Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Emission Spectra–Spectral Overlap Co je problém při vícebarevné detekci? K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kompenzace fluorescenčního signálu Which marker for compensation? Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C). Use bright markers to setup proper compensation. http://expertcytometry.com/6-flow-cytometry-gating-tips-that-most-scientists-forget/ Gating and checking settings FMO ~ Fluorescence Mines One Factors that Effect Compensation ◼ Reagent Lot-to-Lot Variation ◼ Fluorochrome Stability ◼ Sample-to-Sample Variation ◼ Assay Staining Conditions Spectral flow cytometry Conventional vs. spectral analysis Doporučení - kombinujte fluorochromy s odpovídající svítivostí a nízkým dopadem na rozlišení dalších barev - vyhněte se obtížně kombinovatelným fluorochromům - posouzení dopadu na biologické rozlišení: větší není vždy lepší - optimalizujte váš protocol: kontroly, kontroly, kontroly (zkratky nefungují) Aplikace průtokové cytometrie ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN buněčný cyklus a ploidyta analýza zlomů DNA inkorporace BrDU exprese cyklinů analýza denaturace DNA ANALÝZA BUNĚČNÉHO FENOTYPU imunofenotypizace pomocí CD antigenů (detekce diferenciačních a nádorových markerů) detekce cytokinových receptorů CYTOGENETIKA analýza chromozómů STUDIUM BUNĚČNÝCH FUNKCÍ viabilita stanovení intracelulárního pH analýza organel a cytoskeletu stanovení membránového potenciálu oxidativní vzplanutí stanovení intracelulárního Ca2+ stanovení intracelulárních cytokinů Natural Killer ligace značených buněk analýza reportérových genů K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Biologické aplikace průtokové cytometrie ◼ analýza proliferace ◼ fluorescenční proteiny K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Buněčný cyklus Co je důležité při přípravě vzorku a značení… ◼ Postup přípravy vzorku a značení nelze zobecnit – závisí na typu buněk a konkrétní analýze – suspenze jednotlivých buněk – vitální značení – fixace (etanol, formaldehyd) – permeabilizace (detergenty) – difúze – aktivní transport Analýza buněčného cyklu • jedna z nejstarších aplikací flow cytometrie, stanovení fáze buněčného cyklu podle množství DNA • průtoková cytometrie je vhodná metoda pro rychlou a přesnou determinaci buněčného cyklu • jednoduchým způsobem je DNA obarvena fluorescenční barvou specifickou pro DNA. • Propidium iodide 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) - dramaticky zvyšují fluorescenci po vazbě na DNA. Je nutná permeabilizace cytoplasmatické membrány . • Hoechst 33342 • Vybrant® DyeCycle™ • DRAQ5 • Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids (QBAs) I. Slaninova, J. Slanina and E. Taborska, "Quaternary benzo[c]phenanthridine alkaloids--novel cell permeant and red fluorescing DNA probes," Cytometry A, vol. 71, no. 9, pp. 700-708, 2007. - mohou být používány pro značení viabilních buněk. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie G2 M G0 G1 s 0 200 400 600 800 1000 G0G1 s G2M DNA Analysis DNA content C o u n t 2N 4N Normal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories - propidium iodide - DAPI - Hoechst 33342 - 7-AAD Analýza histogramu buněčného cyklu ◼ nepoužívá se běžná analýza pomocí úseček (regionů) v histogramu ◼ je nutné používat speciální software pro modelovaní analýzu distribuce jednotlivých fází Cell cycle histogram: gating strategy Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu File analyzed: SAMPLE2.FCS Date analyzed: 16-Oct-2006 Model: 2DA0n_DSD_ASD Analysis type: Automatic analysis Diploid: 57.22 % Dip G1: 70.35 % at 75.05 Dip G2: 5.60 % at 150.10 Dip S: 24.05 % G2/G1: 2.00 %CV: 3.02 Aneuploid 1: 42.78 % An1 G1: 83.63 % at 100.15 An1 G2: 5.87 % at 200.30 An1 S: 10.50 % G2/G1: 2.00 %CV: 5.02 DI: 1.33 