1/5
Jméno:
Fluorescenční metody ve vědách
o životě - cvičení
Co nám v té buňce svítí – Fluorescenční mikroskopie
Teoretický úvod:
Fluorescence
Fluorescence je jev, při kterém molekula vyzáří/přijme světlo. Tento jev je spojen se změnou energie
elektronů/protonů v molekule. …………… je po absorbování energie vybuzen do excitovaného stavu a
po určité době (~10-9 s) se vrací do základního stavu za rychlého uvolnění energie ve formě vyzářeného
fotonu. Tento proces je zobrazen na Jablonského diagramu (Obr.1)
Obrázek 1: Jablonského diagram zobrazující základní stav (S0) a excitovaný stav (S1) elektronu
v molekule a jejich přechody. Červená čára znázorňuje absorpci, která vybudí elektron do
excitovaného stavu a zelená odpovídá přechodu elektronu do základního stavu za současného
vyzáření fotonu.
Úkol 1: Popište čemu odpovídá modrá šipka (Vibrace)
Absorpce (přijetí energie a vybuzení elektronu) se může nazývat také …………… a fluorescence
(uvolnění energie a vyzáření fotonu) se může nazývat Emise. Při bližším pohledu na Jablonského
diagram zjistíme, že energie emitovaného záření je nižší než absorbovaného. Existuje závislost mezi
energií fotonu a vlnovou délkou fotonu.
Úkol 2: Spojte pojmy, které jsou ekvivalentní.
Delší vlnová délka
Kratší vlnová délka
Vyšší energie
Nižší energie
2/5
Fenomenon posunu vlnové délky záření poprvé pozoroval Sir Stokes v roce 1852. Tento posun vlnové
délky byl nazván Stokesův posun (Obr.2).
Obrázek 2: Stokesův posun zobrazující excitační a emisní spektrum a jeho stokesův posun.
Fluorescenční mikroskop
Fluorescenční mikroskop je světelný mikroskop umožňující detekci a pozorování fluoreskujících látek
ve vzorku. Nejčastěji využívaný je tzv. …………………… mikroskop. V tomto uspořádání excitační
světlo prochází objektivem, dopadá na preparát a emisní světlo se vrací zpět do objektivu. Využívá
se proto zvláštní typ zrcadla nazvaný ………………… …………………, které odráží excitační světlo na
preparát do objektivu a propouští emisní světlo do okuláru. Propouštění a odrážení světla je závislé na
vlnové délce světla (Obr.3A).
Dalšími nutnými komponenty fluorescenčního mikroskopu jsou excitační filtr, který dokáže filtrovat
(vybrat) vhodnou část spektra ze světelného zdroje a emisní filtr (bariérový), který přesně vybere oblast
spektra vzniklé fluorescence (Obr.3B).
Obrázek 3: Schéma epifluorescenčního mikroskopu (A) a detail propustnosti filtrů pro selekci
světla (B).
3/5
Kombinace dichroického zrcátka a obou filtrů pro specifický fluorofor se do mikroskopu vkládá v celku
jako tzv. …………………, jejíž dvě strany jsou tvořeny filtry a úhlopříčka je tvořena dichroickým zrcátkem.
Úkol 3: Nakreslete dichroické zrcátko a stručně popište jeho funkci.
Konfokální mikroskop
Podstata konfokálního mikroskopu je do značné míry založena na zmíněné fluorescenční mikroskopii.
Základním prvkem každého konfokálního mikroskopu je tzv. konfokální štěrbina, běžně nazývaná jako
…………………. Tímto přístupem je mikroskop schopen eliminovat veškeré záření, které nevzniklo
přesně v rovině zaostření (Obr. 4). Kvůli odfiltrování značného množství světla je nutné použít
…………………, jakožto intenzivní excitační zdroj. Následně obraz vzniká postupným skenováním
zorného pole, čímž je zisk výsledného obrazu oproti klasické fluorescenční mikroskopii
rychlejší/pomalejší. Detektor v konfokálním mikroskopu zaujímá …………….., který je schopen detekovat
jednotlivé fotony s extrémní přesností. Díky skenování obrazu a eliminaci záření vzniklé mimo rovinu
ostrosti je/není konfokální mikroskop ideálním přístrojem pro sběr objemových dat (Z-stack).
Obrázek 4: Schéma konfokálního mikroskopu
Lidské buněčné linie a značení buněk
Experimenty přímo s lidskými buňkami nám dávají nejlepší představu co přesně se v našem těle děje.
Samozřejmě není možné dělat experimenty přímo na lidech. Místo toho se používají speciálně upravené
linie, které dokážou růst v laboratorních podmínkách. Nejčastěji se používají lidské buňky linie HEK293T
(Human Embryonic Kidney Cells). Jedná se o linii originálně odvozenou z lidských embryonických buněk
ledvin/jater.
V našem experimentu ale budeme pozorovat lidskou linii ……………………, jsou to buňky odvozené od
maligního nádoru glioblastomu (mozku). Tyto buňky jsou vhodnější pro demonstraci
imunofluorescence, jelikož lépe drží přisedlé na sklíčku a lépe se s nimi manipuluje.
4/5
Specifické části v buňkách nejsou detekovatelné pouhým světelným mikroskopem, proto musíme využít
fluorescence. Bohužel proteiny nefluoreskují sami od sebe, proto je potřeba je něčím selektivně označit.
Proteiny zájmu budou označeny pomocí specifických ……………………. (primárních) a na ně se bude
v druhém kroku vázat sekundární ……………………. Sekundární ……………………. na sobě nesou
fluorescenční barvičku zvanou Alexa Fluor 488 (Obr.5).
Obrázek 5: Excitační a emisí spektrum barvičky Alexa Fluor 488 a její atomární struktura.
Úkol 4: Zkuste ze spekter odhadnout hodnoty vlnové délky, při které bude excitace a emise maximální.
Praktická část:
Manipulace se sklíčkem s buňkami
Buňky rostou na krycím sklíčku v 24 jamkové destičce při 37°C. Buňky na sklíčku nesmějí dlouho zůstat
suché a zároveň je potřeba hlídat si stranu, na které buňky rostly.
1. Odeberte DMEM medium z buněčné kultury.
2. Promyjte U251 buňky pomocí pufru PBS.
3. Přesuňte buňky do větší promývací destičky.
4. Připravte si kousek parafilmu do tmavé komůrky.
5. Naneste kapku naředěných protilátek na parafilm a opatrně na ni přiložte sklíčko buňkami dolů.
6. Přeneste sklíčko zpět do promývací destičky.
Využití mikroskopu pro pozorování pylu a konvalinky
Pro první seznámení s mikroskopem se podíváme na fluorescenci řezu konvalinkou. Nejdříve zapněte
externí fluorescenční lampu a poté samotný mikroskop.
Úkol 5: Nakreslete kousek konvalinky, kterou pozorujete v mikroskopu.
5/5
Využití mikroskopu pro pozorování jádra a α-tubulinu v U251 buňkách
Pro zobrazení jader, která jsou označená barvičkou fluorescenční barvičkou DAPI (4',6-diamidin-2fenylindol).
Barvička DAPI je schopná procházet buněčnou membránou a pevně se váže na AT bohaté
oblasti v DNA. Po vazbě DAPI na DNA se až 20× zesiluje intenzita fluorescence, protože nedochází
ke zhášení fluorescence molekulami vody v roztoku. Excitační maximum DAPI je 358 nm (ultrafialové
světlo) a emisní maximum je 461 nm.
α-tubulin společně s β-tubulinem tvoří dimerní protein tubulin, který je základním stavebním kamenem
mikrotubulů. Mikrotubuly jsou důležitou součástí ……………………. eukaryotických buněk. Tubulin
hraje zásadní roli při dělení/smrti buněk.
1. Epifluorescenční mikroskop
Pro pozorování buněk budeme využívat objektivy se zvětšením 16x a 40x oba tyto objektivy potřebují
ke svému správnému fungování imerzní olej, který omezí rušivé odrazy na krycím sklíčku i na povrchu
objektivu, takže se zvýší i kontrast zobrazení.
2. Konfokální laserově-skenovací mikroskop
Zde využijeme objektiv se zvětšením 63x, který také vyžaduje pro správnou funkci imerzní olej.
Nastavíme dva kanály pro snímání obrazu. Jeden pro značku DAPI, kde zvolíme excitační laser 405 nm
a druhý pro značku AF488, kde zvolíme laser 488 nm. Poté nastavíme vhodně rozsah emisních filtrů.
Budeme snímat objemová data, tzv. Z-stack pro získání 3D obrazu. Následně si ukážeme výsledek a
rozdíl oproti klasické epifluorescenční mikroskopii a využití dekonvoluce.
Úkol 6: Jakou barvou je DAPI zobrazováno v mikroskopu a jakou barvou je AF488 zobrazováno
v mikroskopu? Jak vypadají struktury, které jsou nabarveny?
Závěr:
Úkol 7: Napište svými slovy, co je to fluorescence? Jaké jsou hlavní rozdíly mezi epifluorescenčním a
konfokálním skenovacím mikroskopem? K čemu se používá barvička DAPI? Co je to konfokální
štěrbina?