagen, vitronectin, laminin
 Buňky: IgCAMs (ICAM1-5, VCAM)
 Př. VLA4 (integrin α4β1) – váže VCAM-1 a fibronectin
 Fokální adheze (propojené s aktinovým cyt.) – různé integriny
 Hemidesmosomy (propojené s AF) - integrin α6β4
 Integriny dokáží signalizovat dovnitř i ven z buňky
Bi7005 Buněčné regulace / 05
11
PROPOJENÍ INTEGRINŮ S AKT. CYTOSKELETEM
 Propojovací komplex tvoří podobné funkční oblasti
jako u kadherinů a využívá totožné distální proteiny,
významě se od nich však liší v proximální (signální)
části komplexu
 Kinázy FAK (focal adhesion kinase) a Src – integrinová
signalizace
 Klíčovým propojovacím proteinem je zde talin
Bi7005 Buněčné regulace / 05
12
INTEGRINOVÁ SIGNALIZACE
https://doi.org/10.1016/j.ccell.2019.01.007
https://www.nature.com/articles/s41580-019-0134-2
• Integriny regulují buněčnou
morfologii a migraci
• Mají onkogenní potenciál!
• Fokální adheze: místa
clusterování a aktivace
integrinů; klíčová role FAK
(focal adhesion kinase) a
kináz z rodiny Src (SFK – Src
family kinases)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
13
ADHERENS JUNCTIONS JAKO REZERVOÁRY SIGNÁLNÍCH MOLEKUL?
 Příklad β-katenin
 2 rezervoáry v epiteliálních buňkách: v AJs
(kadherinový linker) a cytoplasmatické (Wnt
signalizace)
 Funkce kadherinové vazby je evolučně starší
 oba rezervoáry nelze snadno rozlišit, dosud
nebyla identifikována žádná posttranslační
modifikace, která by je identifikovala
 V průběhu evoluce nedošlo k oddělení obou
funkcí duplikací genů, jak bylo pozorováno v
jiných případech
 Experimentální důkazy o propojení obou poolů
Bi7005 Buněčné regulace / 05
14
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Molekuly přechodných
adhezí a ERM komplex
15
MOLEKULY PŘECHODNÝCH ADHEZÍ
 Immunoglobulinové adhezní molekuly
 Obsahují imunoglobulinové domény, homofilní i
heterofilní interakce
 Některé slouží jako ligandy integrinů.
 Př. ICAMs (intercellular adhesion molecules),
VCAM (vascular), NCAM (neural), PECAM
(platelet endothelial)
 Selektiny
 Váží sacharidové skupiny na površích jiných buněk
 Konzervovaná extracelulární lektinová doména
(selektiny), ovšem velmi rozdílné intracelulárně
 Především na krevních buňkách a endotelu –
např. důležité při rolování lymfocytů po povrchu
kapiláry
 L (leukocyte), E-(epithelial), P-selektin (platelet)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
16
RODINA PROTEINŮ EZRIN-MOESIN-RADIXIN (ERM)
 Propojuje s aktinovým cytoskeletem celou řadu
membránových molekul, včetně většiny IgCAMs,
L-selektinu aj. (CD44, EGFR, CRB)…
 Mají podobnou strukturu:
 N-terminální FERM doména - váže cílovou
molekulu/EBP50 a PI(4,5)P2
 Centrální helikální doména
 C-terminální doména (C-ERMAD) – váže aktin
 Fosforylace uvolňuje interakci mezi FERM a CERMAD,
čímž aktivuje ERM protein a umožňuje
jeho vazebnou aktivitu a interakci s b. membránou
 Mezi aktivující kinázy ERM protein patří např. různé
PKC (Ca2+ signalizace), ROCK (RhoA efektor)
 ERM proteiny linkují membránové molekuly přímo
anebo přes EBP-50
PI(4,5)P2 PI(4,5)P2
Bi7005 Buněčné regulace / 05
17
ARCHITEKTURA AKTOMYOSINOVÉHO CYTOSKELETU URČUJE POZICI CENTROZOMU
VŮČI GEOMETRICKÉMU STŘEDU BUŇKY
Pozice adhezí tedy určuje pozici centrozomu a s ním spojených organel (Golgiho aparát).
Bi7005 Buněčné regulace / 05
18
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Epiteliální polarita
19
OSY POLARIZACE V EPITELU
 Apikálně bazální – takřka u všech epitelů
 Planární – pokud je potřeba funkčně
specifikovat směr i v rovině epitelu.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
20
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Apikobazální (AB) polarita
21
ERM-vázající CAMs
cadheriny
EPITELIÁLNÍ BUNĚČNÁ POLARITA
 Navzdory funkční propojenosti musí být
zachována funkční polarita epiteliálních
buněk:
 Specifické molekuly musí být orientovány
do lumen, zatímco jiné na rozhraní buněk
a ECM, jinak epitel nemůže plnit své
funkce.
 Polaritu buněk můžeme vidět
 Na existenci specializovaných struktur
(např. microvilli, cilie)
 Orientaci vnitřních struktur (např. osa
nucleus - Golgiho aparát/centrozom)
 Orientaci cytoskeletu (apikobázální
orientace mikrotubulů, apikální konstrikce
u epitelů vytvářející tubuly)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
22
MOLEKULÁRNÍ ZÁKLAD APIKOBAZÁLNÍ POLARITY
 Signální dráha apikálně bazální (Par) polarity
 Evolučně konzervovaná síť proteinů řídící
buněčnou polaritu (nejen) epitelů.
 V epitelech je jejím hlavním úkolem odlišit od
sebe apikální a bazální stranu buňky a vytvořit
maturované mezibuněčné spoje (TJ a AJ).
 Signalizaci lze rozdělit do 3 funkčních domén:
 Apikální – CRB, Pals, Patj
 Jádro Par signalizace – koordinace a vymezení
apikální a bazolaterální domény
 Par3 – lokalizuje do apikolaterálního adhezního
komplexu (TJ, AJ)
 CDC42, aPKC, Par6 – apikální
 Par1, Par5 - bazolaterální
 Bazolaterální – Dlg (Discs large), Lgl (Lethal Giant
Larvae), Scrib (Scribble) Bi7005 Buněčné regulace / 05
23
Apikální
doména
Jádro PAR
signalizace
Bazolaterální
doména
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Není nutno do detailu znát
24
APIKOLATERÁLNÍ ADHEZNÍ KOMPLEX
 PAR3 (partitioning-defective 3)
 Potenciálně klíčová komponenta celé signalizace, unikátní schopnost oligomerizovat
(→ phase separation).
 Součást PAR komplexu – s PAR6 a atypickou protein kinázou C (aPKC)
 PAR komplex je esenciální funkční organizátor A-P polarity
Bi7005 Buněčné regulace / 05
25
Význam C. elegans pro objev principů A-P polarity
• A-P polarity využívá stejné mechanismy jako první asymetrické
dělení u zygoty C. elegans. Odtud terminologie PAR = partitioning-
defective.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
26
ROLE PAR SIGNALIZACE V POLARIZACI
 Par signalizace neobsahuje komponentu s charakterem receptoru pro
vnější signál. V naprosté většině buněčných kontextů tak vnější signál
rozhodující o směru polarizace může být různého charakteru:
 Preexistující bias
 Ustavené spoje s ECM nebo jinými buňkami
 Architektura cytoskeletu (např. pozice centrozomu a asociovaných organel)
 Lokalizace specifických receptorů na povrchu buňky
 Nový poziční signál
 Adhezní signalizace (integriny, selektiny…)
 Jakákoli jiná mezibuněčná signalizace (EGF, Wnt…)
 Mechanický stimulus (např. stlačení)
 Gradientové stimuly (chemotaxe, koncentrace živin)
 Par systém tedy nejspíše nemá lineární charakter jako jiné signalizace,
pouze amplifikuje jiné poziční signály, a realizuje vznik funkční polarity
pomocí antagonistických interakcí svých komponent.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
27
ADHEZNÍ SPOJE JSOU Z HLEDISKA AKTINU NEJDYNAMIČTĚJŠÍ ČÁSTÍ EPITELU
• Místa mechanického propojování epiteliálních buněk
vyžadují častou přestavbu, aby přizpůsobily mechanické
vlastnosti novým podmínkám. K tomu je potřeba
různých aktinových regulatorů, typicky malých GTPáz.
• Běžné důvody pro přestavbu můžou být:
• Buněčné dělení
• Růst
• Apoptóza
• Mechanický stres
• Transmigrace leukocytů
Skryté (“kryptické”) protruze v místech adhezních
spojů, které vznikají jako vedlejší produkt aktivity
aktinových regulátorů (Rac, Rho, Cdc42).
Bi7005 Buněčné regulace / 05
28
BAZOLATERÁLNÍ DOMÉNA
 SCRIB (Scribble), DLG (Discs large), LGL (Lethal
giant larvae)
 Nejméně známá část polaritní signalizace.
 U Drosophily řídí vznik septate junctions, u
obratlovců velká míra redundance.
 Při KO SCRIB a jeho paralogů (Erbin, Lano)
dochází ke kompletní disrupci AB polarity u
buněk kol. karcinomu.
 Interakce s proteiny planární polarity (viz dále)
a mezibuněčnými spoji (beta-katenin)
Bi7005 Buněčné regulace / 05
29
Bi7005 Buněčné regulace / 05
Planární buněčná polarita (PCP)
30
PLANÁRNÍ BUNĚČNÁ POLARITA V KŘÍDLOVÉM EPITELU DROSOPHILY
• Drosophila jakožto model mozaikovitého vývoje, obsahuje
celou řadu buněčných fenotypů, které vyžadují velice
přesnou poziční specifikaci.
• Každá z buněk epitelu křídel obsahuje po jednom
aktinovém chloupku, jehož pozice je přísně koordinována
s okolními buňkami.
• Planární polarizaci řídí 2 specializované polarizační
signální dráhy.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
31
HLAVNÍ PLANÁRNĚ POLARIZAČNÍ SIGNÁLNÍ DRÁHY U DROSOPHILY
 Fat/Dachsous
 Frizzled/PCP core
 Obě řídí polaritu z adherens junctions.
 Obě obsahují kadherinovou komponentu.
 Obě se podílí na stejných procesech, jejich vzájemný vztah však není dosud plně objasněn.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
32
FRIZZLED/PCP JÁDRO
 Cadherinovou komponentou je atypický kadherin Flamingo (Fmi, u obrat.
CELSR), který lokalizuje na oba póly buněk a kotví polarizační komplexy:
 Distální – podobný receptorovému komplexu Wnt signalizace
 Frizzled (Fzd) – transmembránový GPCR
 Dishevelled (Dvl) a Diego (Dgo) - intracelulární
 Proximální:
 Strabismus (Stbm, u obratlovců VANGL) – transmembránový
protein nejasné aktivity
 Prickle (Pk) – intracelulární
 + další efektory zodpovědné za polarizovanou tvorbu
aktinového chloupku
 Charakter signálu orientujícího polarizaci v tomto modelu je v
současnosti debatován.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
33
DALŠÍ ROLE PLANÁRNÍ POLARITY:
 Orientace mikrotubulového cytoskeletu:
Bi7005 Buněčné regulace / 05
34
KONZERVOVANOST FZD/PCP CORE NAPŘÍČ ŽIVOČIŠNÝMI MODELY
Bi7005 Buněčné regulace / 05
35
HIERARCHIE EPITELIÁLNÍ POLARITY A BUNĚČNÝ KOMPAS
1. Iniciální signál ustavující apikálně bazální osu → CDC42
2. Stabilizace a vytvoření funkční apikobazální polarity – Par systém
3. Do vytvořených adhezních spojů se lokalizuje Flamingo/CELSR
4. Polarizace PCP na základě vnějšího signálu
Apikobazální a planární polarita představují dvě na sebe kolmé osy, podle kterých je možné v buňce
orientovat cytoskelet. Lokální aktivací aktinových regulátorů (obvykle z oblasti adhezních spojů) je možné za
pomocí aktomyosinové kontraktility a orientace mikrotubulů organizovat ve 3D vnitřní architekturu buňky.
Bi7005 Buněčné regulace / 05
36
SHRNUTÍ 1
 Různé adhezní molekuly tvoří specifické domény na povrchu epitelu, avšak jsou funkčně
propojené pomocí aktinového kortexu.
 Apikobazální polarita epitelů je řízena evolučně konzervovaným systémem PAR proteinů.
 PAR signalizace nejspíše nemá lineární charakter, pouze zesiluje předem existující
poziční informaci.
 Apikolaterální adhezní komplex (AJ + TJ) je důležitým organizačním centrem polarity
epitelů, je dynamický a může sloužit jako iniciační místo protruzivní aktivity.
 Apikobazální a planární polarita vytváří 2 osy, podle kterých je vystavěna architektura
aktomyosinového cytoskeletu v epitelech. Ten určuje vnitřní organizaci buňky.
Bi7005 Buněčné regulace / 05