C7250 Charakterizace proteinů
hmotnostní spektrometrií
Příprava vzorku pro MS analýzu
Gabriela Lochmanová, Ph.D.
Proteomický experiment
buňky,tkáň Separace proteinů
proteolytické
štěpení
m/z
izolovaný protein
MS
Separace peptidů
Bottom-up
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu2
Faktory ovlivňující výsledek MS
Kvalita
a reprodukovatelnost
přípravy vzorku Instrumentace
Vyhodnocení dat
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu3
Rozmanitost vzorku
Protein extraction = “more of an art than a science”
Obecné principy izolace:
• Rozrušení buněk – lyzační pufry, mechanicky
• Další postup dle povahy cílového proteinu:
- srážení (např. aceton, TCA)
- změna pH
- změna koncentrace soli, imunoprecipitace…
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu4
Mechanické přístupy rozbití membrán
Přístup Nástroj /Pomůcka/Přístroj Princip
Mechanický mixér Rozmělnění buněk/tkáně
Homogenizace v roztoku
Homogenizátory
(Dounce Homogenizer, PotterElvehjem
Homogenizer)
French Press
Buněčná či tkáňová suspenze
protlačena úzkým otvorem
Sonikace Ultrazvukový homogenizátor
Rozbití buněk pomocí ultrazvukových
vln
Zmražení/rozmražení Mrazák či suchý led s EtOH
Buňky jsou rozbity ledovými krystaly
vznikajícími opakovanými cykly
zmražování a rozmražování
Manuální rozmělnění Miska a tlouček
Rozmělnění rostlinné tkáně v tekutém
dusíku
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu5
Ultrasonikační sonda Bioruptor
• Jemnější a jednodušší přístup v porovnání s mechanickým rozbitím buněčných membrán (může být i v kombinaci s
homogenizací či mechanickým rozmělněním)
zpravidla jemnější
s nižšími denaturačními
účinky
Rozbití membrán pomocí lyzačních roztoků
Volba lyzačního roztoku s ohledem na kompatibilitu s následným zpracováním vzorku
a jeho analýzou
• Rozrušení lipidové vrstvy solubilizací proteinů a narušením interakcí lipid:lipid, protein:lipid a protein:protein
• Složení lyzačního roztoku:
detergent + pufr + další reagencie (specifické dle typu vzorku: chaotropní činidla, soli, inhibitory proteáz
a enzymů odstraňujících modifikace, redukční činidla…)
Detergenty
– ionogenní (kationtové/aniontové) – silné solubilizační a denaturační účinky
– zwitteriontové
– neiontové
• Vliv teploty
CHAPS
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate
Nonidet P-40
SDS
Sodium Dodecyl Sulfate
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu6
Příklady inhibitorů proteáz
phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF):
inhibitor serinových i cysteinových proteáz
kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA):
inhibitor metaloproteáz
Aprotinin:
inhibitor serinových proteáz
komplex disociuje při pH >10 nebo <3.2
Leupeptin:
inhibitor serinových a cysteinových proteáz
Pepstatin A:
inhibitor kyselých proteáz
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu7
Příklady inhibitorů fosfatáz
fluorid sodný (NaF):
inhibitor serinových i treoninových fosfatáz
vanadičnan sodný (Na3VO4):
inhibitor tyrosinových fosfatáz
!nutná aktivace, tj. depolymerace opakovaným vařením a úpravou pH na 10!
