Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie https://www.bosterbio.com/protocol-and-troubleshooting/flow-cytometry-principle Signal processing time analogsignalintesity VOLTAGE FSC ~ cell size FL-1 (530/30nm) ~ green fluo. FL-2 (585/42nm) ~ red fluo. Analog/digital conversion Height Width Area ( ∫ ) FL- (H, W, A) FL-1(H) FL-2 (H) dot plot 0 1000 1000 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Způsoby pro zobrazení dat K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Histogram distribuce četnosti ◼ Histogram zobrazuje četnost částic pro jeden parametr ◼ Jednoduchý výstup ◼ Nekorelujeme s dalším parametrem ◼ Problém s identifikací populací K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Dot plot ◼ Zobrazuje korelaci dvou libovolných parametrů ◼ Jednotlivé tečky představují konkrétní změřené buňky (částice) ◼ Hodnoty pro řadu částic mohou ležet ve stejném místě ◼ Nemáme informaci o relativní denzitě částic ◼ Problémy s vykreslením v případě velkých objemů dat K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Density & contour plot Density plot: ◼ Zobrazuje dva parametry jako frekvenci četnosti ◼ barva a nebo její odstín odpovídá četnosti částic Contour plot: ◼ spojnice spojuje body (částice) se stejnou hodnotou signálu ◼ V podstatě simulujeme 3D graf – třetí rozměr je frekvence K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Čas jako jeden z parametrů R1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Určení regionů ▪Objektivní nebo subjektivní? -školení/schopnosti/trénink ▪Možné tvary: -obdelník -elipsa -“free-hand“ (polygon) -kvadrant ▪Statistika - počet - podíl (%) - průměr, medián, S.D., CV, …. Region, gate ▪oblast (plocha) v grafu definovaná uživatelem ▪mnoho regionů v jednou grafu ▪ohraničujeme pomocí nich populace našeho zájmu ▪je možné je barevně odlišit ▪je definován stejně pro všechny vzorky v analýze ▪lze je kombinovat pomocí logických operátorů (AND, OR, NOT; Booleova logika) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Statistika ◼ Aritmerický průměr ◼ Geometrický průměr ◼ Medián – odhad střední hodnoty – není ovlivněn extrémními hodnotami ◼ Směrodatná odchylka ◼ Koeficient variance ◼ Modus – nejčastější hodnota K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Statistika pro histogram K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Analýza kvadrantů (+ +)( - +) (+ -)(- -) K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Logický „Gating“ (Booleova logika) S překrývajícími se oblastmi máme mnoho možností: upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Not Region 1: upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Not Region 2: upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Region 1 or Region 2: upraveno podle J.P.Robinson Boolean Gating Region 1 and Region 2: upraveno podle J.P.Robinson Not (Region1 and Region 2): Boolean Gating upraveno podle J.P.Robinson Back Gating Region 4 established Back-gating using Region 4 logPE Back gate upraveno podle J.P.Robinson Back Gating K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Nástroje pro analýzu dat • Výrobci HW • Beckman Coulter • Kaluza • Becton Dickinson • FACSDiva • FACSSuite • FlowJo • BioRad • Sony • Milteney • … • Univerzální platformy • Komerční • FlowJo • FCS Express • … • Freeware • Flowing Software • Cyflogic • BioConductor - Flowcore Vizualizace dat a intepretace dat Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the Herzenberg LA, Tung J, Moore WA, Herzenberg LA, Parks DR (2006) Interpreting flow cytometry data: a guide for the Gating – technika datové redukce ◼ Flow stability gating — k zachycení událostí, jakmile se průtokový proud stabilizuje, eliminace účinků ucpání, protitlaku a dalších problémů s přístrojem. ◼ Pulse geometry gating — pro odebrání dubletů z datové sady. ◼ Forward and side scatter gating — k odstranění „debris“ a dalších nezajímavých událostí při zachování buněk na základě velikosti nebo složitosti. ◼ Subsetting gating — spoléhat se na vyjádření markerů a na to, co identifikují. Použití viability a dump kanálů se dále zužuje na buňky zájmu. To je místo, kde se kontroly fluorescence minus jedna (FMO) stávají kritickými při definování zájmových populací. ◼ Backgating — Zajistit vizualizaci buněk v závěrečném gatu na vyšší úrovni. Gating a kontrola kvality 1)Singlets 2)Time 3)viabilita http://expertcytometry.com/3-flow-cytometry-gates-that-will-improve-the- accuracy-of-your-facs-data-analysis/ http://expertcytometry.com/6-flow-cytometry- gating-tips-that-most-scientists-forget/ Gating a kontrola kvality https://www.flowjo.com/learn/flowjo-university/flowjo/tutorial/33 Scatter gating Subset gating http://expertcytometry.com/6-flow-cytometry-gating-tips-that-mostGating a kontrola nastavení FMO ~ Fluorescence Mines One Back gating Gating – příklad hodnocení Vícebarevné analýzy generují mnoho dat… 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 3 color 4 color 5 color Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ Log Fluorescence QUADSTATS LogFluorescence ++ -- +- -+ upraveno podle J.P.Robinson The Flow Cytometry: Critical Assessment of Population Identification Methods (FlowCAP) The goal of FlowCAP is to advance the development of computational methods for the identification of cell populations of interest in flow cytometry data. FlowCAP will provide the means to objectively test these methods, first by comparison to manual analysis by experts using common datasets, and second by prediction of a clinical/biological outcome. Další způsoby vizualizace vícerozměrných dat ◼ t-SNE, viSNE – t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding – viSNE is a tool for reducing high-parameter data down to two dimensions – visually identify interesting and rare biological subsets – allow to gate single cell events across different samples. ◼ SPADE – Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events – way to automatically identify populations in multidimensional flow cytometry data files – clusters cells into populations and then projects them into a tree ◼ https://docs.flowjo.com/flowjo/advanced-features/dimensionality-reduction/tsne/ Dimensions reduction AMID, Ehsan; WARMUTH, Manfred K. TriMap: Large-scale dimensionality reduction using triplets. arXiv preprint arXiv:1910.00204, 2019. Dimensions reduction „… to create a map.