10 Regulace buněčné migrace prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D. Ústav experimentální biologie PřF MU Bi7005 Buněčné regulace / 10 Bi7005 Buněčné regulace / 10 2 BUNĚČNÝ POHYB – B-LYMFOCYT Bi7005 Buněčné regulace / 10 3 Základní typy buněčné migrace Bi7005 Buněčné regulace / 10 4 MIGRAČNÍ MÓDY  Améboidní vs. mezenchymální  Hlavní rozdíly:  Míra a význam adheze k povrchu (nižší u améboidní)  Využití aktomyosinové kontraktility (vyšší u améboidní)  Pozice MTOC (u améboidních většinou za jádrem, u mezenchymálních naopak, není ale 100%)  Rychlost:  Mezenchymální: maximálně jednotky µm/min  Améboidní: až okolo 15 µm/min  Typičtí zástupci:  Mezenchymální: fibroblasty, epiteliální buňky prošlé EMT včetně řady nádorových linií  Améboidní: imunitní buňky (s výjimkou makrofágů), améby (např. Dictyostelium) Bi7005 Buněčné regulace / 05 Bi7005 Buněčné regulace / 10 5 DVA EXTRÉMNÍ MÓDY MIGRACE SHRNUTÍ: AMÉBOIDNÍ VS. MEZENCHYMÁLNÍ Bi7005 Buněčné regulace / 05 Bi7005 Buněčné regulace / 10 6 Bi7005 Buněčné regulace / 10 7 KOMPLIKACE KLASIFIKACE BUNĚČNÉ MIGRACE  Problematika klasifikace migrace:  Dělení je umělé, ve skutečnosti existuje plynulý přechod od jednoho módu k druhému.  Stejné buňky se mohou chovat jinak v závislosti na vnějších podmínkách  “Lepivost” substrátu, dimenzionalita (3D/2D/1D)  Různé buňky obsahují jiný “mix” cytoskeletárních regulátorů, což vede pokaždé k trochu jinému migračnímu fenotypu. Bi7005 Buněčné regulace / 10 8 Adhesion Protrusion Contraction Bi7005 Buněčné regulace / 10 9 Význam malých GTPáz v regulaci dynamiky cytoskeletu Bi7005 Buněčné regulace / 10 10 POHYB BUŇKY PO SUBSTRÁTU Klidová buňka Filopodia Stresová vláknaLamelipodia fimbrin Arp2/3 filamin non-muscle Myosin II α-actinin Bi7005 Buněčné regulace / 10 11 MALÉ GTPÁZY Z RHO RODINY JSOU KLÍČOVÉ REGULÁTORY CYTOSKELETU Bi7005 Buněčné regulace / 10 12 MALÉ GTPÁZY Z RHO RODINY JSOU KLÍČOVÉ REGULÁTORY CYTOSKELETU Bi7005 Buněčné regulace / 10 13 MALÉ GTPÁZY Z RHO RODINY JSOU KLÍČOVÉ REGULÁTORY CYTOSKELETU Bi7005 Buněčné regulace / 10 14 MALÉ GTPÁZY Z RHO RODINY JSOU KLÍČOVÉ REGULÁTORY CYTOSKELETU Bi7005 Buněčné regulace / 10 15 Mezenchymální migrace Bi7005 Buněčné regulace / 10 16 POHYB BUŇKY PO SUBSTRÁTU Bi7005 Buněčné regulace / 10 17 POHYB BUŇKY PO SUBSTRÁTU – MODEL KERATOCYTŮ (V KŮŽI RYB A OBOJŽIVELNÍKŮ) Bi7005 Buněčné regulace / 10 18 Migrovat mohou i buněčné fragmenty Bi7005 Buněčné regulace / 10 19 ILUSTRAČNÍ PŘÍKLAD - MINIROBOTI  https://www.science.org/doi/full/10.1126/scirobotics.abd0272 Bi7005 Buněčné regulace / 10 20 AKTINOVÁ SÍŤ V LAMELIPODIU – KLÍČOVÁ ROLE ARP2/3 Arp2/3 actin Bi7005 Buněčné regulace / 10 21 AKTINOVÁ SÍŤ V LAMELIPODIU – KLÍČOVÁ ROLE ARP2/3 Bi7005 Buněčné regulace / 10 22 POHYB BUŇKY PO SUBSTRÁTU – KLÍČOVÁ ROLE INTEGRINŮ Bi7005 Buněčné regulace / 10 23 POHYB BUŇKY PO SUBSTRÁTU – KLÍČOVÁ ROLE INTEGRINŮ Bi7005 Buněčné regulace / 10 24 Amoeboidní migrace Bi7005 Buněčné regulace / 10 25 Bi7005 Buněčné regulace / 10 26 KONZERVOVANOST AMÉBOIDNÍ MIGRACE NAPŘÍČ HISTORIÍ EUKARYOT  Améboidní migrace – název napovídá, že je pojmenována po způsobu pohybu jednobuněčných améb  Podobnost pohybu leukocytů a améb není náhodná, jde o evolučně konzervovaný mechanismus, řízený témeř totožnými proteiny.  