Bi9393 Analytická cytometrie Oddělení cytokinetiky Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Vitální analýza buněčných funkcí ◼ Průtoková cytometrie umožňuje vícebarevnou vitální analýzu buněk – intracelulární koncentrace iontů, – pH, – produkce reaktivních skupin, – životnost Detekce viability ◼ jedna z nejjednodušších analýz ◼ funguje na principu: – detekce membránové integrity - neprůchodnosti některých fluorescenčních značek cytoplazmatickou membránou živých buněk – propidium iodide, ethidium bromide, 7-amino actinomycin D – detekce fyziologického stavu buněk – použití fluorescenčních značek barvících pouze živé buňky - Rhodamine-123, Calcein-AM ◼ ethidium monoazide – lze jím obarvit mrtvé buňky a následně fixovat ◼ Pomocí LDS-751 (laser dye styryl-751) je možné odlišit mrtvé buňky i po fixaci ◼ LIVE/DEAD® Fixable Dead Cell Stain Kits Detekce viability VIABILITY using LIVE/DEAD fixable stains Principle: reaction of a fluorescent reactive dye with cellular amines, in necrotic cells react with free amines both in the interior and on the cell = intense staining, live cells stained on surface only = dim signal Pros: simple, wide spectrum of dyes, fixable, The ArC™ Amine Reactive Compensation Bead Kit Cons: live cells have signal, stain only in buffers w/o BSA or serum, Tris or azide Přenos signálu pomocí Ca2+ •Cytosol (koncentrace - „klidová“ 100 nM vs. 1-10 mM aktivovaná) •[Ca2+]c aktivuje proteinkinázu C •interaguje s „Ca2+ - binding proteins“ Alberts, B. et.al. Essential Cell Biology, 1998 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Ca 2+ influx - Fura-2 - Fluo-3 - Indo-1 K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie ionophor ionophor Zajištění vhodných podmínek pro detekci [Ca2+]i •standardizace barvení a kalibrace - zlepšení rozpustnosti AM estery modifikovaných indikátorů (BSA, Pluronic ® -127) - inhibice aktivního vylučování indikátoru buňkou (Probecid) - pro kalibraci vhodné AM estery modifikované chelátory (BAPTA-AM) •temperace vzorku po celou dobu měření •standardizace způsobu přidávání induktoru K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Burns, J. M. et.al. (1997). "Improved measurement of calcium mobilization by flow cytometry." Biotechniques 23(6): 1022-4, 1026. http://www.cytekdev.com K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Kalibrace (pro jednu vlnovou délku)   ( ) ( ) Ca K x F -F F -F 2 d min max + = R1 Fluo-3 (Kd ~ 400nM, 22°C; 864 nM, 37°C) Fmin = 1.25 x FMnCl2 - 0.25 x Fmax K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Detekce intracelulárního pH ◼ Fluorescenční značky měnící intenzitu fluorescence v závislosti na pH ◼ SNARF-1, BCECF Detekce intracelulárního pH ◼ Nutná kalibrace pomocí draslíkových pufrů a ionoforu (nigericin) Detekce reaktivních kyslíkových skupin ◼ Reaktivní kyslíkové skupiny hrají klíčovou roli v celé řadě biologických procesů – posttranslační modifikace proteinů – regulace transkripce – regulace struktury chromatinu – přenos signálu – funkce imunitního systému – fyzický a metabolický stres – neurodegenerace, stárnutí O2• –O2 H2O2 • OH H2O 4 e– reduction to water e– e– e– e– Not so terribly reactive with most biomolecules Maintained at very low concentration Catalases, peroxidases, GSH, etc… Actually a chemical reductant Not so terribly reactive with most biomolecules Mitochondrial superoxide the major source of active oxygen Maintained at very low concentration Superoxide dismutases Reacts with virtually any molecule at diffusion-limited rates The molecule that makes ionizing radiation toxic Unreactive at STP, but a great electron acceptor Biological activation via radicals, transition metals