Bi9393 Analytická cytometrie Biofyzikální ústav AVČR Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. Lukáš Kubala, Ph.D., doc. Soňa Legartová, Ph.D. Alena Hyršlová Vaculová,Ph.D., doc. Mgr. Radek Fedr Cytometrie ◼ Cytometrie je souhrnné označení pro skupinu metod používaných pro měření různých charakteristik buněk. Proměnné, které lze měřit cytometrickými metodami, zahrnují velikost buňky, počet buněk, morfologii buněk (tvar a strukturu), fáze buněčného cyklu, obsah DNA a přítomnost či nepřítomnost specifických proteinů na buněčném povrchu nebo v cytoplazmě. Cytometrie se používá k charakterizaci a počítání krevních buněk v běžných krevních testech, jako je úplný krevní obraz. Podobným způsobem se cytometrie také používá ve výzkumu buněčné biologie a v lékařské diagnostice (například k odhalování rakoviny či AIDS). Existují různé typy cytometrie: ◼ Průtoková cytometrie ◼ Spektrální průtoková cytometrie ◼ Hyperspektrální cytometrie ◼ Obrazová cytometrie ◼ Hmotnostní cytometrie ◼ Cytometrie in vivo (neinvazivní cytometrie) Ref. What is Cytometry?. International Society for Advancement of Cytometry. 2013-03-28 Struktura kurzu ◼ Přednášky - 9 lekcí o průtokové cytometrii a aplikacích - 1 lekce o mikroskopických technikách - 1 lekce o základech analýzy obrazu - 2 lekce studentských prezentací ◼ Bi9393c Analytická cytometrie-cvičení, 4 dny v bloku, od 8.1. nebo od 15.1. 2023 ◼ Navazuje na přednášky z oblasti průtokové cytometrie, blokově ve skupinách ◼ Test Kurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu bude tvořit 75% celkového hodnocení. ◼ Seminář Každý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím a bude se týkat zaměření kurzu. Na základě této prezentace bude udělen zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce. Seminář studentů ◼ Téma semináře: Jak ve své DP/DSP používám/chci použít/ mohl bych použít metody analytické cytometrie. ◼ Cílem je demonstrovat pochopení principů ze kterých vychází a jejich uplatnění v biologii. ◼ Prezentace musí být připravena např. v PowerPoint(u). Prezentaci je doporučeno předložit v předstihu přednášejícímu ke konzultaci a posouzení. ◼ Délka prezentace je 5 minut (~ 2 min představení podstaty Vaší experimentální práce) + diskuse Informační zdroje – průtoková cytometrie ◼ Practical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition ◼ Cytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition ◼ Flow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda (Editor), February 2007 ◼ Single Cell Analysis, J. Paul Robinson, Andrea Cossarizza, 2017 Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/newbook.htm https://www.beckman.com/resources/reading- material/ebooks/practical-flow-cytometry Howard Shapiro Informační zdroje – průtoková cytometrie (metody a protokoly) ◼ The Handbook of Flow Cytometry Methods ◼ Current Protocols in Cytometry ◼ Company web pages, e.g. – https://www.thermofisher.com/cz/en/home/references/protocols.html – https://www.thermofisher.com/cz/en/home/references/protocols/cell-and- tissue-analysis/flow-cytometry-protocol.html Informační zdroje – cytometrie (časopisy) ◼ Cytometry Part A https://onlinelibrary.wiley.com/journal/15524930 ◼ Cytometry Part B: Clinical Cytometry https://onlinelibrary.wiley.com/journal/15524957 Informační zdroje - mikroskopie ◼ Taatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005 ◼ Stephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006. ◼ Pawley, J. (Ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed., 2006 ◼ Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications ◼ Ulrich Kubitscheck (Editor), ISBN: 978-3-527-32922-9, 2013, Wiley- Blackwell Informační zdroje – (Internet) ◼ Purdue University, Cytometry Labs http://www.cyto.purdue.edu/ ◼ International Society for Advancement of Cytometry http://www.isac-net.org/ ◼ Excyte https://expertcytometry.com ◼ https://twitter.com/ISAC_CYTO ◼ https://twitter.com/flowcytometryUK ◼ https://twitter.com/FlowJoNow ◼ https://www.csac.cz Obecný úvod do průtokové cytometrie ◼ Základní principy, možnosti průtokové cytometrie a její aplikace ◼ Historie Tyto částice mají něco společného … Algae ChromosomesBlood cells Protozoa … určité parametry těchto částic mohou být měřeny pomocí průtokové cytometrie. Komerční zařízení a vývoj Co je průtokový cytometr? Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? ◼ Počítat částice v suspenzi ◼ Kvantifikovat rozptyl světla, a intenzitu fluorescence na úrovni jednotlivých buněk ◼ Hodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu ◼ Fyzicky separovat jednotlivé částice (definované populace i jednotlivé buňky) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jaké jsou principy? ◼ Rozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy ◼ Detekce specifické flurescence nebo celého spektra ◼ Hydrodynamicky zaostřený proud částic ◼ Elektrostatická separace částic ◼ Možnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Definice ◼ Průtoková cytometrie (flow cytometry) – Meření vlastností proudících částic (buněk) – také známo jako Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) ◼ Průtoková separace (flow sorting) – fyzická separace částic (buněk) na základě parametrů měřených průtokovou cytometrií Technické součásti ◼Zdroje světla ◼Detekční systémy ◼Fluidní systém ◼Separace ◼Sběr dat ◼Analýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti ◼Detekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní >8 Diody dříve detekce rozptylu světla (light scatters) nyní i detekce fluorescence ◼Zdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Netechnická část je neméně důležitá … ◼ (ne)specifické značky/sondy ◼ protilátky ◼ biomarkery ◼ příprava, zpracování materiálu/vzorků/tkání ◼ … Historie barvení biologických materiálů Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení svalových buněk www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Historie barvení biologických materiálů Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních leukocytů Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71. The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn- Malachowski-Romanowsky-Nocht- Jenner-May-Grunwald-Leishman- Reuter-Wright-Giemsa-Lillie-Roe-Wilcox stain. The mystery unfolds. Woronzoff-Dashkoff KP. Princip fluorescenčního mikroskopu - August Köhler - 1904 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html Historie barvení biologických materiálů Andrew Moldavan Není jasné zda Moldavan vůbec svůj „počítač buněk“ sestrojil. Ve svém, článku popisuje mnoho problémů, ale žádné výsledky. Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells Andrew Moldavan Montreal, Canada Science 80:188-189, 1934 “The purpose of the experiment is to have each microscopical cell passing through the capillary tube, register itself automatically on the photoelectric apparatus, thus creating a micro-current which can be amplified and recorded.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Coons et al 1941 – vyvinuli techniku fluorescenčního značení protilátek - označili anti-pneumokokové protilátky pomocí antracénu. To jim umožnilo detekovat protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV fluorescence. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941 “Moreover, when Type II and III organisms were dried on different parts of the same slide, exposed to the conjugate for 30 minutes, washed in saline and distilled water, and mounted in glycerol, individual Type III organisms could be seen with the fluorescence microscope……” Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem (FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Friedman Friedman (1950) – kombinoval kyselý fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro detekci buněk nádorů dělohy pomocí fluorescenčního mikroskopu Acid Fuchsin Acid magenta Acid rubin Acid roseine Absorption Max 540-545 von Bertalanffy & Bickis Ludwig von Bertalanffy (1901-1972) von Bertalanffy & Bickis (1956) - metachromatická fluorescence Akridinové oranže byla použita pro detekci RNA v tkáni - použili ji také pro rozlišení normálních a nádorových buněk Absorption Max 467 nm J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Immunodetekce History: 1940 – Conns, imunofluorescenční značení kryořezů 1959 – Singer, vývoj metody konjugující protilátky se značkou 1966 - Graham&Karnovsky, metoda značení protilátek enzymy (HRP) 1974 – Taylor&Burns – rutinní imunohistochemie 1975 – Kohler&Milstein – produkce monoklonálních protilátek pomocí hybridomů Stain Your Own Cell P.J. Crossland-Taylor „Sheath Flow“ princip “Provided there is no turbulence, the wide column of particles will then be accelerated to form a narrow column surrounded by fluid of the same refractive index which in turn is enclosed in a tube which will not interfere with observation of its axial content.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Wallace Coulter ◼ Wallace Coulter Coulter orifice - 1956 ◼ (patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Originální patentová aplikace W.Coultera 1953 Photo by J.Paul Robinson J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jak počítat buňky? ◼ Hemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 ◼ Rozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200 ◼ Leukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky ◼ Statistická chyba: – koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% – chyba pipetování a ředění je ~ 10% Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Roche Innovatis Cedex CellDrop - Denovix https://www.denovix.com/celldrop/ Coulter Counter První komerční verze CC Coulter Counter © CC Beckman Coulter ◼ Multisizer™ 3&4 COULTER COUNTER® Roche Innovatis CASY TT Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970). Mack Fulwyler- sorter Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Richard Sweet Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Mack Fulwyler- sorter Mack Fulwyler- sorter K. Souček Leonard Arthur "Len" Herzenberg Klíčové „cytometrické“ publikace ◼ 1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře ◼ 1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk ◼ 1949: Coultrův počítač částic ◼ 1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce ◼ 1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna ◼ 1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru ◼ 1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk ◼ 1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science ◼ 1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině) ◼ 1969: Gohde – patent ◼ 1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii ◼ 1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického parametru ◼ 1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii ◼ 1973: Gohde – patent dvojího značení ◼ 1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení ◼ 1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu ◼ 1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu ◼ 1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA ◼ 1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů ◼ 1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka čárkových kódů Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History K čemu to všechno je… například… K čemu to všechno je… například… ◼ 38 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO, 2019) ◼ ročně zemře ~ 0,7 miliónu lidí na HIV/AIDS, 1,7 milionu nově infikovaných (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků) ◼ kvantifikace CD4 T lymfocytů byla/je klíčový parametr při monitorování onemocnění/léčby, od ~1985 ◼ Since 2016, WHO recommended that all people living with HIV be provided with lifelong ART, including children, adolescents and adults, and pregnant and breastfeeding women, regardless of clinical status or CD4 cell count. By the end of 2019, 185 countries had already adopted this recommendation, covering 99% of all people living with HIV globally. ◼ Průtoková cytometrie je „zlatý standard“ ◼ Optimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250 vzorků / den) ◼ Aydogan Ozcan: „Kill the cost, safe life“ Flow Cytometry On-a-Chip ◼ MAGNETIC COUNTING – RESEARCHER: Hakho Lee, Assistant Professor of Radiology, Harvard Medical School PROJECT: Enumerating and characterizing circulating tumor cells PROBLEM: Circulating tumor cells (CTCs) are incredibly rare, with just a handful per milliliter of human blood. SOLUTION: Lee’s group fabricated a hybrid microfluidic device out of polydimethylsiloxane (PDMS) that can count CTCs in real time using tiny sensors called micro-Hall detectors. (Sci Transl Med, 4:141ra92, 2012) ◼ PCR-ACTIVATED SORTING – RESEARCHER: Adam Abate, Assistant Professor of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco PROJECT: Analysis of rare, uncultivable microbes PROBLEM: Developing specific antibodies for bacteria that cannot be cultured SOLUTION: As a postdoc in the Harvard University lab of droplet-based microfluidics pioneer David Weitz, Abate codeveloped a device that could sort droplets according to their fluorescence intensity. Unlike traditional microfluidics, in which molecules and cells flow naked through channels, droplet-based devices encapsulate molecules or cells in uniform, picoliter-scale aqueous reaction chambers encased in oil. ◼ SORTING BY CELL DEFORMABILITY – PROJECT: Cancer cell phenotyping PROBLEM: Not every cell type has a known antigen that defines it. Plus, antibody binding may activate receptors, potentially changing the cell’s behavior. SOLUTION: A physicist by training, Guck used laser beams in his graduate work to study the physical properties of cells. Not all cells are equally squishy, he found: while normal cells are relatively rigid, cancer cells are more pliable. “The more aggressive the cell, the softer it is, and that may be necessary for it to pass into tissues,” Guck explains. ◼ RAMAN-ACTIVATED CELL SORTING – RESEARCHER: Jian Xu, Professor and Director, and Bo Ma, Group Lead of Microfluidics, Single-Cell Center, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences PROJECT: Microbial biofuels development PROBLEM: Biofuels R&D requires identifying cells capable of specific carbon chemistries. But as these cells have yet to be cultured and studied, researchers have few if any molecular hooks for identifying and sorting them. SOLUTION: The team turned to a label-free method of single-cell interrogation known as Raman-activated cell sorting (RACS) (Anal Chem, 87:2282-89, 2015). http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/43034/title/Flow-Cytometry-On-a-Chip/ Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing (CITE-seq) Co tomu předcházelo…a čeho jsme i nyní součástí… ◼ Rozvoj techniky umožňující rychlou a reprodukovatelnou detekci cytometrických parametrů. ◼ Nové vědecké poznatky vedoucí k definici vhodných diagnostických markerů. http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/start.htm?loc=http://www.cyto .purdue.edu/cdroms/gh/HTML/video/video.html?v=Flowtheinvention.wmv ISAC presents: Mack Fulwyler Innovator, Inventor & Pioneer http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyl er.html https://www.youtube.com/watch?v=3s5l2mepKkY State-of-the-Art Two common ways to quantify the total number and type of cells in a sample 5 9Microscopy Provides details of cell morphology for tens or hundreds of cells. Can provide information about cellular interactions. Shape Distribution of components in the cell Flow Cytometry Quantifies a high number parameters of cells in suspension for hundreds or thousands of cells per second and is capable of sorting living cells. Size Surface and intracellular components Granularity BD technology and innovation BD CellView™ Image Technology, provides the features of both and more High speed, high-parameter flow cytometry High-content images providing cell morphology and cellular interactions Rapid analysis and sorting of cell populations defined by traditional flow parameters combined with new image parameters BD technology and innovation January 21st, 2022 BD technology and innovation 6 1 Real-time cell images 6 2 Lysed whole blood Mouse over any data point and see the cell image pop-up HeLa cells Image data and all flow data are merged and correlate one to one Real time display of gated events on image wall BD technology and innovation Shrnutí přednášky ◼ Úvod do kurzu ◼ Zdroje literatury ◼ Historie průtokové cytometrie ◼ Základní principy Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz 2. znát základní zdroje informací 3. mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie 4. orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie