1 Molekulární pato(fyzio)logie Osnova • I. část: – definice a vymezení oborů patologie a patofyziologie – genetická podmíněnost nemocí – vztah genotyp (mutací resp. polymorfizmus) a fenotyp z hlediska nemocí • jejich diagnostiky • prognózy a predikce • II. část – příklady: – (A) diagnostický a terapeutický přínos molekulární patologie • diabetes mellitus typu 1 • MODY • T2DM – (B) prognostický a prediktivní význam molekulární patologie („precision medicine“) • diabetické komplikace ETIOPATOGENEZE NEMOCÍ Z HLEDISKA PATO(FYZIO)LOGIE Patofyziologie (PF) jako lékařský obor • lékařská disciplína (obor) zabývající se studiem nemocí, konkrétně jejich etiologií a patogenezí a rovněž tím jak se nemoc rozvíjí v čase a jaké adaptace a kompenzace vyžaduje od ostatních orgánových systémů – fyziologie = jako funguje zdravé tělo – patofyziologie = jako (ne)funguje nemocné tělo • PF je “fyziologií narušeného zdraví” • PF vysvětluje funkční konsekvence chorobného procesu –otázky proč? a jak? • PF studuje zejména dva procesy – etiologie nemoci = příčina nemoci, tj. co (jaké faktory) způsobuje nemoc, proč se začne rozvíjet – patogenezi nemoci = rozvoj nemoci, tj. jakým způsobem se nemoc rozvíjí • příbuzné disciplíny – patologie (patologická anatomie) = popisuje anatomické změny, které nemoc způsobuje – epidemiologie = studuje choroby na úrovni populace Patofyziologie vs. patologie • jsou to příbuzné disciplíny – patologie (patologická anatomie) = popisuje anatomické (tj. makroskopické) a histologické (tj. mikroskopické) změny, které nemoc způsobuje – patofyziologie vysvětluje funkční změny na všech úrovních a jejich časový rozvoj – oba obory se zabývají etiopatogenezí nemocí = soubor morfologických a funkčních změn, které nelze striktně oddělit (pat. anatomie vs. patofyziologie) • v klasickém medicínské a zdravotnickém pojetí je patologie diagnostický obor zabývající se diagnostikou nemocí a příčin úmrtí na makro- a mikroskopické úrovni – na úrovni organismu, orgánů, tkání a buněk • obě disciplíny úzce souvisí s dalšími obory – molekulární biologie – metodologie výzkumu a rovněž rutinní diagnostiky – epidemiologie = studuje choroby na úrovni populace – imunologie – aktivace imunitního systému je téměř vždy součástí chorobného procesu – genetika – jen velmi malé část nemocí nemá vůbec žádný podíl dědičnosti či dispozice Metody klasické a molekulární pato(fyzio)logie • klasické – pitva – inspekce – nekropsie (post mortem) – biopsie (in vivo) • klasické barvení vs. (imuno)histochemie • mikroskopie – světelná – elektronová – fluorescenční • molekulární = objasnění proč a jakým mechanismem vede změna sekvence DNA, RNA či proteinu ke konkrétním patologickým projevům – změna většinou získaná, v somatických bb. nebo vrozené u tzv. komplexních nemocí • diagnostika na molekulární úrovni – nukleové kyseliny – proteiny • cytogenetika, FISH • PCR + RFLP, heteroduplexy, SSCP, DGGE, sekvenování • microarrays • hybridizace • RNA/real time PCR • klonovani, transfekce, mutageneze • izolace, separace proteinů, blotting, …… • detekce apoptózy - DNA fragmentation TUNEL, …… GENETICKÁ PODMÍNĚNOST VZNIKU A ROZVOJI NEMOCÍ Etiologie nemocí – podíl genetiky • endogenní = vnitřní faktory – vrozené (kongenitální) • genetické – hereditární (monogenní vs. polygenní dědičnost) » determinace vs. predispozce – ne-hereditární (např. aneuploidie) • malformace v důsledku prenatální expozice virům a toxinům • fetální programování – získané • v důsledku komorbidit (např. změny metabolické, imunitní, cirkulační apod.) • interindividuální variabilita • exogenní = zevní faktory – fyzikální • mechanické, termické, ionizující záření, elektrika, … – chemické • xenobiotika vč. léků (vedlejší a nežádoucí účinky) • toxiny a jedy • environmentální kontaminanty – potravní řetězec • kouření a znečištění ovzduší • nadbytečný nebo nedostatečný nutriční příjem – biologické • infekce (bakterie, viry, kvasinky, parasité, …) • toxiny • priony – psychologické a sociální • mentální trauma • stres - naprostá většina chorob má multifaktoriální původ - u většiny je také jistá (větší či menší) účast genetiky Z čeho lze poznat, že na vzniku určité nemoci (IM fenotypu) se podílí genetické faktory? • binární fenotyp (ano/ne) – familiární agregace • prevalence v rodinách postižených probandů > prevalence v celk. populaci – segregační analýza • nalezení modelu dědičnosti daného fenotypu rodinách (tj. recesivní nebo dominantní) • pouze pro “major” geny • spojitý fenotyp (jak moc) – intra-family correlation coefficient • proporce celk. variability ve fenotypu způsobená variabilitou mezi rodinami – heritabilita • procento variability fenotypu v důsledku variability genotypu (studie na dvojčatech) Míra vlivu jednotlivých faktorů • nemoci z jedné velké příčiny (monofaktoriální) – „alternativní model nemoci“ – jeden faktor je dostatečně potentní k tomu vyvolat sám o sobě nemoc – prostředí a životní styl hrají obecně malou či zanedbatelnou roli – příklady • multifaktoriální (= komplexní) nemoci – „nemoc jako plynulá funkce znaku“ – jsou výsledkem spolupůsobení vícero faktorů jak vnitřních tak vnějších • tzv. “civilizační nemoci” – příklady • obezita • diabetes • ateroskleróza • alergie • nádory početpredisponujícíchgenů celkový počet etiologických faktorů 10 10 monofaktoriální (úrazy, vysoce virulentní infekce) monogenní (cystická fibróza, familární hypercholesterolemie, ...) “single” gen oligogenní (T1DM, celiakie, AMD, Crohnova chroba, ...) “major”/”modifier” geny komplexní (hypertenze, obezita, T2DM, nádory, ...) n genů v interakci fenokopie (obezita), degenerativní onemocnění, ... Nemoci podle počtu etiologických faktorů a genetické podmíněnosti Lékařská genetika • obor zabývající se převážně monogenními, vrozenými nemocemi – mendelistická dědičnost • autozomální – recesivní – dominantní – kodominantní • gonozomální – tzv. geny velkého účinku • 1 gen = 1 nemoc – ale např. CF >500 mutací, LDL receptor >700 mutací • náplň oboru: – patogeneze – diagnostika a predikce – poradenství – screening Diag. využití mol. patologie skrz obory • Onkologie – detekce zbytkové choroby po chemoterapii (MRD) a relapsu – zpřesnění klasifikace tumorů • chromosomální translokace (RT-PCR detekce bcr-abl mRNA, t(9;22) • mutace onkogenů, supresorových a reparačních genů – mozaicismus po allogenní BMT • Hematologie – koagulopatie (poruchy kr. srážení) • hemofilie, von Willebrandova choroba, … – familiarní trombofilie • Factor V Leiden, protrombin 20210A, C677T MTHFR, – anemie/přetížení železem • hereditární hemochromatóza • Mikrobiologie – detekce virů • EBV, CMV, HIV, HVB, C, …… – detekce bakteriálních patogenů • Helicobacter pylori, Mycoplasma tuberculosis, … • Metabolismus, diabetologie a kardiologie – identifikace rizikových markerů nemocí • I/D ACE, HLA DB, DQ, MTHFR, apo(a), apoB, LDL receptor, … – identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekty faktorů prostředí a diety (= nutrigenetika) • MTHFR, …… – identifikace genet. faktorů ovlivňujících efekt léčby (= farmakogenetika) • cytochrom P450 (CYP2D6, ……..) • Forenzní patologie – DNA fingerprinting – DNA profiling – paternita FENOTYPOVÝ PROJEV JAKO DŮSLEDEK MUTACE/POLYMORFIZMU Klasifikace mutací • (A) strukturní = podle mechanizmu vzniku – délkové • delece (1bp – MB) • inzerce + duplikace • inverze • translokace – bodové mutace (SNP) • silent (žádný efekt) • missense (záměna AK) • nonsense (stop kodon) • splice site (exon/intron splicing site) • (B) poziční = podle pozice v genu (lokalizace mutace vs. efekt) – 5’ UTR (tj. promotor genu) • kvantitativní efekt (např. různá intenzita transkripce) – exony • kvalitativní efekt (např. různá sekundární a terciární struktura, aktivita, afinita, …) – introny • kvalitativní efekt (změna sestřihového místa) • kvantitativní efekt ? (vazba represorů nebo enhancerů) – 3’ UTR • efekt na stabilitu mRNA • (C) funkční – ztráta funkce (loss-of-function) • produkt genu je v důsledku mutace nefunkční či je jeho funkce nedostatečná – získání nové funkce (gain-of-function) • produkt genu má v důsledku mutace abnormální funkci – gene dosage effect • odstupňovaný efekt podle množství produktu Funkční klasifikace mutací • (1) “loss-of-function” mutace - recesivní fenotyp – 50% množství produktu stačí – většina vrozených chorob metabolismu • nemocní/přenašeči • celá řada DNA změn může vést k loss-of-function efektu – delece celého genu nebo části genu – porušení struktury bodovou mutací (missense resp. non-synonymní mutace) – translokace, inverze nebo inzerce do genu – porucha transkripce • promotorová mutace snižující mRNA • pokles stability mRNA – frameshift mutace • inaktivace místa sestřihu nebo vytvoření alternativního místa sestřihu nebo nonsense mutace – porucha posttranslační modifikace – porucha celulární lokalizace – porucha parenterálního imprintingu a metylace • (2) “gain-of-function” mutace - dominantní fenotyp – změna DNA, která vede k vytvoření nějaké nové kvality • typicky během maligní transformace (mutace onkogenů vs. supresorů) – dominantně negativní • nejen ztráta funkce produktu jedné alely, ale navíc blokáda funkce produktu normální alely • mechanismy vzniku “gain-of-function” efektu – změna afinity k substrátu, popř. vazba jiného substrátu – overexprese genu – receptor není degradován, trvale obsazen – iontový kanál neustále otevřen – expanze trinukleotidového repeatu (CAG)n – strukturální abnormalita multimerických proteinů – vznik chimerického genu – neznámý Funkční klasifikace mutací • (3) “gene dosage” mutace – týká se většinou genů, jejichž produkty: • jsou součástí signálních nebo metabolických kaskád • soutěží s jinými během embryonálního vývoje a v metabolismu • fungují ve stochiometrickém poměru s jinými • copy-number mutace • na X-chromozom vázané nemoci – např. hemofilie • muži nemocní / ženy přenašečky (ale!!!) – inaktivace jednoho z páru X-chrom. vede k růzě vyjádřenému onem. i žen • chromozmální numerické aberace – polyploidie • triploidie (69 XXX, XXY, XYY) - cca 2% všech početí, časný potrat – aneuploidie • gonozomální – XXX, XXY, XYY - normální očekávaná délka života, poruchy fertility – 45, X - 99% letální, jinak poruchy fertility a fyzické změny • autozomální – nulisomie (chybění páru chromozomů) - preimplantačně letální – monosomie (chybění 1 chromozomu) - embryonalně letální – trisomie (1 chromozom navíc) - až na výjimky většinou embryonálně či fetálně letální » trisomie 13 (Patauův syndrom) - časné poporodní úmrtí » trisomie 18 (Edwardův syndrom) - časné poporodní úmrtí » trisomie 21 (Downův syndrom) – dožití cca 40 let PŘÍKLADY VYUŽITÍ MOL. BIOLOGIE K POCHOPENÍ ETIOPATOGENEZE RŮZNÝCH TYPŮ DIABETU A JEJICH KOMPLIKACÍ Příklady • (A) molekulární diagnostika diabetes mellitus • (příklad 1) typ 1 (T1DM) ~5% • (příklad 2) maturity-onset diabetes of the young (MODY) ~1% • (příklad 3) typ 2 (T2DM) ~90% • (B) stratifikace pacientů a „precision medicine“ – komplikace diabetu • (příklad 4) diab. nefropatie (A) T1DM – příklad 1 • v důsledku autoimunitní destrukce -bb. LO u geneticky disponovaných jedinců – 30 - 50% konkordance u MZT – 15% u DZT • cytotoxická autoimunita (Th1) zprostředkovaná T-lymfocyty vede k postupné destrukci až úplnému chybění -bb. a tím produkce inzulinu • spouštěcí faktory autoimunity – časová a geografická variabilita!!! – virová infekce • zarděnky, spalničky, coxsackie B, CMV, EBV, enteroviry, retroviry) – zevní faktory • proteiny kravského mléka - příliš brzy! • nedostatek vitaminu D (severojižní gradient) – sev. Evropa >>> prevalenci než jižní – slunce?? • toxiny (dieta, voda, bakterie) • dynamika – manifestace obvykle v dětství, ve většině případů autoimunita dokončena, absolutní závislost na exogenním inzulinu Etiopatogeneze T1DM Genetika T1DM • IDDM1 (HLA II lokus, 6p21) – asociace je výsledkem mnohočetných vazebných studií – hlavní rizikové determinanty (alely) u bělochů jsou DRB1 a DQB1 geny • DRB1*04_DQ8 • DRB1*03_DQ2 • cca 10% je non DRB1*04/DRB1*03 – jiné HLA II haplotypy – DQ6 antigen (DQA1*0102 a DQB1*0602) má silný protektivní efekt • nejsilnější riziko nese genotyp DRB1*04_DQ8/ DRB1*03_DQ2 • heterozygotnost pro jednu z výše uvedených alel v kombinaci s jinými představuje menší riziko • jakýkoliv genotyp obsahující DQ6 má dominantně protektivní efekt • molekulární podstata asociace – rizikové a protektivní varianty HLA II mění 3-D strukturu povrchového antigenu ( krystalografie) • antigen-binding cleft – rozdíly v selektivitě prezentovaných peptidů (APC) a stabilitě komplexů antigen/molekula HLA II – protektivní molekuly mají stabilnější vazbu antigenu – hypotézy • nedostatečná delece autoreaktivních T-lymfocytů v thymu • rozdílná vazba na TCR a tím rozdílná imunomodulace T-lymf. (proliferující  regulační) HLA II molekuly – prezentace antigenu - imunotolerance Genetika T1DM • IDDM2 (INS lokus, 11p15) – asociace je výsledkem vazebných studií – minisatelit (VNTR) v 5’UTR • repetice 14-15bp: – alela 1 (26 – 63 repetic) - riziková – alela 2 (64 – 139 repetic) – alela 3 (140 – 210 repetic) – protekční (AD) – asociace není tak jednoznačná jako u HLA II • náznaky paternální transmise (maternální imprinting) • molekulární podstata asociace – inzulin jako autoantigen • riziková varianta vede k nižší expresi genu a tím navození menší imunotolerance??? (A) MODY (Maturity-Onset Diabetes of the Young) – příklad 2 • cca 1% všech diabetiků v populaci – skupina monogenních diabetů s familiárním výskytem a dobře definovaným mendelistickým způsobem dědičnosti (zpravidla AD), časnou manifestací (dětství, adolescenci či časná dospělost) a bez vztahu k obezitě – cca 6 typů (MODY1 - 6) – patofyziologie: geneticky podmíněná dysfunkce -buněk ale dlouhodobě měřitelný C-peptid bez známek autoimunity – dvě podskupiny • MODY v důsledku mutací v glukokináze (MODY2) – lehčí forma bez výrazného rizika pozdních komplikací • MODY v důsledku mutací v transkripčních faktorech (ostatních 5 typů) – těžké defekty -buněk progresivně vedoucí k diabetu se závažnými pozdními následky – postižena glukózou stimulovaná tvorba a uvolnění inzulinu a proliferace a diferenciace -buněk MODY lokus gen produkt prim. defekt závažn o s t k o m p l i k a c e 1 2 0 q HNF4A hepatocyte nuclear factor-4 pankreas vysoká časté 2 7 p GCK glukokináza pancreas/játra mírná vzácně 3 1 2 q TCF1 (HNF1A) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká časté 4 1 3 q IPF1 insulin promoter factor-1 pancreas vysoká ? 5 17q TCF2 (HNF4B) hepatocyte nuclear factor-1 pancreas/ledviny vysoká renální 6 2q32 NEUROD1 NEUROD1 pankreas vysoká ? Funkční význam asociací • glukokináza – “glukózový senzor” (vázne uvolňování a produkce inzulinu) • HNF – většina transkripčních faktorů původně popsaných ve spojení s jaterním metabolizmem je rovněž zapojena ve vývoji pankreatu a B-bb. • IPF1 a NEUROD1 – ovlivňují transkripci inzulinu (A) T2DM – příklad 3 • patofyziologicky nerovnováha mezi sekrecí a účinkem inzulinu – při manifestním T2DM je současně přítomná inzulinová rezistence a porucha sekrece inzulinu – ale co je “slepice” a co “vejce” ???? • inz. rezistence – primární + sekundární při obezitě – kompetice glukózy a NEFA v citrátovém cyklu zejm. ve svalu!!! • inz. sekrece – redukce B-bb. o 20-40% ale 80% redukce uvolňování inzulinu!!! • komplexní choroba se vším všudy • u ~90% pacientů nadváha/obezita – metabolický syndrom INZULIN nedostatečná suprese lipolýzy = nadprodukce NEFA (1) nedostatečná suprese glukoneogeneze = hyperglykemie nalačno (2) nedostatčná suprese tvorby VLDL = dyslipidemie nedostatečná utilizace glukózy (porucha translokace GLUT4) = postprandiální hyperglykemie NEFA interferují s utilizací glukózy NEFA interferují s utilizací glukózy porucha časné fáze sekrece inzulinu, později relativní inzulinopenie Dynamika T2DM Genetika T2DM • problém definice fenotypu – (1) final disease-endpoint (dg. kritéria DM na základě hyperglykemie) – (2) intermediární fenotypy – inzulinová sensitivita/rezistence – sekrece inzulinu – množství/ztráty B-bb. • problém metodologie – vazebné analýzy – příliš se nehodí (díky pozdní manifestaci většinou nedostatečný počet generací) – asociační studie (většinou “under-powered” při malých velikostech souborů – jen tisíce!) • s kandidátní hypotézou • bez (genome-wide association study) • reprodukované LOD/asociace (min. 3 populace nebo meta-analýzy) – stovky asociačních studií – replikované – 4 geny • PPAR - receptor/transkripční faktor (i T1DM !) • KCNJ11(Kir6.2) - receptor – glukózový senzor  buněk • HNF1B - transkripční faktor  buněk • WFS1 – Ca kanál ER - insulinová sekrece/UPR v  buňkách – > 30 vazebných studií – replikované - 2 geny • CAPN10 - nelysozom. neutr. Ca-dep. cystein. proteáza – insulinová sekrece • TCF7L2 - transkripční faktor  buněk (OR 1.56 ) celogenomové studie (GWAS) – doposud cca 38 genů – typicky OR 1.1 - 1.2, vysvětlují max. 5 - 10% genetické predispozice - missing heritability ??? » copy-number variations (CNV-aware chips) » vzácné varianty – whole genome sequencing – GWAS asociace • TCF7L2 2 SNP transkripční faktor • PPAR Pro12Ala receptor/transkripční faktor • KCNJ11(Kir6.2) Glu23Lys receptor – glukózový senzor • HNF1A Ala98Val transkripční faktor • IRS-1 Gly972Arg signální kaskáda ins. receptoru podle dosavadních poznatků se tedy zdá, že se dilema mezi prvotní poruchou sekrece inzulinu vs. inz. rezistencí přiklání k první možnosti, tedy  sekreci “Candidate-gene” strategie vs. GWAS • “candidate-gene” AA – hypotéza o funkčnosti • SNP jako kauzální faktor – znalost patofyziologie je limitujícím faktorem • “indirect” AA – předchozí indikace asociace na základě neparametrické linkage – změna v uvažování díky poznání LD a haplotypové struktury lidského genomu • SNP jako marker • pokrok v designu GWAS díky HapMap – ~ do r. 2005 • detekční metody pro všech ~10 mil. SNPs • shromáždit ~1000 případů a ~1000 kontrol • genotypizovat všechny DNA pro všechny SNPs • tedy ~20 miliard genotypů • s tehdejší cenou (~0.5 USD/genotyp = $10 billion USD pro každou komplexní nemoc) = naprosto nemyslitelné – od ~2007 • detekce setu ~300,000 “tagging SNPs” • shromáždit ~1000 případů a ~1000 kontrol • genotypovat všechny DNA pro všechny SNPs • tedy ~600 milionů genotypů • s dnešní cenou (~0.001 USD/genotyp = $800,000 USD pro každou komplexní nemoc) = naprosto reálné Pokroky v metodologii genotypizace 1 10 102 103 104 105 106 Nb of SNPs Costpergenotype(Cents,USD) 10 1 102 ABI TaqMan ABI SNPlex Illumina Golden Gate Illumina Infinium/Sentrix Affymetrix 100K/500K Perlegen Affymetrix MegAllele 2001 2005 Affymetrix 10K [S. Chanock, NCI] GWAS pro T2DM Funkční význam T2DM asociací TCF7L2 - TCF7L2/Wnt-kaskáda - produkce GLP-1 - produkce inzulinu - diferenciace a funkce B-bb. KCNJ11 - sekrece inzulinu IRS1 - metabolické efekty inzulinu - translokace GLUT4 PPAR-gama - vychytávání glukózy a metabolizmus - diferenciace adipocytů, metabolizmus lipidů CAPN10 - ??? - mitochondriální energetika - translokace GLUT4? HNF1A - vývoj pankreatu - jaterní metabolizmus • hypotetický patomechanizmus asociací – pouze 3 geny se týkají inzulinové rezistence - PPAR , IRS-1 a FTO (ale via BMI!) – všechny ostatní se týkají sekrece inzulinu • embryogeneze  buněk (transkripční faktory) • senzitivity k inkretinům (TCF7L2) • glukózového senzoru  buněk (KCNJ11) • proinsulin processing • exocytózy inzulinu (CAPN10) (B) Diabetes – sladký (?) zabiják – příklad 5 (precison medicine) DM neškodí akutně ale chronicky - chronická hyperglykemie Diabetická choroba ledvin (DKD) • Postihuje  ⅓ – ½ pacientů s T1DM či T2DM • DN je charakterizována – postupně se zvyšující exkrecí albuminu (UAE) a neselektivního proteinu do moči – hypertenzí – postupným poklesem GFR – současnou přítomností retinopatie • Etiopatogeneze – neovlivnitelná rizika: • věk, pohlaví, genetika – částečně ovlivnitelná rizika: • věk při nástupu DM a jeho trvání – ovlivnitelná rizika: • kompenzace DM a TK, hyperlipidemie, dieta/BMI, kouření, fyzická aktivita The decreasing prevalence (and possibly later onset) of diabetic nephropathy in subsequent year-cohorts [Hovind, Diabetes Care 2003] OPTIMISMUS PESIMISMUS roste prevalence DM a tedy i DKD ATP glukóza glyceraldehyd-3-P fruktóza-6-P glukóza-6-P pyruvát laktát RAGE, TNF-a, LTA, endotelin-1 … další geny PARP-1 O2- NF-kB IkB NF-kB / IkB poškození DNA GAPDH NADH NAD+ Glukotoxicita GFAT glukosamin-6-P UDP-GlcNAc HEXOSAMINOVÁ DRÁHA Sp1 (TGF-b, PAI-1, ...) aldózareduktáza sorbitol sorbitoldehydrogenáza fruktóza POLYOLOVÁ DRÁHANAD+ NADHNADPH NADP glutathionreduktáza Schiffova báze fruktosamin NEENZYMATICKÁ GLYKACE methylglyoxal AGEs (1) zesíťování extracel. proteinů (2) modifikace intracel. proteinů (ubiquitin / proteasom) (3) vazba na receptory a aktivace signálních drah NAD(P)H oxidáza eNOSDHAP glycerol-P AKTIVACE PROTEIN KINÁZY C PKCDAG Genetika DKD • na vzniku DKD se podílí genetické faktory – etnické rozdíly v prevalenci – familiární agregace – heritabilita • GFR 0.75 (T2DM, Caucasians) • ACR 0.46 (T2DM, Caucasians) • glomerular number & size • genetické mapování – stovky asociačních studií • min. replikace v GWAS – linkage studie • 3q13-26, 7p, 6q22-27, 10p11-15, 15q21, 16p11-13 (UMOD), 18q22 (CNDP1), 20q11, 22q (MYH9) – GWAS – konsorcia • GoKind UK, GoKind USA, Warren 3, EURAGEDIC, FinnDiane, FIND, SUMMIT, GENIE • celogenomové signifikance – T1DM: FRMD2, CERS, CHN2, CPVL, ZMIZ1, GLRA3, … – T2DM: ELMO1, LIMK2, SFI1, … • meta-analýzy – inconclusive so far – další • NGS – rare variants, EWAS, non-coding RNAs