Generally, radical intermediates are enzyme- bound © Simon Melov Potential sites of intervention Oxidative Stress Neurodegeneration Cancer Vascular Tone Cardiac Output Sensory Acuity Skin Thickness Bone Density Endocrine Function Immune Function DNA Damage Oncogenesis Mitochondrial Damage Energy Crisis Cell Death © Simon Melov Hydroethidine HE EB N CH2CH3 NH2H2N H Br- N CH2CH3 NH2H2N + O2 Phagocytic Vacuole SOD H2O2 NADPH NADP O2 NADPH Oxidase OH- O2 - DCF HE O2 - H2O2 DCF Example: Neutrophil Oxidative Burst © J. P. Robinson, Purdue University DCFH-DA DCFH DCF COOH H Cl O O-C-CH3 O CH3-C-O Cl O COOH H Cl OHHO Cl O COOH H Cl OHO Cl O Fluorescent Hydrolysis Oxidation 2’,7’-dichlorofluorescin 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate 2’,7’-dichlorofluorescein Cellular Esterases H2O2 DCFH-DA DCFH-DA DCFH DCF H O2 2 Lymphocytes Monocytes Neutrophils log FITC Fluorescence . 1 1000100101 0 20 40 60 counts PMA-stimulated PMNControl 80 © J. P. Robinson, Purdue University Key Name K/72h+PMA ATRA/72h+PMA DMSO/72h+PMA NaBT/72h+PMA vit. D3/72h+PMA (A) (B) (C) - DCFH-DA - DHR-123 - HE Oxidative Burst K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Fluorescenční proteiny ◼ bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Aequorea victoria - medúza žijící ve vodách na pobřeží Severní Ameriky. – je schopna modře světélkovat (bioluminescence). Ca2+ interaguje s fotoproteinem aequorinem. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis – korál žijící ve vodách na severním pobřeží Floridy. – luminescence vzniká degradací coelenterazinu za katalytického působení luciferázy. – modré světlo excituje green fluorescent protein. Renilla reniformis "Sea Pansy" http://www.mbayaq.org/efc/living_species/default.asp?hOri=1&inhab=440 Aequorea victoria “Crystal jelly “ http://www.whitney.ufl.edu/species/seapansy.htm Fluorescenční proteiny http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP2.htm Fluorescent sensors for detection of H2O2 Variants & fusions ◼ pHyPer-cyto vector ◼ pHyPer-dMito vector – Duplicated mitochondrial targeting sequence (MTS) is fused to the HyPer N-terminus. MTS was derived from the subunit VIII of human cytochrome C oxidase [Rizzuto et al., 1989; Rizzuto et al., 1995]. ◼ pHyPer-nuc vector – Three copies of the nuclear localization signal (NLS) fused to the HyPer C-terminus provide for efficient translocation of HyPer to the nuclei of mammalian cells [Fischer-Fantuzzi and Vesco, 1988] Analýza a sortrování chromozómů Analýza a sortrování chromozómů ◼ synchronizace buněk – zisk metafázních chromozómů (colcemid, hydroxyurea) ◼ izolace chromozómů ◼ značení DAPI nebo Hoechst vs. chromomycin A3 (CA3) nebo mithramycin = celková DNA vs. G/C-bohaté oblasti http://www.scienceclarified.com/Ca-Ch/Chromosome.html http://www.nccr-oncology.ch/scripts/page9243.html Analýza a sortrování chromozómů „Flow karyotype“ http://www.sanger.ac.uk/HGP/Cytogenetics/ ♂ ♀ Karcinom močového měchýře Sortrování chromozómů Pisum sativum Sortrování chromozómů Vicia faba Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ ekologie ◼ potravinářství http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/ Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ viabilita ◼ metabolické funkce ◼ sortrování ◼ analýza aerosolů (Fluorescence Aerodynamic Particle Sizer (Flaps)) Aplikace průtokové cytometrie v mikrobiologii ◼ Sortrování – EPICS + Autoclone® modul Průtoková cytometrie kvasinek ◼ buněčné dělení ◼ viabilita ◼ membránový potenciál ◼ respirace ◼ produkce H2O2 ◼ citlivost k antibiotikům ◼ separace Saccharomyces cerevisiae http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Budding_yeast_Lifecycle.png http://www.sbs.utexas.edu/mycology/sza_images_SEM.htm Průtoková cytometrie kvasinek Průtoková cytometrie v hydrobiologii ◼ studium pico- a nanofytoplanktonu (< 20 mM) ◼ analýza metabolických funkcí planktonu ◼ studium pigmentace (analýza chlorofylu a fykoeritrinu) Průtoková cytometrie v hydrobiologii Průtoková cytometrie v hydrobiologii ◼ analýza DNA http://planktonnet.awi.de/portal.php?pagetitle=assetfactsheet&asset_id=15127 http://www.soes.soton.ac.uk/staff/tt/ Průtoková cytometrie v hydrobiologii http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/research/micrflow/sieracki/sierack2.htm http://omlc.ogi.edu/spectra/PhotochemCAD/html/chl orophyll-a(MeOH).html Průtoková cytometrie bezobratlých ◼ lze aplikovat běžné metodické přístupy a fluorescenční značky ◼ Příklady aplikací: – buněčný cyklus – cytotoxicita – apoptóza Invertebrate Survival Journal http://www.icms.qmul.ac.uk/flowcytometry/uses/insects/index.html Figure 5. Representative flow-cytometry scatter plot of hemocytes from 25 oysters. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 Figure 6. Proposed model for hemocyte maturation, as seen by flow cytometry. Rebelo MdF, Figueiredo EdS, Mariante RM, Nóbrega A, et al. (2013) New Insights from the Oyster Crassostrea rhizophorae on Bivalve Circulating Hemocytes. PLoS ONE 8(2): e57384. doi:10.1371/journal.pone.0057384 http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0057384 https://www.union bio.com/copas/ Suraj Kannan. Circulation Research. Large Particle FluorescenceActivated Cell Sorting Enables High-Quality Single-Cell RNA Sequencing and Functional Analysis of Adult Cardiomyocytes, Volume: 125, Issue: 5, Pages: 567-569, DOI: (10.1161/CIRCRESAHA.119.315493) © 2019 American Heart Association, Inc. „High Throughput Flow Cytometry“ ◼ automatizace + robotizace = urychlení a efektivita sběru dat (měření desítky vzorků za hodinu s minimálním zásahem operátora ) ◼ využití principu vícebarevné analýzy K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Automatizované systémy měření vzorků Automatický karusel (autosampler) Adaptér pro nasávání vzorků z mikrotitrační desky Automatizovaný „microsampler“ systém K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie https://www.youtube.com/watch?v=L1UgdoP2aeg https://www.youtube.com/watch?v=7MFmbtIb8xA https://www.synbiobeta.com/read/one-lab-in-germany-is-using-robots- to-advance-computer-aided-synthetic-biology https://www.youtube.com/watch?v=ERDtmYddNkQ Incorporating Automation into a Flow Cytometry Workflow for Antibody Discovery The steps in a high-throughput fluorescence-microscopy experiment. Analysis http://www.stanford.edu/group/nolan/ Garry Nolan Peter Krutzik „Fluorescent cell barcoding“ Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Krutzik PO, Nolan Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 2006 May;3(5):361-8. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie Get the best out of your model FACS-based surface screen: • validated antibodies in 96w plates • several comercially available possibilities, we have gone for… - LEGENDScreen HUMAN 332 PE conjugated antibodies + ISOs - LEGENDScreen MOUSE 252 PE conjugated antibodies + ISOs - there are XY vials in LN - price of kit ≈ 1000 € (27k Kc) How to get the best of it all? Final workflow The optimal concentation issue HOW TO TEST IT: 10x serial dilution REQUIREMENTS: ◼ optimal resolution ◼ compatibility w/ PE Sample results EpCAM - marker of epithelial cells - commonly lost during EMT Sample result Cytometric bead array (CBA) ◼ Multiplexed Bead-Based Immunoassays ◼ flow cytometry application that allows users to quantify multiple proteins simultaneously Multiplex microsphere‐based flow cytometric platforms for protein analysis and their application in clinical proteomics – from assays to results ELECTROPHORESIS Volume 30, Issue 23, pages 4008-4019, 3 DEC 2009 DOI: 10.1002/elps.200900211 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.200900211/full#fig1 CBA CBA ◼ multiplexing capabilities ◼ speed ◼ incorporation of multiple assay formats ◼ rapid assay development and reasonable cost ◼ automation ex vivo flow cytometrie - limitace ◼ Ovlivnění některých vlastností buněk (morfologie, exprese znaků); ◼ neumožnuje dlouhodobější studie buněčného metabolismu a buněčných interakcí (komunikace, adheze) v přirozeném tkáňovém mikroprostředí; ◼ další: – nízká citlivost pro detekci vzácných buněčných subpopulací (1-10 buněk/ml ~ 5000 – 50000 buněk v 5 litrech krve dospělého člověka); – časově náročná příprava vzorku (hodiny, dny); – diskontinuita odebíraných vzorků. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – základní principy ◼ Zobrazení buněk přímo v krevním nebo lymfatickém řečišti. ◼ Vizualizace pomocí CCD nebo CMOS kamery po ozáření konvenční mikroskopickou lampou nebo lasery. ◼ Detekce absorbce, fluorescence, Ramanova spektra, fototermálních nebo fotoakustických signálů. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry – bez značení ◼ Nahrávka videa pomocí vysokorychlostní CCD nebo CMOS kamery s vysokým rozlišením v režimu propustnosti nebo odrazu. ◼ Příklad: high-speed transmittance digital microscopy (TDM) ◼ Limity: hloubka tkáně. ◼ TDM může sloužit k navedení zdrojů záření pro další analýzu do určené oblasti. Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 photoacoustic and photothermal imaging ◼ The photoacoustic effect was first discovered by Alexander Graham Bell in his search for a means of wireless communication.1 Bell succeeded in transmitting sound with an invention he called the “photophone,” which carried a vocal signal with a beam of sunlight that was reflected by a vocally modulated mirror. The sound could be recovered with an ordinary telephone receiver connected to a selenium cell illuminated by the light. Bell published the results in a presentation to the American Association for the Advancement of Science in 1880. The Photoacoustic Effect Benjamin T. Spike Physics 325 April 21, 2006 Schematic illustration of photoacoustic imaging Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 ACS Nano 2010 4 (8), 4559-4564 In vivo flow cytometrie – detekce specifických signálů ◼ Detekce fotoakustických a fototermálních jevů Cytometry part A 79A: 737-745, 2011 in vivo flow cytometry - aplikace Shrnutí přednášky ◼ Příklady funkčních analýz ◼ „High-throughput“ průtoková cytometrie … ◼ … a uplatnění vícebarevné detekce a beads array ◼ sortrování chromozómů ◼ aplikace v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých ◼ in vivo průtoková cytometrie Na konci dnešní přednášky byste měli: 1. vědět jakým způsoben je možné analyzovat buněčný cyklus. 2. umět navrhnout další parametr kombinovatelný s DNA analýzou. 3. znát příklady buněčných funkcí které je možné analyzovat na průtokovém cytometru. 4. vědět co jsou to fluorescenční proteiny a jaké jsou výhody jejich využití v buněčné biologii. 5. vědět co je to „high-throughput„ průtoká cytometrie …a jak se v ní může uplatnit princip vícebarevného značení. 6. znát základní principy měření a sortrování chromozómů pomocí průtokového cytometru; 7. mít představu o možných aplikacích průtokové cytometrie v mikrobiologii, hydrobiologii a studiu bezobratlých; 8. rozumět limitům a principům in vivo průtokové cytometrie. K. Souček Bi9393 Analytická cytometrie