Total Aneuploid S-Phase: 10.50 % Total S-Phase: 18.25 % Total B.A.D.: 11.22 % Debris: 19.13 % Aggregates: 3.96 % Modeled events: 31253 All cycle events: 24037 Cycle events per channel: 190 RCS: 0.842 Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S An1 G1 An1 G2 An1 S Aneuploidie je významný diagnostický marker Analýza ploidity u vyšších rostlin http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Nativ e_American_tobacco_flower.jpg Alstroemeria caryophyllaceaNicotiana tabacum http://en.wikipedia.org/wiki/I mage:Corntassel_7095.jpg Zea mays endosperm 28 dní po opylení Cell cycle analysis- limitations Analýza inkorporace BrdU K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ◼ bromodeoxyuridin se inkorporuje do DNA namísto tymidinu během S-fáze ◼ po fixaci a částečné denaturaci DNA je možné BrdU detekovat pomocí specifické protilátky značené fluorochromem ◼ v posledním kroku můžeme obarvit DNA Analýza inkorporace BrdU File: HL60 K/24h Region % Gated R1 100.00 R2 35.48 R3 10.25 R4 47.87 R5 1.32 R4 R2 R3 R5 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Click azide/alkyne reaction Aplikace Click-IT (Invitrogen) Multiplex imaging with Click-iT® RNA assays. NIH3T3 cells were incubated with 1 mM EU, formaldehyde-fixed, and permeabilized with Triton® X-100. EU incorporated into newly synthesized RNA (red) in some cells was detectied using the Click-iT® RNA Alexa Fluor® 594 Imaging Kit. Tubulin (green) was detected with anti-tubulin mouse IgG9 and visualized with Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG. Nuclei (blue) were stained with Hoechst 33342. Aplikace Click-IT (Invitrogen) analýza syntézy DNA (proliferace) Tritiated (3H) thymidine 3H-thymidine • Original method for measuring cell proliferation • Radioactive • Not compatible for multiplexed analyses 3H-thymidine BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) BrdU Br Br Br Br Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU Br Br Br Br BrdU • Non-radioactive • Multiplex compatible but, strand separation requirement for anti-BrdU access, can affect: • Ability for other antibodies to bind • Morphology • Ability for dyes that require dsDNA to bind efficiently, i.e., cell cycle dyes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) Click-iT™ EdU Click-iT™ EdU Click-iT™ Edu • Non-radioactive • No DNA denaturation required • Simplified protocol • Small molecule detection • Multiplex compatible, including • Other antibodies • Dyes for cell cycle analysis Analýza DNA a RNA Pyronin Y vs. Hoechst 33342 - Pyronin interaguje s ds RNA a DNA ale jeho vazba na DNA je inhibována přítomností Hoechst 33342 ◼ Acridine orange - při interakci s RNA emituje červené světlo a při interakci s DNA zelené Detekce intracelulárních proteinů v kombinaci s detekcí DNA Detekce mitotických buněk ◼ Histone H3 je specificky fosforylován během mitózy (Ser10, Ser28, Thr11) ◼ dvojité značení DNA vs. H3-P identifikuje populaci buněk v M-fázi Flow cytometry most common applications Viability assays (propidium iodid, Calcein AM, …) Proliferation (BrdU, EdU, mitosis - pH3) DNA damage ( yH2AX,…) Cell Death analysis (AnnexinV, Cleaved Caspase3, …) Cell Cycle (DNA content, Cell cycle modulation after treatment) Immunophenotype characterisation of the cells (CSCs markers, differentiation, …) IMMUNOPHENOTYPING Principle: cells are stained with monoclonal antibodies conjugated to various fluorescent dyes and analyzed with using flow cytometry Pros: simple, standard, broad spectrum of tested reagents, multiplexing Cons: not every epitope is fixable, compensation, possible artefacts from dying cells, dissociation of solid tissue may affect results Ermann, J. et al. (2015) Immune cell profiling to guide therapeutic decisions in rheumatic diseases Nat. Rev. Rheumatol. doi:10.1038/nrrheum.2015.71 VIABILITY using