Molekulární diagnostika Molekulární diagnostika Iveta Valášková We now know how God wrote the book of life Bill Clinton But do we know how to read the book ? Molekulární diagnostika - Diagnostika infekčních onemocnění - Genetická identifikace - Diagnostika genetických chorob Diagnostika infekčních onemocnění HPV Chlamydia Hepatitis HIV Toxoplasmosis Genetická identifikace - Paternitní testy - Forenzní testy Jsem biodetektiv, jmenuji se DNA a usvědčím každého! •Řešení trestních činů – shoda mezi podezřelým a stopou místa činu •Oběti neštěstí – havárie letadla, zemětřesení…. •Vojáci ve válce – kdo je „neznámý“ voják…. •Paternitní testování – kdo je otcem…. •Příbuzenské vztahy – nárok na dědictví…..…. •Hledání pohřešovaných osob – nález těla a identifikace •Vytváření databáze usvědčených zločinců Ve všech případech se určují DNA profily pomocí STR markerů a následně je hledána shoda s referenčním vzorkem Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) délka základní repetice 2 – 6 bp počet opakování repetice 2 – 100 bp Rozptýlené rovnoměrně v lidské genomu Vyskytují se běžně v populaci Nejsou přepisovány do proteinu leží v intronech Nejsou příčinou choroby Tvoří vzorce bez vztahu s fenotypem Mezi jednotlivci se velmi liší Odlišují jednoho člověka od druhého Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) Mikrosatelity - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats) STR - určení otcovství CODIS loci CODIS loci jsou DNA oblasti / znaky, které používá FBI a další světové agentury jako dohodnutý standard pro ukládání genetických profilů osob. Ve vyhodnocení paternitních testů se v současné době používá 16 oblastí DNA. Dnešní genetika ovšem během posledních let nabízí možnosti, o jakých se dřív ani nesnilo. Nejistý otec si bez problémů ověří, jestli vychovává svoje dítě a nejistá matka zjistí, který z tatínků je ten pravý, biologický. DNA je natolik variabilní, že každý člověk je de facto unikát a otcovství se tak dá potvrdit nebo vyvrátit s téměř stoprocentní pravděpodobností. Nakolik je celá tahle revoluce ve finále přínosná pro děti, je ovšem téma k další diskuzi. Diagnostika genetických onemocnění Cytogenetika Molekulární cytogenetika Molekulární diagnostika Molekulární diagnostika genetických chorob - Genetické rizikové faktory - Farmakogenetika - Patologické varianty u monogenních chorob Genetické rizikové faktory Monogenní choroby jsou způsobeny patologickou variantou v jednom genu: Chorobu způsobující (kauzální) varianty Multifaktoriální choroby jsou způsobeny kombinací variant několika genů: Genetické rizikové faktory Genetické rizikové faktory Thrombosis Kardiovasculární choroby Alzheimerova choroba Osteoporosis Genetické rizikové faktory Většina jednotlivých rizikových faktorů nemá žádný klinický význam u jednotlivých pacientů Genetické rizikové faktory Thrombosis Factor V Factor II MTHFR Molekulární diagnostika genetických chorob - Genetické rizikové faktory - Farmakogenetika - Patologické varianty u monogenních chorob Farmakogenetické testy •Léková specificita •Léková účinnost /toxicita Léková specificita Herceptin : HER2 Tyrosine kinase inhibitors BCR / ABL KIT PDGFR A/B EGFR Léková účinnost/toxicita Cytochromy CYP2D6 CYP2C9 CYP2C19 Molekulární diagnostika genetických chorob - Genetické rizikové faktory - Farmacogenetika - Patologické varianty u monogenních chorob Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace Monogenní choroby > 6.500 monogenních chorob Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace Patologické varianty Jednoduché testy běžné patologické varianty Náročné testy: Privátní patologické varianty Patologické varianty Jediná patologická varianta Fragile X Srpkovitá anemie Běžné patologické varianty Nesyndromová ztráta sluchu Hemochromatóza Panel patologických variant Cystická Fibroza Privátní patologická varianta Rakovina prsu LQT syndrom Jednoduché testy Disease Gene Mutation Fragile X FMR1 Repeat FRAXE FMR2 Repeat Friedreich ataxia FRDA Repeat Haw River DRPLA Repeat Huntington type 1 HD Repeat Kennedy AR Repeat Myotonic dystrophy type 1 DMPK Repeat Spinocerebellar ataxia SCA1,2, 3, 6, 7, 8,10, 12,17 Repeat Alpha 1 antitrypsin PI 2 common mutations Charcot-Marie-Tooth Type 1A PMP22 1 common mutation Cystic fibrosis CFTR Common mutations Deafness GJB2 1 common mutation Hemochromatosis type1 HFE 2 common mutations Hereditary neuropathy (HNPP) PMP22 1 common mutation Sickle cell anemia HBB 1 common mutation Spinal muscular atrophy SMN1 1 common mutation Beta thalassemia HBB 1 exon Náročné testy Disease Gene Mutation Breast cancer BRCA1 Private BRCA2 Private Colon cancer MLH1 Private MSH2 Private MSH6 Private Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace DIAGNOSTIKA RNA DNA PŘÍMÁ NEPŘÍMÁ analýza mikrosatelitů SCORING •Restrikční analýza PCR produktu •Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy •detekce variant pomocí sond •ARMS •MLPA •Triplet Primed PCR SCANNING •analýza teploty tání (SYBR Green) •sekvenování EXPRESE SESTŘIH „SEKV. EXONŮ“ Detekce variant - scoring Amplifikace úseku s předpokládanou delecí detekce delecí Restrikční analýza PCR produktu mutací vzniká nebo zaniká specifické místo v DNA, rozlišované restikčním enzymem Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy detekce bodových mutací PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) detekce bodových mutací PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA úspěšná amplifikace odhalí přítomnost specifické přestavby v DNA Analýza teploty tání PCR produktu pomocí real-time PCR změna teploty tání v porovnání s pozitivní a standartní kontrolou odhalí specifickou sekvenční změnu Triplet Primed PCR detekce expanze trinukleotidových repeticí v DNA Multiplex Ligation Probe Amplification MLPA detekce rozsáhlých delecí a duplikací, vhodná pro stanovení SNP genotypů a testovanání metylací v promotorové oblasti genů Detekce variant - scanning Jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA neohaluje pozici změny Denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) vysoká citlivost nutné primery s GC-clampy neodhaluje pozici změny Heteroduplexní analýza (HD) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA omezená citlivost neodhaluje pozici změny Detekce zkráceného proteinu (PTT) vysoká citlivost pro terminační mutace pouze pro terminační mutace odhaluje pozici změny Analýza teploty tání na real-time PCR, HRM vysoká citlivost doporučuje se pro sekvence cca 250 bp neodhalí pozici změny Sekvenování detekce veškerých změn v DNA nadbytek informací plně charakterizuje mutace Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace Cena Jedna patologická varianta : levné Prevalující patologická varianta : levné Panel patologických variant : mírné Privatní patologická varianta: drahé (1000 E) Cena •Socioekonomická situace •Socialní aspekty •Hrazení pojišťovnou Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace Běžné genetické choroby Disease Frequency Mutation Genes Mutations Conclusion Hemochromatosis 1 / 600 1 / 400 HFE 3 common mutations Easy / cheap Breast Cancer 1 / 20 1 / 500 BRCA1 BRCA2 Mutations in 23 exons Mutations in 28 exons Complicated / expensive Hypercholesterolemia 1 / 500 1 / 750 LDLR Mutations in 16 exons Complicated / expensive Colorectal Cancer 1 / 25 1 / 1.000 MLH1 MSH2 MSH6 APC MUTYH Mutations in 19 exons Mutations in 16 exons Mutations in 10 exons Mutations in 15 exons Mutations in 16 exons Complicated / expensive Cystic fibrosis 1 / 6.500 1 / 2.500 CFTR Common mutations Easy / cheap Prelingual deafness 1 / 1.500 1 / 4.000 GJB2 1 common mutation Easy / cheap Fragile X syndrome 1 / 5.000 1 / 5.000 FMR1 Only 1 mutation Easy / cheap SMA 1 / 10.000 1 / 10.000 SMN1 Only 1 mutation Easy / cheap Beta Thalassemia variable variable HBB Only 1 exon Easy / cheap Frekventované DNA testy • Thalassemia • Cystic fibrosis • Breast cancer • Colorectal cancer • FRAXA • F5 Leiden Diagnostické hrdlo láhve • Počet chorob • Závažnost varianty • Technologie • Cena • Počet vzorků • Organizace Organizace • Malé lokální laboratoře: malé portfolio ( < 50 tests ) • Velké komerční laboratoře: běžné + jednoduché testy • Akademické laboratoře: výzkum -diagnostika Pohled do budoucnosti Sekvenční síla Cena Celoexomové/celogenomové sekvenování Sekvenování všech pacientů Next generation sequencing