Vlastní fluorescence proteinů
Vlastní fluorescenci proteinů je způsobena aromatickými aminokyselinami vnich
obsaženými: tryptofanem (Trp), tyrozinem (Tyr) a fenylalaninem (Phe). Dominující je
fluorescence tryptofanu, naopak prakticky vůbec se neuplatňuje fenylalanin. V této úloze
jsou změřena fluorescenční excitační a emisní spektra albuminu a čistého tryptofanu a
tyrozinu.
Vlastnosti L-tryptofanu
• MW = 204.23, ε (Trp) = 5690 M-1
cm-1
• absorpční maximum: λexmax = 295 nm
• fluorescenční emisní maximum: λemmax = 353 nm
• emise Trp je vysoce závislá na polaritě a okolním prostředí
Vlastnosti L-tyrozinu
• MW = 181.19; ε (Tyr) = 1280 M-1
cm-1
• absorpční maximum: λexmax = 275 nm
• fluorescenční emisní maximum: λemmax = 304 nm
• emise Tyr je relativně málo citlivá na polaritu rozpouštědla
Fluorescence proteinů je obvykle excitována při 280 nm nebo při delších vlnových
délkách, takže fenylalanin není ve většině experimentů excitován. Navíc je kvantový
výtěžek fluorescence Phe velmi malý (kolem 0,02). Tryptofanovou fluorescenci
v proteinech lze selektivně excitovat při 295-305 nm.
Materiál
• L-tryptofan (Applichem), L-tyrozin (Applichem)
• Hovězí sérový albumin (BSA, MW = 67000), ε (BSA) = 49915 M-1
cm-1
• pufr A (50 mM NaCl, 50 mM Na-fosfát, pH 7,0)
Postup
1. Připravte roztoky Trp, Tyr a BSA nařeďte pufrem A pomocí tabulky:
zásobní
koncentrace
1. ředění
(do 1000 μl)
1. počet ředění
(např. 1000x)
2. ředění
(do 1500 μl)
2. počet
ředění
Trp 10 mM 20 μM 50 nM
Tyr 2 mM 10 μM 1000 nM
BSA 0.3 mM 3 μM 150 nM
2. Změřte excitační a emisní spektra vzorků za podmínek uvedených v tabulce.
excitační spektrum emisní spektrum
λex (nm) λem (nm) λex (nm) λem (nm)
L-tryptofan 240-300 350 280 290-420
L-tyrozin 240-290 300 270 280-420
BSA 240-320 350 275,292 300-420
Výsledky
Určete, jaká část fluorescence BSA je způsobena tryptofanem a jaká tyrozinem za použití
diferenčního spektra.