LIVE/DEAD fixable stains Principle: reaction of a fluorescent reactive dye with cellular amines, in necrotic cells react with free amines both in the interior and on the cell = intense staining, live cells stained on surface only = dim signal Pros: simple, wide spectrum of dyes, fixable, The ArC™ Amine Reactive Compensation Bead Kit Cons: live cells have signal, stain only in buffers w/o BSA or serum, Tris or azide Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Principle: DNA content measurement by fluorescent nucleic-acid-binding dyes Pros: simple, wide spectrum of dyes, in both native and fixed samples Cons: doublets > G2/M, single parameter≠ DNA synthesis, > CV if not fixed by organic solvents CELL CYCLE DNA SYNTHESIS using click azide/alkyne reaction Principle: direct measurement of DNA synthesis via visualization of incorporation of nucleoside analogue Pros: no DNA denaturation required, simplified protocol, small molecule detection, multiplex compatible Cons: high concentration of Cu in reaction = not compatible with all fluorochromes 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine alkyne azide triazol DNA DAMAGE using γH2A.X Principle: Phosphorylation of the Ser-139 residue of the histone variant H2A.X, forming γH2A.X, is an early cellular response to the induction of DNA doublestrand breaks Pros: in theory simple immuno-staining after fix&perm Cons: DSBs can also be intrinsic, occurring in healthy, nontreated cells, DSBs are formed in the course of DNA fragmentation in apoptotic cells Huang X, Darzynkiewicz Z: Cytometric Assessment of Histone H2AX Phosphorylation. In DNA Repair Protocols: Mammalian Systems. Edited by Henderson DS. Totowa, NJ: Humana Press; 2006: 73-80 CTRL GEM APOPTOSIS detected via PARP cleavage or caspase-3 activation Principle: Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody detects endogenous levels of the large fragment (17/19 kDa) of activated caspase-3. Cleaved PARP (Asp214) detects endogenous levels of the large fragment (89 kDa) PARP1 protein produced by caspase cleavage. Pros: simple immunostaining after fix&perm, validated antibodies available Cons: not every cell type or signal necessary activates cp-3 or leads to PARP cleavage, timing Untreated MG-132 Workflow Possible issues Need of optimization • Incompatibility of Fluorochrome with Click-iT reaction • Permeabilization • Over cross-linked • Insufficient/too high concentration • Sufficient permeability • Antibody/ marker selection • Compatibility with other fluorochromes • Sufficient permeability • Antibody specificity Permeabilization Goal: Sufficient for intracellular markers, gentle for surface markers DNA damage – yH2AXApoptosis - Cleaved Caspase 3 Surface marker – Trop-2 Trop-2 BV421 Trop-2 BV421 Trop-2 BV421 Trop-2 BV421 85,9 % 75,6 % 75,3 % 59,2 % 78,8 % 34,6 % 25,9 % 19,5 % 92,0 % 75,2 % 80, 8 % 83,8% The best solution: 0,25% Triton x-100 DMSO MG-132 MG-132 DMSO DMSO DNA stain ◼ Violet laser DAPI, Hoechst 33342 FxCycle Violet, … ◼ Blue laser Vybrant Dyes, PI, … ◼ Red laser FxCycle Far Red 7-AAD Broad spectrum of the dyes Problems: High concentration of dye, no wash Spillover & Compensations Compensation Antibody conjugates: • anti-rat and anti-hamster Igκ/negative control compensation beads (BD Biosciences), • SpheroTM Biotin Polystyrene Particles (Spherotech, Lake Forest, IL, USA) Live/Dead fixable dyes: • ArcTM Amine Reactive Compensation Bead Kit beads (Thermo Fisher Scientific) DNA stain: • fixed and permeabilized cells with/without appropriately diluted DNA probe Isotype controls were recorded for all samples. Gates were set according to isotype controls and control untreated cells (for γH2AX and cleaved caspase-3) Gating strategy included viability, discrimination of doublets (FSC-H vs. FSC-A) and debris (FSC vs. SSC). In samples with DNA marker, doublets we further discriminated using DNA marker (PO-PRO-1 A vs. PO-PRO-1 W) . In the process of protocol optimization, FMO controls were measured and revealed DNA dye spillover. Example of final set-up Parametr Marker Fluorochrome Cell Surface Marker CD44 APC/Cy7 Cell Surface Marker Trop-2 AF488 Viability LIVE/DEAD kit Yellow DNA synthesis Click-iT EdU AF647 Cell Cycle DNA content PO-PRO-1 DNA damage yH2AX PE Apoptosis Cleaved Caspase 3 AF494 Surface Markers DNA synthesis DNA damage Apoptosis Viability Cell Cycle Flow Cytometric Multiparametric Assay was established Examination of small subpopulation (Trop-2+) in response to experimental treatment Detekce počtu buněčného dělení The Nobel Prize in Chemistry 2008 ◼ "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/ Fluorescenční proteiny ◼ bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny ◼ Osamu Shimomura – 1961 objevil GFP a aequorin http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Science. 1994 Feb 11;263(5148): Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. Department of Biological Sciences, Columbia University, New York, NY 10027. ◼ A complementary DNA for the Aequorea victoria green fluorescent protein (GFP) produces a fluorescent product when expressed in prokaryotic (Escherichia coli) or eukaryotic (Caenorhabditis elegans) cells. Because exogenous substrates and cofactors are not required for this fluorescence, GFP expression can be used to monitor gene expression and protein localization in living organisms. Fluorescenční proteiny ◼ Douglas Prasher ◼ Martin Chalfie Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm in vivo molekulární vizualizace Hasegawa, S., Yang, M., Chishima, T., Miyagi, Y., Shimada, H., Moossa, A. R., and Hoffman, R. M. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Ther, 7: 1336-1340, 2000. KODAK X-SIGHT 640 LSS Dyes in vivo with x-ray overlay KODAK X-SIGHT 650 and 761 Nanospheres, KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System Fluorescenční proteiny ◼ Sergey A. Lukyanov – Objevil „GFP-like“ proteiny u nesvětélkujících korálů Roger Tsien ◼ ~ 2002 – mutace FP = barevné spektrum http://www.tsienlab.ucsd.edu/ Debris Aggregates Dip G1 Dip G2 Dip S Detekce buněk v synchronizovaném buněčném cyklu Licensing control by Cdt1 and geminin J Cell Sci 2012 125: 2436-2445; doi: 10.1242/jcs.100883 Fucci (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) cells Ubiquitin E3 ligase complexes G1 - APCCdh1 substrate: Geminin, inhibitor of DNA replication inhibits Cdt1 S, G2, M- SCFSkp2 substrate: DNA replication factor Cdt1 – key licensing factor Fucci sensors - 1st generation, coral FP monomeric Kusabira orange 2 – hCdt1 (30/120) Monomeric Azami-Green – hGeminin (1/110) Fucci sensors – 2nd generation, Aequorea FP red monomeric fluorescent protein - mCherry hCdt1 (30/120) yellowish green monomeric variant of GFP – mVenus – hGeminin (1/110) Fucci http://cfds.brain.riken.jp/Fucci.html CONTROL SCH900776 MU380VEHICLEGEMCITABINE …lot of questions, but how to answer them? ◼ How many times cells divided? ◼ What is a length of cell cycle phases? ◼ Is there a difference in time between first and second division? ◼ How it is all affected by my drugs? Branches (dvisions) analysis 02_02_01_01 Median 14 hours 02_02_01_01 Shrnutí přednášky ◼ Kompenzace ◼ Kontrola kvality, zásady ◼ analýza proliferace ◼ fluorescenční proteiny Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. Jaké jsou základní principy multispektrální a hmotnostní cytometrie 2. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 3. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 4. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 5. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 6. co je to click-IT. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie