1/2
Jméno:
Fluorescenční metody ve vědách o
životě - cvičení
Fluorescence Lifetime - FRET praktická ukázka na hybridizaci DNA
Jednořetězcová DNA (single-strand) o velikosti 40bp je modifikována fluorescenční značkou Alexa
Fluor 594 (akceptor) na svém 5‘ konci a fluorescenční značkou Fluorescein (donor) na svém 3‘ konci.
Samotné jednořetězcové vlákno je značně flexibilní, díky čemuž se jednotlivé fluorescenční značky
přiblíží k sobě natolik, aby nastal jev FRET (Försterův rezonanční přenos energie). Po přidání
neznačeného komplementárního vlákna dochází k hybridizaci a vzniklá dvořetězcová DNA ztratí míru
flexibility a nabyde prostorového uspořádání, kde se dva fluorofory od sebe vzdálí natolik, že pozorujeme
vymizení FRET signálu.
Demonstraci budeme měřit pomocí fluorescenčních spekter daných fluoroforů a také komplementárně
pomocí Fluorescence Lifetime, kde budeme pozorovat zvýšení času dohasínání donoru.
Materiál
• Značená jednořetězcová DNA (AF594 a FITC) o zásobní koncentraci 10 µM
• Komplementární řetězec DNA o zásobní koncentraci 10 µM
• Fosfátový pufr – 50 mM NaPi, 50 mM NaCl, pH 7
• 100x ředěný roztok Ludox (koloidní silice)
Obrázek 1: Excitační a emisní spektrum fluoroforů Fluorescein (FITC) a Alexa Fluor 594.
2/2
Vytvoření standardní křivky
1. Zapnout přístroj Fluoromax 4.
2. Zapnout měřící přístroj DeltaHUB a NanoLED (nechat klíček v poloze StandBy).
3. Zapnout PC.
4. Spustit program FluorEssence a inicializovat přístroj (ikona M).
5. Spustit program FluoroMax4-USBLamp a vypnout lampu přístroje.
6. Napipetovat 1,4 ml 1x zředěného roztoku Ludox do optické kyvety a umístit do měřící cely.
7. Naředit fluorescenčně značené DNA vlákno na finální koncentraci 100 nM o objemu 1,5 ml.
8. Spustit program DataStation, vybrat konfiguraci Fluoromax_PLUS_C, vybrat Emission 1 jako
emisní monochromátor a S jako detektor. Zakliknout „Use NanoLED Sample Chamber…“
9. Vybrat měřící metodu Lifetime.
10. Otočit klíčkem na NanoLED přístroji do pozice ON.
11. Nastavit S detector na 950 V, Cout rate na 5000, emisní vlnovou délku na 456 nm a šířku štěrbiny
8 nm.
12. Zkontrolovat, že je krycí destička před zdrojem fluorescence přístroje (škvíra více vzadu), a ne před
zdrojem Lifetime (škvíra blíže).
13. Označit Prompt signál a spustit měření pro získání IRC signálu.
14. Napipetovat 1,4 ml zředěné fluorescenčně značené DNA do kyvety a vložit do přístroje.
15. Změnit emisní vlnovou délku na 515 nm (maximální emise donorového fluoroforu), ponechat šířku
štěrbiny na 8 nm.
16. Přejmenovat signál Decay na ssDNA a spustit měření. (Zde sběr dat bude trvat podstatně déle než
v případě měření IRC signálu. Dáno koncentrací a svítivosti fluoroforu.)
17. Přejít do programu FluorEsscence, opět zapnout lampu přístroje a vyndat krycí destičku před
zdrojem fluorescence přístroje. Vybrat měření emisního spektra s nastavením: excitace při
490 nm (maximální excitace donorového fluoroforu), měření rozsah emise 495 - 750 nm. Štěrbiny
ponecháme na hodnotě 5 nm. Detektor nastavíme na měření S1/R1 signálu. Změřit dané spektrum.
18. Přidat 20 µl komplementárního řetězce DNA do kyvety a řádně promíchat. Inkubace 5 min při RT.
19. Vypnout lampu přístroje, vložit krycí destičku před zdroje fluorescence přístroje, zkontrolovat
předchozí identické nastavení pro měření Lifetime. Přidat nový signál Decay a přejmenovat jej na
dsDNA a spustit měření. Uložit data.
20. Opět přejít do programu FluorEssence a dle identického nastavení v předchozím kroku změřit
emisní spektrum.
21. Pomocí softwaru DAS6 analysis vyhodnotit lifetime data a porovnat změnu.
22. Porovnat změnu emisních spekter před a po hybridizaci DNA.
23. Diskuze výsledků.