“ t-SNE t-Stochastic Neighborhood Embedding Opt-SNE/FIt-SNE Fast Fourier Transform-accelerated Interpolation-based t-SNE Local structure 10x faster than t-SNE UMAP Uniform Manifold Approximation and Projection Average in Local and Global structure Transition of cells EmbedSOM Efficiently embed FlowSOM maps into 2D Poor in Local and Global structure Fast algorithm TriMap Dimensionality reduction technique based on triplet constraints Excellent in Global structure Transition of cells Preprint Courtesy of B. Kvokačková, R. Fedr Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Emission Spectra–Spectral Overlap Kompenzace fluorescenčního signálu při vícebarevné detekci ◼ Proces při kterém dochází k eliminaci všech fluorescenčních signálů kromě signálu z fluorochromu který má být na příslušném detektoru detekován ◼ Nastavení pomocí mixu mikročástic či buněk označených/neoznačených příslušnými fluorochromy. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Choices for 6,- 8,- 10,- and more colors Fluorochrome selection considerations Various fluorochromes-stain index Kompenzace fluorescenčního signálu K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie FITC positive & negative PE negative beads #2 Kompenzace fluorescenčního signálu K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie FITC positive & negative PE negative beads NONE! Kompenzace fluorescenčního signálu Nastavení kompenzací parametr - detektor amp. FL1 - 544 FL2 - 434 kompenzace FL1 - 1.1%FL2 FL2 - 17.5%FL1 ▪ značené mikročástice – pro běžně konjugované fluorochromy ▪ značené buňky – pro vitální značení Which marker for compensation? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation. BD Comp Beads • Always positive • Bright staining • Save sample (HIV patients) • Use the same antibody for compensation and the real experiment BD Comp Beads Tandemové značky Tandemové značky Tandemové značky - příklad Tandems are light sensitive 0 hours 2 hours 22.5 hours PE (FL2) CD8 CD3 PE-Cy5PE-Cy7 Time Sample Left in Light https://www.bdbiosciences.com/en- us/resources/bd-spectrum-viewer Factors that Effect Compensation ◼ Reagent Lot-to-Lot Variation ◼ Fluorochrome Stability ◼ Sample-to-Sample Variation ◼ Assay Staining Conditions ◼ Jiné řešení? #1 Idea (1931) "Simplicissimus Karl Arnold Mobile Telephony" by Source (WP:NFCC#4). Licensed under Fair use via Wikipedia Invention (1973) Martin Cooper, Motorola Innovation (2007) Steve Jobs, Apple Spectral flow cytometry J.P. Robinson, Purdue University Spectral flow cytometry Conventional vs. spectral analysis http://www.sonybiotechnology.com/images/sp6 800/Fluorescent_Proteins_and_Fluorochromes. ◼ Jiné řešení? #2 Single Cell Mass Cytometry Cells were covalently labeled with a bifunctional compound, maleimido-mono-amide-DOTA (mDOTA). This compound can be loaded with a lanthanide(III) isotope ion, and reacts covalently with cellular thiol groups through the maleimide moiety. Single Cell Mass Cytometry Seven unique lanthanide isotopes were used to generate 128 combinations, enough to barcode each sample in a 96-well plate. The seven lanthanide isotopes, their masses and their locations on the 96well plate are shown. Single Cell Mass Cytometry Single Cell Mass Cytometry Kompenzace - literatura Mario Roederer - Compensation in Flow Cytometry Current Protocols in Cytometry (2002) 1.14.1-1.14.20 John Wiley & Sons, Inc. M. Loken, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1977). Two-color immunofluorescence using a fluorescence-activated cell sorter. J. Histochem. Cytochem. 25:899-907. M. Roederer & R. F. Murphy (1986). Cell-by-cell autofluorescence correction for low signal-to-noise systems: application to EGF endocytosis by 3T3 fibroblasts. Cytometry 7:558-565. S. Alberti, D. R. Parks, & L. A. Herzenberg (1987). A single laser method for subtraction of cell autofluorescence in flow cytometry. Cytometry 8:114-119. C. B. Bagwell & E. G. Adams (1993). Fluorescence spectral overlap compensation for any number of flow cytometry parameters. in: Annals of the New York Academy of Sciences, 677:167-184. Maciorowski, Z., Chattopadhyay, P.K., & Jain, P. (2017). Basic multicolor flow cytometry. Current Protocols in Immunology, 117, 5.4.1–5.4.38. doi: 10.1002/cpim.26 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie No Data Analysis Technique Can Make Good Data Out of Bad Data! Shapiro’s 7th Law of Flow Cytometry Shrnutí ◼ zpracování signálu ◼ vizualizace dat a „gating“ ◼ Kompenzace ◼ Spektrální a hmotnostní cytometrie Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. rozeznat jednotlivé způsoby vizualizace dat, 2. chápat základní principy „gatingu“, 3. znát princip kompenzace signálu při vícebarevné detekci, 4. Rozumět principům spektrální analýzy a hmotnostní cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie