Vítězslav Bryja Buněčné regulace III: Reakce na změny chemických a fyzikálních parametrů prostředí Reakce tkání na změny v dostupnosti kyslíku a regulace angiogeneze • A) Detekce nedostatku kyslíku - Hypoxia inducible factor (HIF) • B) iniciace angiogeneze - vaskulární endotheliální růstový faktor VEGF/VEGFR • C) buněčné mechanismy angiogeneze (role Notch a angiopoetinové signalizace) Hypoxie a HIF • Hypoxie: snížený parciální tlak O2 ve tkáni x normoxie Hypoxie a HIF • O2 se difuzí šíří asi na 150 µm • HIF – Hypoxia-Inducible Factor: – Heterodimerický transkripční faktor aktivující geny obsahující v promotorové sekvenci HRE (Hypoxia response element) – Prozatím je známo 60 -100) genů regulovaných HIF, řada z nich reguluje odpověď na hypoxii (angiogeneze, proliferace, metabolismus glukózy, migrace, apoptóza, erytropoeza, metabolismus Fe) – Heterodimer sestává ze tří α podjednotek (HIF1α, 2α, 3α) a jedné podjednotky β (HIFβ=ARNT) – α podjednotky jsou při normoxii silně labilní, podjednoteka β je na koncentraci O2 nazávislá HIF při normoxii a hypoxii – význam hydroxylace prolinu http://www.chem.ox.ac.uk/oc/cjschofield/images/new-2.png VHL (von Hippel-Lindau) - tumor supresorový gen Modelové změny spojené s hypoxií/HIF systémem • embryonální vývoj • angiogenese • růst chrupavek • krvetvorba – aktivace EPO genu Hypoxie je přítomna/reguluje niku kmenových buněk Angiogenese • Angiogenese – tvorba nových krevních cév • HIF se váže do oblasti promotoru a iniciuje transkripci receptoru VEGFR 2 i expresi VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor) – hlavní faktor angiogenese • v normálním vývoji ale i během nádorového růstu Vascular endothelial growth factors (VEGF) a jejich receptory (VEGFR) VEGFR2 Obr. 5 VEGF/VEGFR ve vývoji • reguluje vznik a vývoj cévní soustavy • master regulátor angiogeneze (vývoje cév) • hypoxie (=nedostatek kyslíku) indukuje HIF (hypoxia-induced factor), který reguluje produkci VEGF. • VEGF je schopen regulovat vznik de novo cév v hypoxické části embrya • - podobný mechanismus se uplatňuje i při onkogenezi, kde VEGF podporuje prokrvení nádorů a tím podporuje jejich růst Shrnutí VEGF je signální protein (ligand) schopný indukovat genovou expresi Primárním cílem VEGF jsou vaskulární ECs VEGF přispívá k zachování stávajících cév a indukuje vznik a růst cév nových Významná role VEGF v embryonálním vývoji i v nádorové transformaci Angioterapie využití léků k regulaci angiogeneze proangiogeneze u ischemických chorob srdečních Obr. 6 Angioterapie patologická angiogeneze: rakovina diabetická retinopatie Bevacizumab (Avastin) The second option is direct VEGF blocking. Nowadays, this line already has a grounded position in medicine. Drugs acting in this way are: • Bevacizumab (Avastin, Genentech, San Francisco, CA, USA), a full-length humanised recombinant monoclonal IgG anti-VEGF-A antibody. It binds and inhibits all VEGF-A isoforms [11, 23, 24]. Its molecular weight is 148 kDa, so it is a large molecule with twice the half-life of ranibizumab [12, 13]. It has been approved for the treatment of several solid tumours (colorectal, non-epithelial lung, breast, ovarian, and renal cancers) and glioblastomas [3, 24–26]. In ophthalmology it is used as an off-label procedure [11, 12, 27, 28]. Furthermore, it is probably still the most widely used anti-VEGF drug in ophthalmology due to much lower costs of therapy, compared with other medicines [12, 24, 29]. • Ranibizumab (Lucentis, Genentech, San Francisco, CA, USA/Novartis Ophthalmics, Basel, Switzerland) is a (Fab) fragment of a humanised monoclonal anti VEGF-A antibody, also against all VEGF-A isoforms [10, 13, 23]. Its molecular weight is 48 kDa [24]. This drug was designed for eye diseases, and it was approved for intra-ocular use in neovascular AMD, macular oedema (ME) after retinal vein occlusions (RVO), diabetic macular oedema (DME), and diabetic retinopathy (DR) with DME [30]. In any other ocular diseases it is also used off label. • Pegaptanib (Macugen, Phizer, New York), a 28-base ribonucleic acid aptamer, covalently linked to two branched 20-kd polyethylene glycol moieties [10, 23]. It specifically binds and blocks activity of extracellular VEGF-A165 isoform [11, 23]. It was used in wet AMD treatment, but it was found to be weaker than the drugs listed above. This is probably due to its specificity for binding only one isoform of VEGF [16]. • Aflibercept (Eylea, Regeneron, Tarrytown, NY, USA), a VEGF-trap: a 115-kDa recombinant fusion decoy protein consisting of VEGF binding domains of human VEGFR-1 and VEGFR-2 fused to the Fc domain of human immunoglobulin G1 [23]. It binds all forms of VEGF-A but also PlGF-1 and PlGF-2 with a very high affinity, greater than bevacizumab or ranibizumab [10, 11, 16]. It was approved for colorectal metastasising carcinoma treatment (Zaltrap). In ophthalmology it has already been approved as a therapy for neovascular AMD, macular oedema after RVO, and diabetic macular oedema [31]. Rakovina a angioterapie Rakovina a angioterapie Diabetická retinopatie Diabetic retinopathy, also known as diabetic eye disease, is a medical condition in which damage occurs to the retina due to diabetes mellitus. It is a leading cause of blindness. Diabetic retinopathy affects up to 80 percent of those who have had diabetes for 20 years or more. he damage to the blood vessels triggers the growth of abnormal new blood vessels in the retina. These new blood vessels are fragile and can bleed into the vitreous gel inside the eye, causing vision problems. Depends on VEGF signaling Angiogeneze vs. vaskulogeneze vaskulogeneze = vznik a vývoj cév při embryonálním vývoji (de novo) angiogeneze (neokapilarizace) = z cév již existujících Angiogeneze v embryogenezi iniciovaná: poranění tkáně menstruační cyklus hypoxická tkáň sprouting x intususceptive (spliting) Anatomie cévy Základní kroky angiogeneze po poranění (sprouting angiogeneze) 1. Dilatace cév (eNOS) 2. Kontrakce endotelu 3. „Tip-cell“ selekce (Notch signalizace) 4. Ustavení „stalk cell“ a jejich proliferace 5. Vakuolizace (vytvoření lumenu) 6. Spojení „výhonků“ (anastomóza) 7. Pericytární stabilizace Sprouting (klíčení) cév Obr. 2 Cell analysis in sprouting angiogenesis models. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583 © 2011. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583 © 2011. Sprout induction. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583© 2011. Models of lumen formation during sprout outgrowth. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583 © 2011. Vessel stabilisation. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583 © 2011. Angiopoetin-Tie RTK systém Current concepts of anastomosis. Ilse Geudens, and Holger Gerhardt Development 2011;138:4569-4583 © 2011. Spliting 1. protruze dovnitř lumenu 2. rozdělení kapilár 3. „vpáčení“ fibroblastu Obr. 3 Mechanické vlivy a jejich detekce Koncept: kontaktní inhibice proliferace (contact inhibition of proliferation – CIP): Hustota buněk vysoká – dělení je silně inhibováno Hustota buněk nízká (ale i při natažení tkáně) – buněčné dělení je umožněno Prerekvizita pro CIP: existence mechanismu, který umožní vnímat tenzi v tkáni a přenášet ji do „rozhodnutí buněk“ zdase dělit nebo ne Buňky fungují v tkáních 1. Hippo (Drosophila) = Yap/Taz (obratlovci) Hippo nebo též Yap/Taz signální dráha jako senzor 2. Citlivost iontových kanálů k mechanickým vlivům Iontový kanál Piezo1 Otvírá se při zvýšeném namáhání membrány Role Piezo1 v regulaci „density“ epitelu