I u takových jednobuněčných organismů, u nichž se donedávna schopnost améboidně migrovat nepředpokládala, se často dá indukovat. Bi7005 Buněčné regulace / 10 27 INDUKCE AMÉBOIDNÍHO FENOTYPU U TRUBÉNKY (CHOANOFLAGELLATA)  Mechanickým stlačením lze u trubénky vyvolat reverzibilní améboidní transformaci. Po ní může trubénka uniknout ze stlačeného prostoru. Bi7005 Buněčné regulace / 10 28 PROČ JE U AMÉBOIDNÍCH BUNĚK MTOC VZADU?  Améboidní migrace je evolučně určena pro prostorově omezená prostředí.  Leukocyty používají své plastické jádro jako mechanický sensor toho, jestli se daným prostorem protáhnou. Jádro je tedy vpředu buňky, aby s ním mohlo být manipulováno. Bi7005 Buněčné regulace / 10 29 BLEBBING  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC9337749/ Charakteristika blebbingu: • Tvorba blebů/výdutí: Buněčný blebbing zahrnuje vytváření výčnělků nebo výduťí na buněčné membráně. • Odpojení membrány od cytoskeletu: Bleby vznikají díky lokalizovanému odloučení buněčné membrány od podkladového cytoskeletu. • Změny aktinového cytoskeletu/buněčného kortexu: Změny v aktinovém cytoskeletu, což je síť proteinových vláken poskytujících buněce strukturální podporu, jsou často spojeny s procesem blebbingu. • Dynamika a reverzibilita: Blebbing je dynamický a reverzibilní proces, který může nastat v reakci na různé podněty, jako jsou mechanický stres, změny osmotického tlaku nebo expozice určitým látkám. Bi7005 Buněčné regulace / 10 30 Navigace buněčné migrace alias určení směru Bi7005 Buněčné regulace / 10 31 INICIACE BUNĚČNÉ MIGRACE  Migrace buněk je určena 3 aspekty:  Směrové vnímání (schopnost vnímat směrované signalizace – př. gradient chemokinu)  Buněčná polarita (schopnost morfologické a funkční polarizace: leading edge vs. trailing edge)  Motilita (samotná schopnost pohnout se z místa) Bi7005 Buněčné regulace / 10 32 INICIACE BUNĚČNÉ MIGRACE  Směrové vnímání - Directional sensing  Nejlépe prostudován na hlence (Dictyostelium discoideum)  Jednoduchá kultivace, genové manipulace.  Robustní chemotaxe vůči cAMP. Bi7005 Buněčné regulace / 10 33 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA Bi7005 Buněčné regulace / 10 34 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA 1a. cAMP je zachyceno jedním ze specifických GPCR, následuje celá řada downstreamových mechanismů, které svou integrací vytváří migrační fenotyp (obdoba chemotaxe u leukocytů – zde také specifické chemokinové GPCRs). Bi7005 Buněčné regulace / 10 35 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA 1b. Buňky však nemusí být indukovány striktně jen specifickými chemokiny. Symetrii mohou porušit i fyzikální faktory, v některých případech stačí i sebemenší vzruch k polarizaci buňky (stochastic noise) – v takovém případě se buňky pohybují náhodně bez potřeby vnějšího směrování (kineze vs. taxe). Bi7005 Buněčné regulace / 10 36 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA 2. Následuje aktivace druhých poslů, velmi důležitá je role malých GTPáz z rodiny Ras. Řada z nich je polarizována i v leukocytech (např. Rap1) Bi7005 Buněčné regulace / 10 37 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA 3. Centrální roli v iniciaci migrační polarity má PI3K signalizace. PI3K se uplatňuje v tzv. modelu lokální excitace – globální inhibice. Bi7005 Buněčné regulace / 10 38 POLARITA FOSFOINOSITOLŮ U DICTYOSTELIUM  PI3K signalizace  Lokálně aktivovaná PI3K fosforyluje na buněčné membráně fosfatidylinositoldifosfát (PIP2) na trifosfát (PIP3)  PIP3 se na vnitřní straně b. membrány akumuluje a umožňuje navázání dalších specifických proteinů do této části membrány → polarizace  Některé proteiny obsahují domény, které specificky rozeznávají určitý PIP. Např. plekstrin-homology (PH) domény aj.  Aby PIP3 nepokryl celý povrch buňky, je potřeba tzv. globální inhibitor. Tím je fosfatáza PTEN, která je bazálně přítomná v buňce a konvertuje PIP3 zpět na PIP2.  Kombinací lokální aktivity PI3K a globální inhibice PTEN vzniká zárodek buněčné polarity.  Deaktivací PTEN vzniká více konkurenčních protruzí, což zamezuje migraci.  U vyšších živočichů to funguje pricipiálně podobně, avšak tvorba membránových domén podléhá komplexnější regulaci (např. deaktivace samotného PTEN nestačí k disrupci polarity). + Latrunculin A PH-Akt PTEN Bi7005 Buněčné regulace / 10 39 NEZÁVISLOST PIP POLARITY NA AKTINOVÉM CYTOSKELETU Lokální stimulací signalizace v buňkách ošetřených latrunculinem, lze pozorovat směrovanou polarizaci jednotlivých polarizačních komponent, která je nezávislá na aktinovém kortexu (předchází jeho funkční přestavbě). Protein CynA (váže specificky PIP2) Protein CRAC (váže specificky PIP3 pomocí PH domény) Bi7005 Buněčné regulace / 10 40 PŘEHLED SIGNÁLNÍCH DRAH ŘÍDÍCÍCH INICIÁLNÍ PROCESY V CHEMOTAXI DICTYOSTELIA 4. Fosfatidylinositolová polarita umožňuje lokalizaci dalších signálních molekul na membránu pomocí specifických domén. Např. PKB (Akt), GEFů a GAPů. 5. Polarizovaná aktivita GEFů a GAPů umožňuje polarizivanou aktivitu malých GTPáz z rodiny Rho: RhoA, Rac1 a Cdc42 – klíčových regulátorů veškerých polaritních a migračních procesů. Bi7005 Buněčné regulace / 10 41 STEJNÉ SIGNALIZACE/RŮZNÉ PROTRUZE  Pokud jsou téměř totožné signalizace zapojené v migraci buněk napříč eukaryoty, jak je možné, že vidíme takovou diverzitu v morfologii a dynamice buněčných protruzí?  Je to právě komplexitou zpětných vazeb mezi signálními drahami a cytoskeletem. Signální dráhy jako PI3K a aktinový cytoskelet představují tzv. excitabilní sítě.  Signál se buňkou šíří jako vlna, různé receptory však nemusí vytvořit stejně silný impulz. Stejně tak nemusí být počáteční nastavení buňky stejně permisivní (vlna rychleji zaniká). Profil vlny může být rovněž různý. Bi7005 Buněčné regulace / 10 42 Migrace imunitních buněk Bi7005 Buněčné regulace / 10 43 JAK BUŇKA URČÍ SMĚR? Bi7005 Buněčné regulace / 10 44 Bi7005 Buněčné regulace / 10 45 MODEL: LYMFOIDNÍ BUŇKY  T-lymfocyty, B-lymfocyty a NK buňky (plus jejich prekurzory)  Co mají lymfoidní buňky společného?  Migrační fenotyp  Schopnost vytvářet specifickou interakci (synapsi) s cílovou buňkou, zahrnující endo/exocytózu cílových molekul. Bi7005 Buněčné regulace / 10 46 MIGRAČNÍ FENOTYP LYMFOIDNÍCH BUNĚK  Leading edge  Chemokinové receptory  Podjednotky integrinu LFA1  Buněčné jádro zabírá většinu cytoplazmy buňky a je stejně jako u DC používáno k mechanickému prohledávání cesty.  Uropod (trailing edge)  IgCAMs – ICAM1, VCAM-1  CD44, CD43  Centrosom je orientován dozadu, spolu s ním i Golgiho aparát a endocytární aktivita propojeno s aktinovým cytoskeletem pomocí ERM proteinů Bi7005 Buněčné regulace / 10 47 UROPOD  Striktně jedině u leukocytů  CD44 and ERM proteiny jsou markery  ICAM1-3 lokalizované molekuly  Microvilli, mezibuněčné kontakty  Neadherentní, NEJEDNÁ se o oblast integrinové de-adheze  Neznámé funkční mechanismy – migrace?, signalizace?, endo/exocytóza?, funkce související s cilii?  Vysoký obsah RhoA, ale žádná aktomyozinová vlákna (endocytóza?) https://www.nature.com/articles/ncomms6213 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/tra.12618 Bi7005 Buněčné regulace / 10 48 IMUNOLOGICKÁ SYNAPSE A REPOLARIZACE LYMFOIDNÍCH BUNĚK  Imunologická synapse, také nazývaná imunosynapse, je speciální druh kontaktního místa, které vzniká během imunitní reakce, zejména při interakci mezi T-lymfocyty (T-buňky) a antigen-prezentujícími buňkami (APC), jako jsou dendritické buňky nebo makrofágy.  Tato struktura je klíčovým prvkem komunikace mezi různými buňkami imunitního systému a je důležitá pro účinnou imunitní odpověď. Bi7005 Buněčné regulace / 10 49 IMUNOLOGICKÁ SYNAPSE A REPOLARIZACE LYMFOIDNÍCH BUNĚK  PI3K, tvorba kontraktilního aktinového prstence  Repolarizace endocytického aparátu  Fokusace MTOC do místa extrakce antigenu nebo sekrece killer molekul  Změna pozice organel (Golgi, jádro) Bi7005 Buněčné regulace / 10 50 IMUNOLOGICKÁ SYNAPSE A REPOLARIZACE LYMFOIDNÍCH BUNĚK  PI3K, tvorba kontraktilního aktinového prstence  Repolarizace endocytického aparátu  Fokusace MTOC do místa extrakce antigenu nebo sekrece killer molekul  Časová osa polarizace B-lymfocytů (Ana-Marie Lennon, 2022)  Ca2+ signalizace řídí repolarizaci a adhezi buněk  Štěpení L-selektinu → zastavení rolování a integrinová adheze (Rap)  Molekuly SMACs (cSMAC, pSMAC, dSMAC) – a srovnání jejich pozice s uropodem?