Strukturní variabilita (SV) genomu a „genomová“ onemocnění Petr Kuglík LMC Ústav experimentální biologie PřF MU v Brně Oddělení lékařské genetiky FN Brno logo Osnova 1. 1.Strukturní variabilita genomu (SV) a CNVs historie, význam z hlediska variability genomu a evoluce 2. 2.Klasifikace CNVs, patogenní CNVs a genomová onemocnění, moderní metody detekce SV n 3.Komplexní CNVs - chromothripsis, chromoplexis a chromoanagenesis n Scherer 2007 Nat Genet 39: s7 Spektrum genetické variability člověka Genomic structural variations (SVs) are generally defined as deletions, insertions, duplications, inversions, and translocations of at least 50 bp in size Variabilita lidského genomu – SV má větší význam než SNP ! •typical genome differs from the reference human genome at 4.1 million to 5.0 million sites •99.9% of variants consist of SNPs and short indels (0, 4 – 0, 5 mil.) •structural variants affect more bases: the typical genome contains anestimated 2,100 to 2,500 structural variants SV: •SV: cca 1,000 large deletions, 160 copy-number variants, 915 Alu insertions, 128 L1 insertions, 51 SVA insertions, 4 NUMTs and 10 inversions affecting cca 20 million bases of sequence ! Nature 256, October 2015 nosekvenováno 2504 genomů člověka z různých oblastí…. (26 populací) n88 milionu variant n84,7 milionu SNP n3,6 milionu indels n60 000 SV Chromozomové aberace jako strukturní variabilita genomu n - submikroskopické změny, mikroskopické změny, změny počtu jednotlivých chromozomů, změny genomů… n na) kvantitativní - copy number variation (CNVs) – delece, duplikace, inzerce… nb) poziční – translokace nc) orientační - inverze n n nVariabilní počet kopií (CNVs) - segmenty DNA větší než 50 pb (1 kb) přítomné ve variabilním počtu kopií v porovnání s referenčním genomem n (Feuk et al. 2006) n n n n Chromosome sequencing: the fifth and final era of cytogenetics nThe modern history of cytogenetics fits into five eras: n nchromosome spreading nchromosome banding nchromosome painting (FISH) nchromosome arraying nand now chromosome sequencing !!! Ferguson-Smith et al. 2017 Karyo MM 5+ oříznutý 1971 G-pruhování (5 – 10 Mb) 1986 Molekulární cytogenetika FISH (100 kb) 1997 array-CGH (oligo 0,06 kb) 2000 NGS Od chromozomů …k analýzám DNA … Výzkumy SV byly umožněny rozvojem nových technologií… n 2010 Optical mapping Cytogenetika 21. století = cytogenomika nCytogenomics is used as a general term that encompasses conventional, as well as molecular cytogenetics(fluorescence in situ hybridisation (FISH), microarrays, NGS n and molecular-based techniques. Silva et al.: European guidelines for constitutional cytogenomic analysis. European Journal of Human Genetics (2019) 27:1–16 1996 DNA mikročipy - revoluce v cytogenetice Array CGH: ~ 1000-krát větší rozlišení nebalancovaných změn než konvenční cytogenetika !!! cri-du-chat_diagram Tradiční karyotypování 5-10 Mb NA14117 46,XY,del(5)(qter>p14:) Microarray CGH 50-100 kb Array-CGH a objev nové genomové strukturní variability - CNVs – variabilní počet kopií 2004 – objev segmentů DNA vyskytující se v různém počtu kopií (kb - Mb) pomocí array-CGH (CNVs) Copy Number Variations in the Human Genome Chromosome Position Person 1 Person 2 Extra DNA Missing DNA Sebat et al 2004 Science 305: 525 Iafrate et al 2004 Nat Genet 36: 949 První objevy CNVs v lidském genomu Copy number variabilní oblasti v (CNVRs) v lidském genomu - 2006 nprvní mapa CN variabilních oblastí v lidském genomu n270 jedinců n1447 variabilních oblastí - CNVRs nCNVRs - 360 Mb n12 % genomu Global variation in copy number in the human genome Richard Redon et al.: Nature. 2006 November 23; 444(7118): 444–454. Genomic distribution of copy number variable regions • •oligonukleotidový čip, 42 miliónů sond •450 jedinců •nalezeno 11 500 CNVs větších než 443 pb • •průměrně 1089 CNVs / >2.5kb na osobu •2 genomy se mohou lišit CNVs o celkové velikosti až 24 Mb !!! •CNVs se překrývají s 2698 geny a ovlivňují expresi…(267 genů ztráta funkce) • Variabilní počet kopií - význam n CNVs – variabilní počet kopií ovlivňuje 12-16 % genomu člověka ! (privátní x populačně specifické) nprůměrný genom obsahuje 3-7 vzácných CNV n5-10 % jedinců nese CNV > 500 kb, 1-2 % > 1 Mb n n nVýznam: nvariabilita lidského genomu (fenotypu)… n n n q qpolymorfismus – genetická diverzita mezi jedinci qevoluce qgenomová onemocnění CNVs a evoluce genů - příklady pozitivní selekce u člověka CNVs – substrát pro adaptaci a evoluci člověka •146 genů s CNVs vykazuje pozitivní selekci u člověka • duplikace i delece genů ! Např. •gen AMY1 •geny podílející se na vývoji mozku, imunitního systému…. Iskow et al. 2012 …a mají význam z hlediska diversity člověka adaptace lokálních populací, metabolismus, imunitní systém… CNVs u jednovaječných dvojčat (MZD) • MZD geneticky identická - možnost studia somatických mutací !!! • analyzovány CNVs u 1097 párů MZD • Affymetrix 6.0 microarray, periferní krev, bukální sliznice…. • nalezeno celkem 4,415 konkordantních delecí a 3,037 duplikací • zjištěno 153 de novo vzniklých diskordantních CNVs > 100 kb často v 15q11.2 CNVs a genomová onemocnění ◼ co CNVs způsobujía jak vznikají ◼ jak je klasifikujeme ◼ jak je můžeme detekovat První pozorování vlivu CNV na fenotyp -- duplikace a mutace Bar u drozofily n nCNVs a efekt prvně popsaný genové dávky u člověka duplikace genu PMP22 – peripheral myelin protein 22 - postižení končetin, atrofie svalstva, porucha citlivosti.. Prof. J. Lupski, 2018 Victor A. McKusick Leadership Award Hereditární motorická a senzorická neuropatie - CNVs a genomová onemocnění proč… a jaké mechanismy…. Genomové choroby (genomic disorders) – vznikají v důsledku přestaveb genomu způsobujících zisky či ztráty genů (CNVs) Evoluce lidského genomu - duplikace genů, genových segmentů a repetitivních sekvencí Vhodné podmínky pro nehomologní rekombinaci, při níž může docházet k přestavbám chromozomů Genomic rearrangements resulting from recombination between repeated sequences. LCRs a SDs v genomu ncca 50 % genomu tvoří repetitivní sekvence zahrnující mj. n nrepetitivní sekvence o nízkém počtu kopií (LCRs) – intrachromozomální duplikace o velikosti >10 kb s > 97 % sekvenční identitou (10-400 kb), vytváří shluky s přímou či inverzní orientací n nsegmentální duplikace (SDs) – segmenty o velikosti > 1 kb s > 90 % sekvenční identitou n nvíce než 5,4 % lidského genomu je pokryto SDs nprůměr 18,5 kb n1 % – 14 % každého chromozomu obsahuje SDs n3,4 % až 10,7 % genů může být duplikováno n n Zhang et al. 2004 Architektura GENOMU vs. GENOMOVÁ ONEMOCNĚNÍ Jeffrey A. Bailey et al. Science 2002;297:1003-1007 •lidský genom je náchylný k strukturní variabilitě v důsledku existence LCRs a SDs ! • •existuje asi – až 8000 „hot spots“ v genomu - tvořeny unikátní sekvencí (o délce 50 kb – 10 Mb), která je ohraničena vysoce homologními úseky DNA, (LCR) či SDs • •substrát pro nealelickou homologní rekombinaci v meióze (NAHR) • nerovnoměrný crossing-over delece, duplikace, inverze, translokace divergence genomu genomová onemocnění ! Rozložení intrachromozomálních a interchromozomálních duplikací (≥10 kb; ≥95%) v genomu Nealelická homologní rekombinace (NAHR) nrekombinace mezi repetitivními sekvencemi (SDs nebo LCRs) Mechanismy vzniku NAHR NAHR může být inter- nebo též intrachromatidová Penk et al. 2015 Mechanismy, kterými CNVs mohou ovlivňovat fenotyp I - monoalelické Harel and Lupski 2017 Genová dávka, haploinsuficience, disrupce, fúze genů …. Figure 1. CNV influencing gene dosage and expression and disease. There are a number of mechanisms by which CNVs potentially could have an effect on gene expression and phenotypic traits. Well-documented examples involve regions with multiple genes deleted in microdeletion syndromes and microduplication syndromes (A), where there is a direct correlation between genotype and phenotype. Copy number polymorphisms where a gene is located entirely within a region that varies in copy number (B) have also been described to show a direct correlation between gene copy number and gene expression. Another mechanism by which CNVs may have an influence on disease phenotype is if the remaining copy harbors a risk allele that becomes apparent only in the hemizygous state (C). The opposite scenario may also occur, with an increased number of copies harboring a risk allele, causing a concurrent increase in disease susceptibility. It can also be hypothesized that CNVs may affect gene expression without directly changing the gene copy number. Gains or losses affecting the regulatory elements or promoter regions can also be important contributors to differences in gene expression. This could involve either loss of an element of transcriptional regulation (D and F) or a loss/gain changing the structural properties of DNA inhibiting enhancer interaction, chromatin structure or access of transcription factors to their binding sites (E). Interaction and additive models with any of these scenarios combined or in combination with any type of variation at other loci can be expected to be the cause of more complex genetic traits. Mechanismy, kterými CNVs mohou ovlivňovat fenotyp II - bialelické Harel and Lupski 2017 Bialelická delece, projev recesivní alely, nekódující varianty… Koncept „genomic disorders“! nod poč. 21. století dochází ke změně pohledu na příčinu některých vrozených genetických onemocnění… ngenocentrický (gene - specific) vs. genomický přístup… n nCNVs - genomová onemocnění (genomic disorders) - 1.7 ×10−6 to 1.0 × 10−4 per locus per generation nonemocnění vzniklá bodovými mutacemi - 1.8–2.5 × 10−8 per base pair per generation n ngenomová onemocnění u člověka vznikají 1000 až 10 000 častěji než onemocnění vyvolaná bodovými mutacemi ! n n CNVs a jejich klinická klasifikace ◼ CNVs • benigní • pravděpodobně benigní • patogenní • pravděpodobně patogenní • nejasného významu (VOUS) Mikrodeleční/mikroduplikační syndromy (MMS) jako příklady patogenních CNVs npříčina - drobné mikrodelece (duplikace) DNA segmentů (2-4 Mb), které nejsou detekovatelné klasickými cytogenetickými metodami npacienti mají společné specifické klinické příznaky…dříve popis dle fenotypu („phenotype first“…) nvariabilní expresivita, neúplná penetrance…. nefekt genové dávky, haploinsuficience… n nrekurentní (LCRs) vs. nerekurentní …. n nkorelace genotyp – fenotyp – genetické poradenství n nčetnost menší než 1 : 2000 - vzácná „chromozomová“ onemocnění ! n Charakteristiky nejčastějších rekurentních mikrodelečních syndromů Devriendt and Vermeesch 2004 Viz. přednáška Cytogenetika Pleiotropie, variabilní expresivita… Moderní metody detekce SV Fisman V., 2021 •sekvenování •optické genomové mapování Masivní paralelní sekvenování – NGS a cytogenetika nPrincip nnové typy sekvenátorů (odtud NGS – next generation sequencing) umožnují paralelní sekvenování až tisíců molekul DNA současně = nižší náklady, úspora času…. n nWorkflow n izolace DNA n fragmentace n příprava templátu neboli vytvoření knihovny amplikonů - amplifikace n sekvenování a detekce inkorporovaných nukleotidů n analýza dat – bioinformatické zpracování n n •Cílené (panel genů) •Exomové (WES) •Celogenomové (WGS) Příklady využití sekvenačních technik v cytogenetice - aneuploidie Neinvazivní prenatální diagnostika – detekce trizomií chromozomů 13,18,21, X a Y pomocí sekvenování • •10.- 12. t. g. • •volná fetální DNA v krvi matky Preimplantační genetický screening aneuploidií pomocí NGS Problémy s detekcí strukturní variability (SV) - pomocí NGS NGS a strukturní variabilita •krátká čtení <300 pb Illumina, nedetekují >70 % SV větší než 50 pb, přítomnost repetitivních sekvencí (telomery, centromery, akrocentr. chromozomy…) Bocklandt S. 2021 NGS vs. cytogenetika nPomocí WGS nelze spolehlivě detekovat aberace v případě: n nA) malých mozaiek či klonů… nB) Robertsonovských translokací… nC) malých markerových chromozomů… nD) balancovaných translokací s místem zlomu v nekódujících sekvencích… n Určité strukturní změny chromozomů nemusí být zachyceny pomocí NGS !!!! Změny detekované na úrovni DNA mohou být způsobeny různými strukturními přestavbami chromozomů! Příklad Ztráty DNA sekvencí (array-CGH, NGS) mohou být způsobeny různými strukturními změnami chromozomů !!! Důležité pro genetické poradenství ! Existuje univerzální metoda, která by nahradila vše? Co umí optické genomové mapování (OGM) Optické mapování genomu - postup Bionano Genomics (https://bionanogenomics.com/technology/platform-technology/) Značení - sekvenční motiv CTTAGG vyskytující se každých 5 kb v genomu •long linear single DNA molecules (median size >250 kb) n Toegelová H. 2016 reference vzorek Detekce chromozomových aberací pomocí optického mapování OGM – příklady chromozomových aberací Mantere et al. 2021 delece 8p22p21.3 t(5;8)(p13.1;p11.2) inverze 13q marker X OGM - příklad translokace (13;20)(q32;p13) Dremsek et al. 2021 OGM – cytogenetika budoucnosti? n Komplexní SV n n n Komplexní chromozomové přestavby (complex chromosomal rearrangements – CCRs) -strukturní přestavby (de novo či zděděné)při kterých dochází ke 3 a více zlomům postihující 2 a více chromozomů -časté chromozomové změny u mnoha nádorů – získané aberace -vzácné chromozomové změny – vrozené aberace (cca 300 případů na celém světě) n Příklad komplexního karyotypu u nádoru CCRs jsou klasifikovány do 3 skupin: •chromothripsis •chromoplexis •chromoanasynthesis chromoanagenesis 2011 – objev „chromotripsis“u pacientky s CLL Rearrangements on Chromosome 4q in a Patient with Chronic Lymphocytic Leukemia NGS - 42 genomových přestaveb Chromothripsis aneb chromozomy v krizi nchromothripsis (z řeckého chromos – chromozom a thripsis – rozdělení na kousky) njedná se o desítky až stovky přestaveb na jednom či více chromozomech vzniklé náhle při jedné katastrofické události nchromozom nebo jeho část je roztříštěn na malé kousky a ty jsou pak následně pomocí reparačních mechanismů náhodně poskládány zpět ntoto složení ovšem není úplně přesné, některé části mohou být sestaveny v jiném pořadí, mohou chybět či být duplikovány nchromothripsis prokázána u různých typů nádorů, ale též u vrozených genetických onemocnění (PMR, vývojové vady) Chromothripsis - charakteristika Meyerson and Pellman 2011 • •desítky až stovky přestaveb vzniklých při jedné náhlé události •postižen je pouze jeden nebo několik málo chromozomů • •místa zlomů vytváří shluky ve specifické oblasti chromozomu •přestavěné chromozomy vykazují delece, duplikace či „copy-number“ neutrální přestavby (translokace, inverze) • •oscilace 1, 2 či 3 kopií Cytogenetické důsledky - komplexní přestavby ndelece tumor supresorových genů, amplifikace onkogenů, vznik fúzních genů… Zemanová Z. et al. Profil array-CGH - chromothripsis 18 (pacient s mnohočetným myelomem) 1) H-MM profil (+3,+5,+9, +11, +15,+19), zisk v oblasti 1q21 a 16p12.1 - 16p13.3, ztráty materiálu v oblasti 8p, 16p13.3; -X 2) arr18p11q32.3(64748-78012829)cth 12x delece, 4x zisk, 2x amplifikace delece duplikace Objev chromothripsis přinesl nový pohled na úlohu chromozomových změn při tvorbě nádoru ! a) model of „multistep tumor development“ - postupná kumulace mutací a genomových změn b) „chromothripsis – driven tumor development“ – jedna katastrofická událost Rode et al. 2016 n Chromothripsis u nádorových onemocnění nvýskyt 3 – 5 % všech nádorových onemocnění nchromothripsis prokázana u leukémií, mnohočetného myelomu, karcinomu tlustého střeva, meduloblastomu, neuroblastomu… nčastý výskyt u nádorů kostí (až 25 %)- osteosarkom, Ewingův sarkom, chondrosarkom nchromothripsis – horší prognóza !!! – rozsáhlé přestavby - delece, duplikace, inverze, inzerce - deregulace velkého počtu genů !!! nselekční výhoda, proliferace buněk…. Pacienti s MM a chromothripsis – rezistence k nejmodernějším protinádorovám lékům – Bortezomid (Velcade) ? Molekulární mechanismus rozpadu chromozomů = mnohonásobný dvouřetězcový zlom (DSB) Pandey and Raghavan 2018 Chromothripsis – molekulární mechanismy vzniku aberantních chromozomů – chybná reparace DSB Bezchybná reparace S – G2 fáze Chybující reparace po celý buněčný cyklus Co může spustit rozpad chromozomů vnější faktory nVirové infekce n nIonizující záření n nCannabis exposure Co může spustit rozpad chromozomů vnitřní faktory •chyby při segregaci chromozomů – vznik mikrojádra…. • •předčasná kondenzace chromozomů (PCC) v mikrojádře • •porucha telomer – zkrácení, fúze sesterských chromatid, masivní rozpad… • •selhání apoptózy •mutace genu p53 •replikační stres – inhibice DNA polymerázy… Rode et al. 2016 Jak vzniká chromothripsis - A model of chromothripsis and aneuploidy via micronucleus formation Forment et al. 2012 •vznik mikrojádra •defektivní a opožděná replikace chromozomu v mikrojádře – poškození DNA •předčasná kondenzace chromozomu •masivní rozpad chromozomu v mikrojádře •spojení fragmentů – vznik derivovaného chromozomu s chromothripis •začlenění do jádra Chromothripsis a mutace genu p53 předchází mutace genu 53 chromothripsis? • Chromoplexis chromo – chromozom, plexis - restrukturalizace •jediná katastrofická událost…. •rozpad chromozomů - vznik mnohonásobných translokací a delecí postihující až 7 chromozomů (vznik fúzních genů) •nalezena u nádoru prostaty (delece genu PTEN či tvorba TMPRSS2-ERG fúzního genu), nádoru nádoru plic, melanomu… Pellestor 2019 Chromoanasythesis – mechanismy ABERANTNI REPLIKACE v důsledku jedné katastrofické události •blokování replikační vidlice a změna templátového vlákna (fork stalling and template switching, FoSTeS) nebo •replikace způsobená zlomem zprostředkovaná mikrohomologií (microhomology-mediated break induced replication, MMBIR) •tento typ komplexních přestaveb je spojován s výskytem častějších duplikací, triplikací, inverzí…..vyskytuje se u vrozených VV, PMR….. • Pellestor 2019 n Chromothripsis vs. chromoanasynthesis – rozdíly Chatron N. ESHG 2020 Ukázka chromoanasyntesis s opakovanými amplifikacemi na chromozomech 22 a 18 u tří pacientů s PMR a VVV • Masset et al. 2016 Chromoanasythesis při gametogenezi nkonstituční chromothripsis může vznikat ve spermiích, vajíčkách, raných embryích…. nčastěji postižen původem otcovský chromozom (spermatogeneze citlivější k poškození DNA …vysoký počet dělení, omezená reparační kapacita) nvznik komplexních přestaveb, delece, duplikace, inverze, translokace…ale méně změn… npouze chromothripsis vedoucí k balancovaným aberacím je životaschopná ! ndůsledkem jsou pacienti s dysmorfickými rysy, vývojovými vadami, PMR… n n Chromoanagenesis v preimplantačních embryích n Lidská preimplantační embrya vykazují vysoký stupeň chromozomové instabillity: •aneuploidie, chaotický karyotyp - 60% •mozaicismus - 20-50 % •často chromoanagenesis ! Příčiny: rychlé dělení,mitotické chyby, replikační stres, tvorba mikrojader….. 1. 1. Chromothripsis u vrozených chorob -příklad •Loeys-Dietzův syndrom - je autozomálně dominantní genetické onemocnění, které se podobá Marfanovu syndromu. • •Toto onemocnění je způsobeno mutací v genech kódující TGF-β signální dráhu. Tato dráha reguluje buněčnou proliferaci, diferenciaci a reguluje několik funkcí pojivové tkáně. Narušení genů kódujících TGF-β signální dráhu nebo jejích složek je příčinou několika lidských patologií, jako jsou aneurisma aorty, skolióza, arachnodaktylie, hrudní deformace, hyperflexibilitu kloubů a mentální postižení. Loeys–Dietzův syndrom a chromothripsis •Kazuistika - 18 letá ženy nízkého vzrůstu, která měla nízké IQ (70), vývojové vady, srdeční anomálie, skoliózu, morfologické anomálie kostí, hyperflexibilitu kloubů a mnoho dalšího, které odpovídají mutaci v genech pro TGF-β signální dráhu - Fontana, et al. (2014) • •Genetická analýza pomocí aCGH prokázala 6 zlomových míst (čtyři na chromozomu 1, jedno na chromozomu 9 a jedno na chromozomu 21) a čtyři de novo delece zahrnující 20 genů •Array-CGH identified the interstitial deletion of four regions: 1q41, that was approximately 5.23 Mb in size; 1q43 (1.33 Mb); 9p24.3 (158.71 kb); and 21q22.12 (826 kb). •Deletované OMIM geny - SMYD2, PTPN14, CENPF, KCNK2, KCTD3, USH2A, ESRRG, SPATA17, RRP15, TGFB2 (1q41); CHRM3 (1q43); KANK1 (9p24.3); RCAN1, CLIC6, RUNX1 (21q22.12). • Tyto aberace se shodují s kritérii pro chromotripsis, konkrétně v bodech: •Na jednom chromozomu, rameni chromozomu nebo v jedné oblasti chromozomu se vyskytuje více komplexních přestaveb. Může se také objevit i více přeskupení mezi dvěma a více chromozomy. • Fenotyp pacientky s Loeys–Dietzovým syndromem Na obrázku lze vidět morfologické anomálie kostí a extrémní prohnutí kolenou (Fontana, et al., 2014) •7 duplikovaných segmentů na 18q •1 triplikace 18p •20 Mb navíc Pacient s faciální dysmorfií – abnormální chromozom 18 Může být chromothripsis užitečná? •WHIM syndrom •WHIM - warts, hypogammaglobulinemia, infections and myelokathexis syndrome •vzácný syndrom vrozené imunodeficience – opakované bakteriální a virové infekce •příčina – mutace genu CXCR4 (2q22.1) …autozomově dominantní • •59 letá pacientka, 2 postižené dcery s mutací CXCR4 •sama 20 let bez potíží •cytogenetické vyšetření – nález o 15 % kratší chromozom 2 •NGS – chybí mutovaná alela CXCR4 a dalších 163 genů •delece genu po reparaci - chromothripsis léčí? McDermott et al. 2015 - Chromothriptic Cure of WHIM Syndrome Závěr n nSV představuje hlavní zdroj polymorfismu a n genetické variability mezi jedinci, má velký význam z hlediska diversity a evoluce lidského genomu n nPatogenní CNVs mohou způsobovat závažná genomová onemocnění njak s mendelovským způsobem dědičnosti tak mohou ovlivňovat komplexní znaky i nádory nnová kategorie genetických chorob? nmonogenní onemocnění nchromozomové syndromy (např. +21) n„genomic disorders“? n