β-glycerofosfát:
inhibitor serinových i treoninových fosfatáz
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu8
MS analýza proteinového vzorku
Cílový protein přítomen v komplexní směsi:
• Ionizace velkých molekul probíhá optimálně
v přibližně vyvážených množstvích komponent
• MS spektrum z komplexní směsi – překrývání
množství komponent
• Abundantní komponenty – potlačení signálů nízkoabundatních
Dynamický rozsah koncentrace proteinů v biologickém vzorku
může překročit 10 řádů
Požadavek: čistý vzorek s omezenou komplexitou
Cíl MS:
• Analýza proteinů v komplexní směsi
• Analýza cílového proteinu/cílové skupiny
proteinů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu9
10 000km
100km
10km
10cm
1 000km
1km
100m
10m
1m
1cm
MS analýza proteinového vzorku
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu10
Snížení komplexity vzorku
Subcelulární frakcionace
Frakcionace na úrovni proteinu
Frakcionace na úrovni peptidu
Separace
Deplece
Obohacení
Buňky v kultivačním médiu
Buněčný lyzát – charakter dle povahy lyzačního pufru (v případě
jemnějších lyzačních podmínek zachovány intaktní organely)
Povrchově vázané
proteiny
Proteiny sekretované do kultivačního média
(sekretom)
Odstranění buněk a buněčných zbytků
Membrány
Cytoplasma
Odebrání
buněk
Buněčná lýze
Jaderné proteiny
Mitochondriální proteiny
Cytosolární proteiny
Izolace buněčných
kompartment
Membránové proteiny
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Subcelulární frakcionace
hydrofobicita, bazicita, velikost
Specifické detergenty pro selektivní extrakci membránových proteinů
- separace od cytosolárních hydrofilních proteinů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu11
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu12
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity
• Centrifugační metody
Ultracentrifugace (hustota)
• Elektroforetické metody
Gelová elektroforéza (velikost/náboj)
Izoelektrická fokusace (pI)
Kapilární elektroforéza (velikost/náboj)
• Chromatografické metody
Reverzní fázová kapalinová chromatografie (hydrofobicita)
Iontoměničová chromatografie (náboj)
Afinitní chromatografie (specifická biomolekulární interakce)
Gelová chromatografie (velikost)
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
2D SDS-PAGE
MS analýza proteinového vzorku
2D SDS-PAGE:
• 1. rozměr = Izoelektrická fokusace (IEF)
- elektromigrační metoda - migrace nabitých
částic v gradientu pH v elektrickém poli
- separace proteinů dle pI
• 2. rozměr = SDS-PAGE
- elektromigrační metoda - migrace aniontů
v elektrickém poli dle MW
- separace proteinů dle MW
- 1.4g SDS/g protein
- SDS pro 2D v kontinuálním uspořádání
pI
MW
KONTAMINANTY:
Soli, iontové detergenty, nukleové kyseliny,
polysacharidy, lipidy, fenolické látky…
pH 3 10
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu13
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
2D SDS-PAGE – Solubilizace proteinů
MS analýza proteinového vzorku
Složení solubilizačního roztoku:
• Chaotropní činidla (močovina, thiomočovina)
• Neionogenní detergent (CHAPS, C7BzO)
• Redukční činidla (DTT, TBP)
• Inhibitory proteáz a enzymů odstraňujících modifikace (např. fosfatáz, deacetyláz, …)
• Amfolyty
Komponenty kompatibilní s IEF - nesmí zvyšovat iontovou sílu
C7BzOCHAPS
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu14
• fosforylace: Pro-Q Diamond (pSer, pThr, pTyr), Pierce phosphoprotein staining kit (pSer, pThr)
glykosylace: Pro-Q Emerald, Pierce glycoprotein staining kit
• Radioaktivní značení
Značení před analýzou (DIGE – CyDye, radioaktivní značení)
Barvení po analýze
Specifické barvení: post-translační modifikace (PTM)
Nespecifické barvení: všechny proteiny
• Viditelné barvení: Coomassie brilliant blue (R250, G250), stříbro (kyselá x amoniakální varianta)
• Fluorescenční barvení: Sypro Ruby (Ex/Em = 280, 450/610 nm), Lucy (Ex/Em = 506/520 nm),
Flamingo Pink (Ex/Em = 512/535 nm), Oriole (Ex/Em = 270/604 nm), Krypton (Ex/Em = 520/580),
Deep Purple (Ex/Em = 365, 520/610 nm), Lumitein (Ex/Em = 280, 450/610 nm)
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
2D SDS-PAGE – Detekce proteinů
MS analýza proteinového vzorku
Typy detekce:
Sypro Ruby Coomassie silver
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu15
Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
2D SDS-PAGE
MS analýza proteinového vzorku
Instrumentace:
Izoelektrický fokusátor
Elektroforetická aparatura
Denzitometr / Fluorescenční skener
SW pro obrazovou analýzu
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu16
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
denaturované nativní
(SDS/DTT/95 °C)
velké nativní proteiny
Blue Native Electrophoresis (BNE)
• Separace proteinů v nativním stavu
• Separace membránových komplexů
(10 – 10 000 kDa)
• Vzorky solubilizovány neionogenními
detergenty
• Náboj udělen Coomassie G-250
denaturované (SDS/DTT/95 °C)
membránové proteiny
Digest 92
PGs Digest 2-3
PGs
2. Rozměr SDS-PAGE1. Rozměr BNE
17
prefrakcionace v roztoku
• IEF v roztoku
• frakcionace dle pI
• obohacení proteinů o vybraném rozsahu pI
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
prefrakcionace na IPG stripu
• IEF v roztoku s využitím IPG stripu
• frakcionace dle pI
MicroRotofor
OffGel Fractionator
prefrakcionace v roztoku s využitím SDS-PAGE gelu
• IEF v roztoku s využitím IPG stripu
• frakcionace dle pI
Gel Elution Liquid Fraction Entrapment
Electrophoresis (GELFrEE)
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu18
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
MS analýza proteinového vzorku
Frakcionace
Proteinů
=
Separace komplexních proteinových
směsí
Deplece
abundatních
proteinů
Obohacení
nízkoabundatních
proteinů~
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu19
proteinový
vzorek
komplexní
proteinový
vzorek
jednoduchý
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
Metody
•Precipitace abundantního proteinu
•Chromatografie (kapalinová, gelová, …)
•Imunodeplece
Vysoce specifická protilátka proti abundantnímu proteinu imobilizovaná na
sorbentu
- komerční kity (př. ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit, Seppro (Sigma-Aldrich);
Pierce Top 2/12 Abundant Protein Depletion Spin Columns)
Výhoda:
•Detekce nízkoabundantních proteinů, které byly před deplecí maskovány
Riziko:
•Nespecifická vazba cílového proteinu na depletovaný abundantní protein
(např. nízkoabundantní protein krevní plasmy se může vázat na depletovaný
protein, který slouží jako jeho transportní protein)
cílový protein může být odstraněn společně s abundantním
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Deplece abundatních proteinů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu20
Příklad: Proteiny plasmy
Abundantní proteiny: ~ mg/ml (Albumin: 30-50 mg/ml, ~ ½ proteinů plasmy)
Potenciální biomarkery: ~ pg/ml, nízké hladiny zvláště v brzské fázi nemoci
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Deplece abundatních proteinů
Před deplecí HSA a IgG
Po depleci HSA a IgG
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu21
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Obohacení nízkoabundatních proteinů
ProteoMinerTM protein enrichment kit
• Redukce dynamického rozsahu koncentrace proteinu
v komplexní směsi
• Obohacení středně a nízkoabundantních proteinů
a snížení množství abundantních proteinů
Princip: velká, vysoce různorodá knihovna hexapeptidů
vázaných na kuličky
Abundantní proteiny saturují afinitní ligandy
a nadbytečné proteiny jsou odmyty
x
Středně a nízkoabundantní proteiny jsou
zakoncentrovány na specifických ligandech
Výhody:
• Snížení dynamického rozsahu koncentrací
při zachování zástupců všech proteinů původního
vzorku
• vhodný pro rozmanité typy vzorků, nezávislá na dostupnosti protilátek (na rozdíl od imunodeplece)
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu22
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni proteinů
MS analýza proteinového vzorku
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu23
proteinový
vzorek
jednoduchý
proteinový
vzorek
komplexní
Digesce
Obohacení peptidů
peptidový vzorek
komplexní
jednoduchý
peptidový
vzorek
• Výběr vhodné proteinasy (event. kombinace proteinas)
• Redukce a alkylace S-S můstků před digescí
• Digesci ovlivňuje: poměr enzym:substrát, teplota, doba
• Kompatibilita roztoků s následnou MS
- odstranění kontaminant – např. FASP, SP3
v gelu v roztoku
Digesce proteinů
Digesce proteinů
MS analýza proteinového vzorku
Digesce proteinů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu24
• FASP = Filter Aided Sample Preparation
MS analýza proteinového vzorku
Digesce proteinů v roztoku
• SP3 = Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation
Mol Cell Prot 18, 1027-1035 (2019)C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu25
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů
Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC
Frakcionace:
• off-line: LC (prefrakcionace)
• on-line: LC-MS
• Multidimenzionální chromatografie: LC-(LC)-… v různých provedeních
Základní faktory ovlivňující frakcionaci peptidů:
• Charakter kolony
• Složení mobilní fáze
• Fyzikálně-chemická povaha peptidů
(náboj, polarita, hydrofobicita, velikost)
MS analýza proteinového vzorku
Frakcionace na úrovni peptidů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu26
Chromatografie na reverzní fázi
• Nejčastěji používaná
• Separace molekul v roztoku na základě hydrofobicity
- separace na základě rozdělovacího koeficientu mezi
polární mobilní a hydrofobní (nepolární) stacionární fázi
• Separaci ovlivňuje: teplota, rozměry kolony, stacionární
fáze, velikost částic, iontově-párující činidla, gradient
MS analýza proteinového vzorku
Iontově párující činidla
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů
Frakcionace peptidů v roztoku pomocí LC
Hydrofilní interakční chromatografie (HILIC)
• Separace hydrofilních peptidů
• Hydrofobní mobilní fáze (např. ACN + voda, pufr)
• Hydrofilní stacionární fáze
• Vhodná pro separaci posttranslačně-modifikovaných peptidů
1. Distribuce mezi vodnou a
organickou vrstvou
2. Iontoměničová interakce se
skupinami stacionární fáze
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu27
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů
Frakcionace peptidů na IPG stripu
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Frakcionace na úrovni peptidů
Frakcionace peptidů v gelu
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu28
Obohacení specifických posttranslačně modifikovaných peptidů
• Fosforylace
• Ubiquitinace
• Glykosylace
• Acetylace
Přístupy:
• Imunoprecipitace (IP)
(specifické protilátky proti PTM)
• Afinitní chromatografie
(protilátka nebo ligand – specifita pro PTM)
• Enzymatická modifikace
(specifický enzym pro danou modifikaci)
• Chemická modifikace
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Obohacení peptidů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu29
• Přístupy pro obohacení fosfopeptidů
MS analýza proteinového vzorku
SCX
MS analýza proteinového vzorku
Snížení komplexity: Obohacení peptidů
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu31
Celoproteomová analýza vyžaduje desítky mikrogramů vstupního (~ 10e5 buněk)
vzorku vzhledem k:
• dynamickému rozsahu koncentrace proteinů v buňce
• citlivosti hmotnostních spektrometrů
Při zpracování velkého množství vzorku se ztrácí informace o heterogenitě buněk.
I v rámci jednoho buněčného typu existují různé populace, které se liší v genové
expresi.
Minimalizace ztrát vzorku kvůli nespecifickým interakcím proteinů/peptidů s povrchy
Nutno:
• minimalizovat objem vzorku při zpracování
• eliminovat přenos vzorku
• blokovat nespecifické interakce
Zpracování vzorku v minimálním objemu
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu32
NanoPOTS
Zpracování vzorku v minimálním objemu
• Skleněný čip s hydrofilním povrchem (průměr 1 mm).
• Všechny kroky (extrakce, redukce, alkylace, digesce) probíhají
v nanojamce (objem 200 nl) – 99% redukce objemu oproti
standardním přístupům
• Pro lýzi použit detergent kompatibilní s MS (Rapigest).
• Identifikace: stovky proteinů z jednotlivých HeLa buněk
Nat. Commun., 2018, 9 (1), 882.
OAD (Oil-Air-Droplet) chip • Kapka s buňkami na nízkovazebném milimetrovém čipu.
• Vzorek převrstven kapkou oleje (potlačení evaporace).
• Identifikace: stovky proteinů z jednotlivých HeLa buněk
• Všechny kroky (extrakce, redukce, alkylace, digesce) probíhají
v nanokapce (550 nl).
• Kapilára C18 vložena do kapky – on-line odsolení.
• Identifikace: 51 proteinů (z 1 HeLa b.) – 1360 (ze 100 HeLa b.).
Anal. Chem., 2018, 90 (8), 5430 – 5438.
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu33
ChipFilter • Ultrafiltrační membrána v utěsněné mikroreakční komůrce
(objem 1.2 ml).
• Založeno na přístupu FASP – miniaturizace (objem 600 nl).
• Integrovaná pumpa s vícecestnými ventily pro přívod reagencií.
• On-line napojení na LC-MS/MS.
J. Proteome Res., 2020, 19 (7), 2654 – 2663.
MicroFASP
• Miniaturizace povrchu filtrační membrány u FASP (0.1 mm2).
• Membrána integrována do 20ul pipetovací špičky.
• 1/10 objemu oproti standardnímu FASP.
• Identifikace: 3000 proteinů (z 10e3 buněk).
Anal. Chem., 2020, 92 (7), 5554 – 5560.
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu34
iPAD
(Integrated Proteome analysis Device)
• Buňky (10e2) v chladném roztoku (soli,
quanidine hydrochlorid, EDTA, trypsin) injikovány do
kapiláry, kde proběhla lýze i digesce (50 °C).
• Přímé napojení na LC-MS/MS.
• Identifikace: 813 proteinů (ze 100 buněk).
• Vylepšení – zúžení kapilár (objem 20 nl)
• HeLa buňka nasáta kapilárou pod mikroskopem,
zvýšená teplota, ultrasonikace pro podporu lýze
a digesce, on-line s LC-MS/MS.
• Identifikace: 180 proteinů (z 1 buňky).
Anal. Chem., 2015, 87 (13), 6674 – 6680.
Anal. Chem., 2018, 90 (23), 14003 – 14010.
SP3
• SP3 vhodný pro přípravu vzorku s limitním
množstvím proteinu.
• Provádí se klasicky ve zkumavkách,
v mikrolitrových množstvích.
Mol. Syst. Biol., 2014, 10 , 757.
Děkuji za pozornost!
Gabriela Lochmanová
gabriela.lochmanova@ceitec.muni.cz
C7250 Příprava vzorku pro MS analýzu35