1
DEN 1
VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ KE STUDIU GENOMU ARABIDOPSIS
THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN, DETEKCE A INTERAKCE
PROTEINŮ IN VIVO
Úvod
Dopolední část bude věnována analýze aktivity promotorů pomocí transkripční fúze a chemicky
indukovatelného transkripčního aktivačního systému. Během odpolední části proběhne příprava
experimentu pro tranzientní expresi proteinů v tabákových rostlinách v rámci detekce interakce
proteinů in vivo.
Časový harmonogram1
9:15 Sraz v učebně C02/211
9:20 Zahájení semináře (Jan Hejátko), UKB, Kamenice 5, budova C02, místnost 211
9:30 PŘÍPRAVA MATERIÁLU (Jan Hejátko), laboratoř 334
9:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 1 (Jan Hejátko), laboratoř 334
Teoretický úvod, zahájení barvení
10:30 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 1 (Jan Hejátko),
laboratoř 334
Teoretický úvod, zahájení indukce dexametazonem
11:30 – 12:30 OBĚD
12:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 2 (Jan Hejátko), laboratoř 334
Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování
12:45 DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO (Jan Skalák), laboratoř 334
Infiltrace listů tabáku
14:45 UKONČENÍ PROGRAMU 1. DNE
Příprava materiálu
Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky.
Práce v laboratoři
• Bezpečnost
• Zdroje vody
• Základní chemikálie
• Odměřování a pipetování
• Skladování
• Odpady a použitý materiál
• Sterilizace
1
jednotlivé časy se mohou měnit podle potřeby a rychlosti zvládnutí jednotlivých metod
2
Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály:
• ddH2O (sterilní, 50ml)
• 70% etanol / 100% etanol
• Špičky/zkumavky (sterilní)
• Pinzetu
• Barvící pufr a destičky
• Tužky, fixy, popisovací nálepky
Komponenty PCR reakce. V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie:
• Taq DNA polymeráza
• 10x koncentrovaný PCR pufr s MgCl2
• dNTP
• primery
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE
Princip metody
Podstatou metody je příprava rekombinantní DNA, sestávající z promotoru analyzovaného genu (gen
zájmu, Gene Of Interest, GOI) a genu-zpravodaje (reportérového genu). Tento konstrukt je
transformován do hostitelského organizmu a následně je u jednokopiových transformantů provedena
analýza časoprostorové specifity aktivity (exprese) reportérového genu. Protože je reportér pod
kontrolou promotoru GOI, lze předpokládat, že ve stejných pletivech/tkáních je aktivní i endogenní
verze GOI (studovaný gen zájmu).
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 1
Zahájení barvení
POSTUP
1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok (1 ml) do barvící 12ti jamkové destičky
2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru
3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.)
4) Vložte do termostatu (37 °C).
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 2
POSTUP
1) Proveďte kontrolu barvení pomocí stereomikroskopu.
2) Barvení zastavte pomocí 80 % etanolu, ve kterém ponechejte semenáčky odbarvovat při pokojové
teplotě do druhého dne.
Použité transgenní linie:
1) ProCYCB1::GUS (sk. 1+4)
2) ProARR5::GUS (sk. 2+5)
3) ProAHK4::GUS (sk. 3+6)
3
Složení barvícího roztoku:
X-Glc 0,01% (w/v)
Triton X100 0,1% (v/v)
Pi pufr, pH 6,9 0,1M
K3[Fe(CN)6]/ K4[Fe(CN)6] 0.5 mM
DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM
Princip metody
Použití chemicky indukovatelných systémů pro expresi transgenů je zásadním požadavkem moderního
biologického výzkumu (nejen) rostlin. V našem experimentu použijeme přísně regulovaný a vysoce
citlivý genový expresní systém pOp6/LhGR (Samalova et al., 2005, Plant J 41: 919-935), který je
indukovatelný dexametazonem (DEX). Tento systém obsahuje transkripční aktivátor LhGR a
chimérický promotor pOp, který se skládá z lac operátorů naklonovaných před minimálním
promotorem CaMV35S. Po indukci se aktivátor LhGR naváže na pOp promotor a indukuje z něj expresi
požadovaného cílového genu (viz obr. 1).
Bylo vyvinuto několik chemicky indukovatelných systémů (viz přehled Moore et al., 2006, Plant J 45:
651-683). Avšak pro ideální systém je zapotřebí řady vlastností, jako jsou velmi nízké hladiny bazální
(neindukované) exprese, vysoká indukovatelnost, specifičnost a dynamický rozsah odezvy vůči
induktoru, žádoucí je také rychlá odpověď a indukce různými metodami. Ideální systém by měl
fungovat u několika druhů organismů a neměl by vyvolávat žádné nežádoucí fyziologické účinky, sám
o sobě nebo jeho induktor. Pro induktor je dále požadováno, aby pro transgen vykazoval vysokou
specifičnost, vysokou účinnost při nízkých koncentracích a nesmí být nalezen v cílových organismech,
a proto jsou složky pro tyto systémy obvykle odvozeny z nepříbuzných druhů.
Obrázek 1. Schéma mechanismu regulovatelné exprese transgenů v systému pOp6/LhGR
4
DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 1
Zahájení indukce dexametazonem
POSTUP
1) Opatrně umístěte semenáčky (přibližně 10-15 kusů) z dané Petriho misky do roztoku, který buď
obsahuje dexametazon nebo kontrolní rozpouštědlo (DMSO).
a) Napipetujte 2 ml vody do dvou jamek 12ti jamkové destičky
b) Přidejte buď 2 µl zásobního roztoku DEX (20 mM/DMSO) nebo DMSO
i) Výsledná pracovní koncentrace je ……
2) Nechte indukci pokračovat po dobu 24 hodin na pracovním stole nebo v rostlinném inkubátoru.
DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO
Princip metody
Schopnost interagovat s dalšími proteiny je jednou ze základních charakteristik bílkovin jakožto
základního kamene živých organismů. Protein-proteinová interakce je nutným předpokladem i pro
přenos informace v signálních drahách. Informace se obvykle předává v podobě fosfátové skupiny
mezi kinázou a jejím proteinovým substrátem, který je specificky rozpoznáván, anebo je
prostřednictvím protein-proteinové interakce přímo ovlivňována aktivita interakčního partnera.
Jednou z prvních otázek, které si klademe při funkční analýze genů signálních drah, je ta, se kterými
dalšími signálními elementy studovaný protein interaguje. Další důležitou otázkou je, ve kterém
buněčném kompartmentu je protein lokalizován, případně ve kterém buněčném kompartmentu spolu
dva proteiny interagují. S použitím transientní exprese proteinů po infiltraci listů tabáku Nicotiana
benthamiana suspenzí Agrobacterium tumefaciens a s pomocí skenovací laserové konfokální
mikroskopie, můžeme tyto otázky zodpovědět.
V tomto protokolu i) indukujeme nejprve produkci rekombinantních proteinů (translačních fůzí mezi
proteinem, jehož interakci chceme studovat, s fluorescenčním proteinem) a následně budeme ii)
analyzovat jejich interakci in vivo pomocí FLIM-FRET.
DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 1
Infiltrace agrobakterií do listů tabáku Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana SR1
Listy tabáku Nicotina tabacum jsou vhodným rostlinným systémem pro transientní expresi fúzních
proteinů, u kterých chceme studovat jejich vzájemné interakce a lokalizaci uvnitř rostlinné buňky. K
transformaci listu využijeme přenos T-DNA z Agrobacterium tumefaciens. Studované geny jsou
naklonovány do expresní kazety uvnitř T-DNA oblasti binárního plasmidu a takto připravené
konstrukty pro expresi fúzních proteinů (s GFP, RFP, YFP-N, YFP-C apod.) jsou transformovány do
kmenu GV3101 pMP90. Vzniklé kmeny agrobakterií potom kultivujeme a ve formě suspenze je pomocí
injekční stříkačky (bez jehly) vtlačíme skrze průduchy na spodní straně listu do mezofylového prostoru.
Následně dojde k přenosu mnoha kopí T-DNA do jádra buněk. Pro transkripci vnesených genů není
nutné začlenění T-DNA do chromozomů. Pokud před infiltrací smícháme kmeny nesoucí různé
konstrukty, dojde s velkou pravděpodobností k jejich koexpresi, protože jedna buňka je zpravidla
transformována mnoha agrobakteriemi současně. Avšak k dosažení koordinované exprese dvou
proteinů je výhodnější spojit je peptidem se samo-štěpícími se vlastnostmi, jako je např. 2A peptid
izolovaný z FMDV (Samalova et al., 2006, Traffic 7: 1701-1723). Transientní exprese proteinů je
většinou velmi silná kvůli velkému počtu transkripčně aktivních kopií T-DNA v jádře, ale během
několika dnů (3-4) odezní.
5
POSTUP
1) Každá skupina si vezme 1 nebo 2 zkumavky s narostlou agrobakteriální kulturou podle
následujícího rozpisu:
Skupina
1
Skupina
2
Skupina
3
Skupina
4
Skupina
5
Skupina
6
Skupina
7
Skupina
8
AHP3-
GFP
AHP3-
GFP
AHP3-
GFP
AHP3-
GFP
AHP3M-
GFP
AHP3M-
GFP
AHP3M-
GFP
AHP3M-
GFP
- ARR1-
RFP
ARR2-
RFP
AHK4-
RFP
- ARR1-
RFP
ARR2-
RFP
AHK4-
RFP
2) Přeneste 1,5 ml od každé kultury do eppendorfové zkumavky (nezapomeňte ji označit!).
3) Centrifugujte zkumavky rychlostí 4000 ot/min po dobu 5 minut.
4) Během centrifugace připravte 25 ml infiltračního pufru (IB):
Infiltrační pufr (25 ml)
10x IB 2.5 ml
destilovaná voda do 25ml
1M Acetosyringon 5 µl
5) Supernatant odsajte pipetou.
6) Přidejte 1 ml připraveného IB do buněk a znovu je resuspendujte.
7) Centrifugujte zkumavky při 13000 ot/min po dobu 45-60 s a odsajte supernatant.
8) Zopakujte krok promývání (body 5 a 6).
9) Resuspendujte buňky v 1 ml IB.
10) Nařeďte 1/5 (200 μl buněk v 800 μl IB) v kyvetě pro spektrofotometr.
1) Změřte OD600 a připravte 1 ml směsi OD600 = 0,2 pro infiltraci tabáku.
2) Infiltrujte suspenze pomocí injekční stříkačky o objemu 1 ml (bez jehly) přes spodní stranu listu do
připravených tabákových rostlin.
3) Vezměte rostliny do skleníku. Za 2-3 dny proveďte konfokální mikroskopii epidermis na abaxiální
straně listu (viz metoda Transientní exprese v tabáku 2).
6
DEN 2
PRÁCE S DATABÁZEMI A NÁSTROJI PRO ZPRACOVÁNÍ MOLEKULÁRNĚBIOLOGICKÝCH
INFORMACÍ, GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR
Úvod
Nejprve se seznámíte s genomickými databázemi a užitečnými nástroji pro genomiku. Jednou z metod
studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si osvojíte rychlou metodu
izolace DNA z rostlinného materiálu a založíte několik PCR reakcí. Amplifikovat budeme oblast inzerce
cizí DNA (transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21.
Časový harmonogram
8:30 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 2 (Jan Hejátko),
laboratoř 334
Zahájení barvení
8:45 DATABÁZE A KONSTRUKCE VEKTORŮ PRO GATEWAY® KLONOVÁNÍ (Jan Skalák) místnost 121
12:00 OBĚD
13:00 GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 1 (Anna Rudolfová, Jiří Rudolf), laboratoř 334
Izolace dna a založení PCR
15:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 3 (Jan Hejátko), laboratoř 334
Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C
15:45 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 3 (Jan Hejátko),
laboratoř 334
Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování
16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 2. DNE
DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 2
Zahájení barvení
POSTUP
1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok (1 ml) do barvící 12ti jamkové destičky
2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru
3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.)
4) Vložte do termostatu (37 °C).
DATABÁZE A KONSTRUKCE VEKTORŮ PRO GATEWAY® KLONOVÁNÍ
Princip metody
Vyhledání genové, proteinové sekvence genu zájmu. Seznámení se s dohledáváním důležitých
informací vztahujících se ke genu zájmu. Určení podobných genů a následná fylogenetická analýza
7
vybraných genů. Vyhledávání promotorových oblastí a analýza vazebných míst pro transkripční
faktory. Analýza a zpracování obrazových dat.
Databáze
NCBI – Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
EMBL-EBI – Databáze a nástroje shromažďující genomické a biomedicínské informace
https://www.ebi.ac.uk/
TAIR – Databáze shromažďující informace pro práci s Arabidopsis thaliana.
www.arabidopsis.org
UNIPROT – Databáze shromažďující sekvenční a funkční informace o proteinech
https://www.uniprot.org/
Nástroje
ApE
- nástroj pro zpracování sekvence DNA
https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape
SnapGene
- nástroj pro přípravu a vizualizaci DNA sekvencí
https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/download/
AthaMap
- nástroj pro vyhledávání vazebných míst v promotorové oblasti genů pro Arabidopsis
https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
Úkoly:
1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank
2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli
3. Vyhledejte gen PHYB (Phytochrome B) u Arabidopsis a určete nejbližší ortology u Brassica
napus/rapa/oleracea pomocí algoritmů BLAST a FASTA. Jaká je procentuální identita pro nalezené
ortology s Arabidopsis?
4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis.
5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu
v publikované sekvenci daného chromosomu).
6. Pro gen ARR4 (At1g10470) a ARR5 (At3g48100) určete oblast 1500 bazí v oblasti promotoru genu.
Ukončete sekvenci na ATG. Analyzujte na přítomnost vazebných míst transkripčních faktorů s
GARP vazebnou doménou pomocí hledání v databázi AthaMap. Diskutujte výskyt nalezených
transkripčních faktorů.
7. Srovnejte proteinové sekvence nalezených transkripčních faktorů z bodu 6. pomocí algoritmu
CLUSTAL Omega a diskutujte nalezená konzervovaná místa/aminokyseliny.
8
Konstrukce vektorů pro Gateway® klonování
Pro odhalení funkce genu, jeho části anebo regulační sekvence v DNA je klonování nepostradatelnou
součástí genového inženýrství. Technologie klonování Gateway® umožňuje rychlou přípravu vektorů s
širokou škálou použití. Univerzálnost metody dovoluje kombinovat tzv. „entry“ vektory s
„destinačními“ vektory pro studium konkrétní sekvence DNA pomocí rekombinačních sekvencí.
Terminologie:
Klon DNA = soubor identických molekul (fragmentů, úseků) DNA
Rekombinantní DNA = molekula DNA vytvořená in vitro (spojením cizorodé DNA s klonovacím
vektorem)
Klonovací vektor = molekula DNA schopná přijmout cizorodou DNA (insert) do svojí sekvence a
umožnit její autonomní replikaci v hostitelské (nejčastěji bakteriální) buňce nebo viru.
1. Amplifikace DNA fragmentů ohraničení attb sekvencemi pomocí PCR
Prvním krokem klonování Gateway® je konstrukce entry vektorů. Rekombinujeme sekvenci zájmů
(insert) do entry vektoru (např. pDONR207/201/atd.) pomocí tzv. BP reakce (viz schéma). Insert
získáme pomocí PCR reakce, kde použijeme genově specifické primery (podbarveno žlutě), které jsou
ohraničeny attB místy (podbarveno zeleně).
Forward primer:
attB1: 5’ GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CT 3‘ + TA (k zachování čtecího rámce je možné
použít jiné báze, které ovšem nevytvoří stop kodon) + ATG + 18 – 20 bp specifický primer pro 5´ konec
genu
Reverse primer:
attB2: 5‘ GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT 3‘ + G (k zachování čtecího rámce je možné
použít) + 18 – 24 bp specifický primer pro 3´ konec genu (vynechte stop kodon v případě Cterminálních
fúzí)
• Tm pro specifické konce primerů by měly být 50 – 60 °C.
• Tm pro specifické konce primerů by se neměly lišit o 2 °C
• Posledních 5bp na 3´konci primeru by nemělo obsahovat vice jak 2 GC páry
• Vyhněte se homopolymerním repeticím na 3´konci primeru (AAA, CCC, TTT, GGG)
2. BP reakce
PCR produkt s attB přesahy se smíchá s prázdným entry vektorem (donor), který obsahuje attP místa.
BP klonáza rekombinuje attB insert do attP pozic za vzniku attL míst.
3. LR reakce:
Entry vektor obsahující attL místa se v dalším kroku smíchá s destinačním vektorem obsahujícím attR
místa. LR klonáza rekombinuje attL místa entry klonů do attR míst destinačních vektorů = vznikají opět
attB místa.
9
Obrázek 2. Schéma Gateway® klonování. Zdroj: https://blog.addgene.org/plasmids-101-gateway-
cloning
Úkoly:
1. Vytvořte v programu ApE (https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape) insert s attB přesahy
– jako insert si vyberte libovolnou sekvenci genu Vašeho zájmu.
2. Proveďte BP reakci in silico s poskytnutým donorovým vektorem (pDONR™/Zeo) v programu ApE.
Výsledný entry vektor zobrazte v programu SnapGene (https://www.snapgene.com/snapgeneviewer/download/)
a detekujte klíčové oblasti společně s Vaším genem zájmu.
3. Navrhněte restrikční endonukleázy, které by se daly použít pro identifikaci pozitivního klonu a
zobrazte výsledek štěpící reakce jak pro prázdný entry vektor, tak pro vytvořený vektor s genem
zájmu.
4. Proveďte LR reakci in silico mezi vytvořeným entry vektorem s genem zájmu a poskytnutým
destinačním vektorem (pH7WGF2 N-GFP) v programu ApE. Výsledný destinační vektor zobrazte v
programu SnapGene a detekujte klíčové oblasti společně s Vaším genem zájmu.
5. Dále v programu SnapGene zobrazte neporušený otevřený čtecí rámec. Pokud bude čtecí rámec
porušený, začněte znovu od bodu jedna a modifikujte attb1 primer dle manuálu.
6. Navrhněte restrikční endonukleázy, které by se daly použít pro identifikaci pozitivních klonů a
zobrazte výsledek štěpící reakce jak pro prázdný destinační vektor, tak pro vytvořený destinační
vektor s genem zájmu.
10
Šablona k protokolům: DATABÁZE A KONSTRUKCE VEKTORŮ PRO GATEWAY® KLONOVÁNÍ
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup a výsledky2:
Závěr
2
Při tvorbě map vektorů pro klonování zvýrazněte neporušený čtecí rámec mezi fluorescenčním proteinem a
proteinem vašeho zájmu.
11
GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR
Princip metody
Testované linie jsou inzerční mutanti. Tyto inzerce lze potvrdit pomocí PCR, respektive dvou PCR
reakcí. K otestování jsou potřeba tři primery, dva mimo inzerci a jeden uvnitř inzerce (schéma na konci
úlohy). První PCR reakce amplifikuje s primery mimo inzerci – tato reakce umožňuje odhalit situaci bez
inzerce, tedy rostliny standardního typu (wild type). Druhá reakce využívá primer uvnitř inzertu a jeden
mimo inzerci – tato reakce odhalí inzerci v daném místě. Výsledky PCR se zobrazí pomocí fluorescenční
barvičky (Midori Green) na agarózovém gelu po elektroforetické separaci, což umožňuje odhalit, jestli
byla PCR reakce úspěšná a jestli má produkt očekávanou velikost.
Úvod k praktické části genotypování
• Úvod do metodologie praktika
o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky
o schéma experimentu
o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homonebo
heterozygotní stav, vlastní provedení
Praktická část
1. Izolace DNA
2. Založení PCR
GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 1
Rychlá izolace DNA pro PCR
POSTUP
1) Homogenizujte jeden střední vymražený list vychlazenou skleněnou tyčinkou v 1,5ml zkumavce
(eppendorfka) ve stojánku.
2) Přidejte 400 µl extrakčního pufru, vortexujte 5 s a nechte stát při laboratorní teplotě 10 min.
3) Centrifugujte při 14000 otáčkách 10 min, 4˚C.
4) Přeneste 300 µl supernatantu do nové 1,5ml zkumavky a přidejte 300 µl izopropanolu, 4-6 krát
překlopit. Nechte stát 5 min při laboratorní teplotě.
5) Centrifugujte 10 min, 4˚C. Odstraňte supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu.
6) Přidejte 500 µl 70% etanolu. Centrifugujte při 14000 otáčkách 2 min, odstraňte etanol a nechte
vysušit (SpeedVac, cca 5-10 min, nebo na stole).
7) Pelet rozpusťte ve 100 µl sterilní ddH2O. Genomovou DNA uchovávejte na ledu nebo v lednici.
Extrakční pufr
Tris/HCl (200mM, pH7.5)
NaCl (250mM)
EDTA (25mM)
SDS (0.5%)
Založení PCR
Do 0.2 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq
polymerázu podle schématu:
12
PCR směs: 10x pufr dNTP prim1 prim2 Taq pol. templ. DNA H2O celk. 50 ul
5 µl 4 µl 1 µl 1 µl 2 µl 5 µl 32 µl
primery AHP4 spec.: Sim612, Sim 799 – 212 bp
primery ARR21 spec.: 16kon, 16new – 340 bp
primery ARR4 spec.: ARR4N, ARR4S – 137 bp
primer transpozon 8130, Sim 799 – 250 bp
8130, 16new – 390 bp
d11, ARR4N – 195 bp
Navrhněte vhodnou kombinaci primerů a to tak, abyste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni
identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo
heterozygotního pro danou inzerční alelu.
Kombinace primerů pro jednotlivé typy templátů (viz také schéma na následující straně):
primery templátová DNA
AHP4:
1a ………………… ……………….
2a ………………… ……………….
3a ………………… ……………….
4a ………………… ……………….
ARR21:
1b ………………… ……………….
2b ………………… ……………….
3b ………………… ……………….
4b ………………… ……………….
ARR4:
1c ………………… ……………….
2c ………………… ……………….
3c ………………… ……………….
4c ………………… ……………….
Navrhněte vhodné podmínky PCR pro dané reakce:
Teplota Čas Cyklus
Počáteční denaturace 94 C ….. min 1
Denaturace 94 C ….. sek 30
13
Anelace 65 C ….. sek
Polymerizace 72 C ….. sek
Finální polymerizace 72 C ….. min 1
Obrázek 3. Schéma lokalizace inzerčních mutací (transpozonů) v analyzovaných genech.
14
Šablona k protokolům: GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup a výsledky:
Závěr3:
3
Uveďte zejména, zda jste identifikovali inzerčního mutanta a zda se jedná o homozygota nebo o heterozygota
pro danou inzerční alelu a proč.
15
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 3
Odbarvování preparátů pro analýzu genové exprese pomocí transkripční fúze
POSTUP
1) Proveďte výměnu 80 % etanolu a umístěte semenáčky na 4 °C, kde je ponecháte do 4. dne
(čtvrtek).
DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 3
Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování
POSTUP
1) Pomocí stereomikroskopu zkontrolujte intenzitu GUS barvení
2) Po dosažení dostatečné intenzity proveďte výměnu barvícího roztoku za 80 % etanol.
DEN 3
IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU V GELU, qPCR METODA
Úvod
PCR produkty rozdělíme pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a představíme si metodu
kvantitativní real-time PCR (qPCR), což je moderní technika molekulární biologie umožňující rychlou,
citlivou a spolehlivou detekci a kvantifikaci specifického úseku DNA.
Časový harmonogram
9:00 DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 4 (Jan Hejátko, 334)
Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C
9:15 KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 1 (Lucia Tomovičová), laboratoř 334
Teoretický úvod ke qPCR
9:30 GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 2 (Anna Rudolfová, Jiří Rudolf)
Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce (skupina 1-4,
laboratoř 333)
KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 2 (Lucia Tomovičová)
Příprava kalibrační přímky pro qPCR a analýza genové exprese LBD29 (skupina 5-8, laboratoř
334/329/215)
10:45 GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 2 (Anna Rudolfová, Jiří Rudolf)
Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce (skupina 5-8,
laboratoř 333)
KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 2 (Lucia Tomovičová)
Příprava kalibrační přímky pro qPCR a analýza genové exprese LBD29 (skupina 1-4, laboratoř
334/329/215)
16
12:00 GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 2 (Anna Rudolfová, Jiří Rudolf)
Identifikace PCR produktů v agarózovém gelu (laboratoř 333)
12:30 OBĚD
14:00 KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 3 (Lucia Tomovičová)
Vyhodnocení (C02/211)
16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 3. DNE
DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 4
Odbarvování preparátů pro analýzu genové exprese pomocí transkripční fúze
POSTUP
1) Proveďte výměnu 80 % etanolu a umístěte semenáčky na 4 °C, kde je ponecháte do 4. dne
(čtvrtek).
GENOTYPOVÁNÍ POMOCÍ PCR 2
Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce
POSTUP
1) Připravte 400 ml 1,5% agarózy v 1x TBE pufru a rozvařte v mikrovlnné troubě. Po rozpuštění
agarózy přidejte MidoriGreen, která bude sloužit k vizualizaci DNA.
2) Připravte formu pro gel, vsadte hřeben, nalijte do formy vrstvu tekuté agarózy 5 - 8 mm a nechte
ztuhnout.
3) Formu s gelem vložte do elektroforézové vany, převrstvěte pufrem a vyjměte hřeben.
4) Napipetujte délkový a hmotnostní standard a vzorky:
• délkový a hmotnostní standard (2-Log): 1 µg
• vzorky: 10 µl PCR + 2 µl 6x konc. nanášecího pufru
5) Spusťte elektroforézu při 80 V po dobu 60 min.
6) Pozorujte proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentujte.
Obrázek 4. Délkový a hmotnostní standard: 2-Log DNA ladder (0,1 – 10,0 kb; 1 µg)
17
KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 1
Princip metody
Real-time PCR je založena na sledování průběhu polymerázové řetězové reakce (PCR) přímo během
reakce (tzv. „v reálném čase") pomocí fluorescenčních sond či barviv, které detekují množství PCR
produktu během reakce zvýšením své fluorescenční aktivity. Její výhodou oproti konvenční PCR je
možnost přesného stanovení výchozího počtu kopií cílové templátové sekvence DNA, čili schopnost
kvantifikace. Real-time PCR se provádí s pomocí přístrojů zvaných cyklery, které umožňují jak
provádění teplotního cyklování, tak detekci fluorescence v každém cyklu PCR.
Real-time PCR kvantifikace
Používané matematické modely pracují s hodnotou zvanou Ct („threshold cycle"), která se rovná cyklu,
kdy amplifikační křivka překročí fluorescenční práh umístěný do počátku exponenciální fáze reakce.
Absolutní kvantifikace, která se používá např. při detekci specifických mikroorganismů, přímo určuje
výchozí počet kopií cílových molekul. Je založena na zjištění, že existuje lineární vztah mezi logaritmem
výchozího počtu kopií templátové DNA a Ct příslušné amplifikační křivky. Pokud tedy amplifikujeme
vzorek o neznámé koncentraci společně s diluční sérií standardů o známé koncentraci, získáme
kalibační přímku („standard curve"), ze které lze odečíst výchozí koncentraci neznámého vzorku.
Relativní kvantifikace, která se používá ke stanovení míry genové exprese, zpravidla nevyžaduje
sestrojení kalibrační přímky. Porovnává se relativní změna genové exprese (relativní expresní poměr)
v testovaném vzorku oproti kontrolnímu vzorku.
Při kvantifikaci mRNA (měření genové exprese) se před vlastní PCR provádí reverzní transkripce, tj.
přepis mRNA do tzv. cDNA, která je následně amplifikována pomocí qPCR.
Obrázek 5. Schéma průběhu qPCR amplifikace pro různé koncentrace standardu (A) a konstrukce
kalibrační přímky (B).
Efektivita amplifikace
Efektivita amplifikace je významný parametr qPCR reakce, který do velké míry závisí na použitých
primerech. Vyhodnocování relativní genové exprese metodou ΔΔCt (viz níže) předpokládá, že
efektivita amplifikace se všemi použitými primery je přibližně stejná. Teoreticky by měla být hodnota
18
efektivity rovna 100 %, což znamená, že množství produktu se zdvojnásobuje v každém cyklu, prakticky
se však za akceptovatelné považuje rozmezí 90-110 %.
Efektivita PCR amplifikace se stanovuje ze sklonu („slope“) kalibrační přímky, a to (10-1*slope
)-1)*100%.
Kalibrační přímka se sestrojí tak, že se na osu x nanese hodnota kvantifikačních cyklů (Ct) a na osu y
hodnota logaritmu koncentrace standardu nebo faktoru ředění.
Relativní kvantifikace metodou ΔΔCt (delta-delta-Ct)
Metoda ΔΔCt umožňuje kvantifikovat relativní rozdíl genové exprese mezi dvěma vzorky (většinou se
jedná o rozdíl mezi kontrolním vzorkem a vzorkem ovlivněným nějakou látkou, např. hormonem).
Podmínkou použití této metody je přibližně stejná efektivita amplifikace referenčního a testovaného
genu.
Pro účely tohoto cvičení bude naším referenčním genem UBC10 („Ubiquitin-conjugating enzyme 10“)
a testovaným genem LBD29 („Lateral organ boundaries-domain 29“). Budeme sledovat expresi obou
genů ve vzorcích z rostlin, které byly po různě dlouhou dobu (6-48 hodin) vystaveny rostlinnému
hormonu auxinu (kyselina 1-naftyloctová, NAA). Jako kontrola budou sloužit vzorky z rostlin vystavené
DMSO (organické rozpouštědlo).
Postup porovnání genové exprese mezi dvěma vzorky metodou ΔΔCt:
1) Výpočet ΔCt v rámci jednotlivých vzorků:
∆Ct (DMSO) = Ct (testovaný gen, LBD29) – průměrné Ct (referenční gen, UBC10)
∆Ct (NAA) = Ct (testovaný gen, LBD29) – průměrné Ct (referenční gen, UBC10)
2) Výpočet ΔΔCt:
∆ΔCt (DMSO) = ΔCt (DMSO) – průměrné ΔCt (DMSO)
∆ΔCt (NAA) = ΔCt (NAA) – průměrné ΔCt (DMSO)
3) Stanovení změny exprese ve vzorku vystaveném hormonu v porovnání s kontrolou („fold
change“): 2-(∆∆Ct)
Ve vzorku DMSO: 2-(∆∆Ct(DMSO)
Ve vzorku NAA: 2-(∆∆Ct(NAA)
Průměrná hodnota 2-(∆∆Ct)
v kontrolním vzorku (DMSO) by se měla rovnat přibližně 1.
Nejvýznamnějším výsledkem je průměrná hodnota 2-(∆∆Ct)
ve vzorku NAA, ta může mít
hodnoty rovné 1 (žádná změna exprese v porovnání s kontrolou), menší než 1 (snížená
exprese ve srovnání s kontrolou), víc než 1 (zvýšená exprese ve srovnání s kontrolou).
KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 2
Příprava kalibrační přímky pro qPCR a analýza genové exprese LBD29
POSTUP
1) Připravte master mix (MM) pro kalibrační přímku genu UBC10 (referenční gen) a LBD29 (testovaný
gen) a k 16 µl MM vždy přidejte 4 µl cDNA.
Celkový objem qPCR mixu pro 1 reakci je 20 µl, která obsahuje 16 µl MM a 4 µl cDNA. Každou
reakci připravte pro danou cDNA 2x ~ 2 technická opakování.
19
MM pro 1 reakci (16 µl):
a. 10 µl FastStart SYBR Green Master
b. 0.5 µl primer F („forward“)
c. 0.5 µl primer R („reverse“)
d. 5 µl H20
Připravte MM pro 13 reakcí (10 vzorků, 3 rezerva):
a. …. µl FastStart SYBR Green Master
b. …. µl primer F („forward“)
c. …. µl primer R („reverse“)
d. …. µl H20
Pro kalibrační přímku si připravte cDNA s ředěním 10x, 100x, 1.000x a 10.000x a 100.000x:
2) Připravte master mix (MM) pro analýzu exprese genu UBC10 (referenční gen) a LBD29 (testovaný
gen) a k 16 µl MM vždy přidejte 4 µl 10x ředěné cDNA nebo negativní kontrolu (vodu).
Celkový objem qPCR mixu pro 1 reakci je 20 µl, která obsahuje 16 µl MM a 4 µl cDNA nebo 4 µl
neg. kontroly. Každou reakci připravte pro danou cDNA 3x ~ 3 technická opakování.
MM pro 1 reakci (16 µl):
a. 10 µl Fast SYBR Green Master
b. 0.5 µl primer F (forward)
c. 0.5 µl primer R (reverse)
d. 5 µl H20
Připravte MM pro 16 reakcí (12 vzorků, 1 negativní kontrola, 3 rezerva):
a. …. µl FastStart SYBR Green Master
b. …. µl primer F („forward“)
c. …. µl primer R („reverse“)
d. …. µl H20
Zkumavka Ředění Objem vzorku Objem vody
A 10x (1/10) - B
100x (1/100) 2 µl ze zkumavky A 18 µl
C 1000x (1/1.000) 2 µl ze zkumavky B 18 µl
D 10000x (1/10.000) 2 µl ze zkumavky C 18 µl
E 1000000x (1/100.000) 2 µl ze zkumavky D 18 µl
Skupina Vzorky (cDNA) Gen Pozice na destičce
1+2/5+6 10x, 100x, 1.000x, 10.000x, 100.000x UBC10 1-10
3+4/7+8 10x, 100x, 1.000x, 10.000x, 100.000x LBD29 11-20
Skupina Vzorky (cDNA) Gen Pozice na destičce
1/5 DMSO 6h, NAA 6h, DMSO 12h, NAA 12h UBC10 21-32 + 69 (neg.)
2/6 DMSO 6h, NAA 6h, DMSO 12h, NAA 12h LBD29 33-44 + 70 (neg.)
3/7 DMSO 24h, NAA 24h, DMSO 48h, NAA 48h UBC10 45-56 + 71 (neg.)
20
3) qPCR analýza pomocí přístroje QIAGEN Rotor-Gene® Q.
KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 3
Vyhodnocení
Úkoly
1. Konstrukce kalibrační přímky:
a. Do excel dokumentu, který obdržíte během výuky zkopírujte hodnoty Ct (obě technické
repliky pro každý vzorek) pro každé ředění cDNA. V tabulce se vám automaticky spočítá
průměrná Ct hodnota pro každý vzorek a logaritmus hodnoty jednotlivých ředění. Z těchto
údajů se v pravé části vykreslí graf s lineární trendovou čarou (lineární regrese), který
reprezentuje kalibrační přímku. Na základě jejího sklonu se dopočítá efektivita
amplifikace, definovaná jako (10-1*slope
)-1)*100%.
Příklad:
b. Do protokolu zkopírujte obrázky s výsledky kalibrační přímky pro referenční (UBC10) i
testovaný gen (LBD29), a zhodnoťte výslednou efektivitu amplifikace. V případě
nepříznivých výsledků uveďte faktory, které mohly výsledky ovlivnit.
2. Analýza exprese genu LBD29:
a) Do excel dokumentu, který obdržíte během výuky zkopírujte hodnoty Ct (tři technické
repliky pro každý vzorek) pro oba geny. V tabulce se Vám automaticky spočítají hodnoty
∆Ct, ∆∆Ct a 2-(∆∆Ct)
, podle pravidel uvedených v teoretickém úvodu cvičení.
4/8 DMSO 24h, NAA 24h, DMSO 48h, NAA 48h LBD29 57-68 + 72 (neg.)
Teplota Čas Cyklus
Počáteční denaturace 95 C 10 min 1
Denaturace 95 C 15 sek
40Anelace 60 C 20 sek
Polymerizace 72 C 20 sek
Finální polymerizace 72 C 1 min 1
21
Příklad analýzy exprese genu LBD29 po 6-hodinové kultivaci v přítomnosti NAA:
b) Do protokolu zkopírujte část excel tabulky týkající se vašich vzorků a zhodnoťte výsledky.
Jak se změnila exprese genu LBD29 v přítomnosti auxinu v různých časových bodech? Do
jaké míry je výsledek vašeho měření ovlivněn nepřesným pipetováním vzorků?
22
Šablona k protokolům: KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup a výsledky4
:
Závěr:
4
Do protokolu zejména uveďte: stručný popis postupu cvičení a vypracované úkoly uvedené v části
„KVANTIFIKACE GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ qPCR 3“.
23
DEN 4
Časový harmonogram
8:30 DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 2 (Jan Skalák)
Konfokální mikroskopie, FLIM-FRET a buněčná lokalizace proteinů (skupiny 1-4, laboratoř 334)
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 4 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 4 (Jan Hejátko)
Příprava preparátů (skupiny 5-8, laboratoř 334)
11:30 OBĚD
12:30 DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 2 (Jan Skalák)
Konfokální mikroskopie, FLIM-FRET a buněčná lokalizace proteinů (skupiny 5-8, laboratoř 334)
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 4 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 4 (Jan Hejátko)
Příprava preparátů (skupiny 1-4, laboratoř 334)
15:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 5 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 5 (Jan Hejátko)
Automatická mikroskopie (laboratoř 334/1S11)
16:00 UKONČENÍ PROGRAMU 4. DNE
DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 2
Rastrovací (řádkovací) konfokální mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM)
Princip metody
Jedná se mikroskopickou metodu umožňující snímat fluorescenční signál s velmi vysokým rozlišením.
Jako bodového zdroje excitačního světla používáme lasery o různé vlnové délce. Laserový paprsek
prochází konfokální clonkou a prostřednictvím objektivu je fokusován do malého bodu na preparátu,
kde dojde k excitaci fluorescenčních barviček, nebo proteinů. Emitovaná fluorescence prochází zpět
objektivem a skrze další konfokální clonku (pinhole) na fotonásobič, kde je světelný signál převeden
na elektrické impulsy. Konfokální clonka zajišťuje, že se na detektor dostane pouze světlo
z excitovaného bodu v rovině ostrosti použitého objektivu. Světlo přicházející z oblastí nad a pod
rovinou ostrosti je clonkou odfiltrováno. Posunu ohniska skrz celé zorné pole objektivu je dosaženo
plynulým pohybem zrcátka skenovacího zařízení. Protože rychlost jeho pohybu je mnohem nižší než
rychlost světla, jsme schopni pomocí softwaru zrekonstruovat obraz s vysokým rozlišením a zobrazit
ho na monitoru počítače.
24
Obrázek 6. Princip zobrazování pomocí řádkovacího konfokálního mikroskopu
FLIM-FRET – studium protein-proteinových interakcí
Princip metody
FLIM-FRET (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy - Förster Resonance Energy Transfer)
představuje vysoce specializovanou metodu v oblasti biochemického výzkumu dynamicky
proteinových komplexů, umožňující detailní studium interakcí mezi biomolekulami v živých buňkách.
Tato technika spojuje dvě klíčové technologie: mikroskopii sledující fluorescenci GFP (FLIM) a
rezonanční přenos energie (FRET) mezi donorem a akceptorem. Jedná se o neinvazivní metodu, která
poskytuje informace o vzdálenosti a dynamice interakcí biomolekul s vysokým prostorovým a časovým
rozlišením. To z ní činí nepostradatelný nástroj pro studium signálních drah, proteinových interakcí a
buněčných procesů. FRET je založen na přenosu energie mezi dvěma fluorescenčními proteiny, z nichž
jeden (donor) přenáší energii na druhý (akceptor) bez emise fotonu. Tato interakce je citlivá na
vzdálenost mezi fluorescenčními proteiny, což umožňuje měření vzdálenosti na molekulární úrovni.
FLIM-FRET metoda umožňuje studovat i heterogenitu buněčných prostředí.
Obrázek 7. Jablonského diagram demonstrující mechanismus Försterova rezonančního přenosu
energie (FRET). Při absorpci energie jsou elektrony v donoru i akceptoru excitovány ze základního
25
stavu do excitovaného stavu a ztrácejí energii jako fluorescence s rychlostní konstantou kf(D) pro
donor nebo kf(A) pro akceptor a nefluorescenční mechanismy knf(D) pro donor a knf(A) pro akceptor.
Při nefluorescenčním přenosu energie se excitovaná energie donoru ztrácí prostřednictvím FRET na
akceptor s rychlostní konstantou kFRET. Převzato z Shrestha et al. 2015
(https://www.mdpi.com/1422-0067/16/4/6718).
Obrázek 8. Princip detekce protein-protein interakce pomocí FLIM-FRET. Pokud dojde k interakci
mezi dvěma proteiny, přenos energie (FRET) mezi donorem a akceptorem zapříčiní pokles
fluorescence donoru (GFP). Převzato z https://www.becker-hickl.com/applications/fret-imaging/.
Buněčné lokalizace proteinů
POSTUP
1) Připravte si 100 µl pipetu, destilovanou vodu, krycí a podložní sklíčka, která popište.
2) Na střed podložního sklíčka kápněte100 µl vody.
3) Z listu tabáku infiltrovaného v pondělí vystřihněte přibližně čtvercový tvar o ploše 1-2 cm2
a
umístěte ho na kapku tak, aby spodní strana listu směřovala vzhůru.
4) Na spodní stranu listu naneste 100 µl kapku vody, přiklopte krycím sklíčkem.
5) Jemným poklepáním zajistíte dosednutí krycího sklíčka a odstraníte vzduchové bubliny.
6) Zpevněte sklíčka k sobě pomocí lepící pásky.
7) S připravenými preparáty se přesuňte ke konfokálnímu mikroskopu.
8) Pomocí rastrovací konfokální mikroskopie sledujte fluorescenční signál a jeho lokalizaci uvnitř
buněk.
9) Pomocí FLIM-FRET modulu změřte hodnotu fluorescence GFP (tzv. GFP lifetime)
10) Vyhodnoťte výsledky pozorování a vypracujte protokol, ve kterém zpracujte všechny body
uvedené v šabloně. Hodnoty GFP lifetime si studenti mezi sebou předají a budou diskutovat rozdíly
mezi vzorky.
Úkoly:
1. Jaké buněčné kompartmenty vidíte pod kanály GFP a RFP? Přiřaďte k nim jednotlivé proteiny
a diskutujte pozorovanou lokalizaci.
2. Porovnejte mezi sebou hodnoty GFP lifetime všech vzorků: vytvořte tabulku nebo graf a
diskutujte pozorované změny. Která protein-proteinová interakce je dle vašeho pozorování
nejsilnější a nejslabší?
26
Šablona k protokolům: DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup5
:
Závěr6
:
5
Uveďte stručný popis postupu při infiltraci tabákových listů (viz. Metoda Transientní exprese v tabáku 1).
6
Vyhodnoťte interakce a lokalizace proteinů, které vaše skupina zkoumala a shrňte výsledky kolegů z dalších
dvou skupin.
B
D
27
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 4 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 4
Příprava preparátů pro automatickou mikroskopii
POSTUP
Proveďte projasnění odbarvených semenáčků podle následujícího protokolu:
1) Opatrně odpipetujte 80% etanol a přidejte 1 ml 0,25M HCl / 20% MetOH, inkubace 15min při 53
ºC. Roztok opatrně odsát pipetou.
2) 1 ml 7% NaOH / 60% EtOH, inkubace 15 min při rt. Roztok opatrně odsát pipetou.
3) 1 ml 40% EtOH, 10 min, rt.
4) Přidejte 1 ml H2O = 20% EtOH, 10 min, rt. Roztok odsát.
5) 1 ml 10% EtOH, 10 min, rt.
6) +1 ml 50% glycerolu = 5% EtOH / 25% glycerol, 15-30min, rt (on, 4 ºC). Roztok odsát.
7) 1 ml 50% glycerol.
Automatická mikroskopie
POSTUP
1) Vložte preparáty do automatického mikroskopu a nechte snímat pře noc.
DEN 5
Časový harmonogram
8:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 5 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 5 (Jan Hejátko) laboratoř 1S11
Vyhodnocení výsledků automatické mikroskopie (skupiny 1-4)
DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 2 (Jan Skalák) laboratoř 1S13
Konfokální mikroskopie (skupiny 5-8)
9:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 5 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 5 (Jan Hejátko) laboratoř 1S11
Vyhodnocení výsledků automatické mikroskopie (skupiny 5-8)
DETEKCE INTERAKCE PROTEINŮ IN VIVO 2 (Jan Skalák) laboratoř 1S13
Konfokální mikroskopie (skupiny 1-4)
10:00 Kolokvium (C02/211)
ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE 5 a DEXAMETAZONEM
INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ SYSTÉM 5
ÚKOLY
1) Pomocí schématu (viz obr. 9 níže) identifikujte pletiva-buněčné typy, které jsou pozitivní pro GUS
aktivitu
2) Na základě typu reportéru formulujte biologicky relevantní závěr.
28
Obrázek 9. Schéma nejdůležitějších morfologických a anatomických částí semenáčku Arabidopsis
thaliana.
29
Šablona k protokolům: ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FÚZE
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup a výsledky7
:
Závěr:
7
Do protokolu zejména uveďte: název genu analyzovaného promotoru, stručný popis principu metody, zda se
podařilo identifikovat místa specifické aktivity daného promotoru (uveďte stručný výčet barvených
pletiv/buněčných typů) a co lze z tohoto výsledku uzavřít, příp. pro co jej dále použít.
30
Šablona k protokolům: DEXAMETAZONEM INDUKOVATELNÝ TRANSKRIPČNÍ AKTIVAČNÍ
SYSTÉM
Jméno a číslo skupiny:
Datum:
Cíl:
Postup a výsledky8
:
Závěr:
8
Do protokolu zejména uveďte: stručný popis principu metody a popište i) lokalizaci aktivace transgenu a ii)
výhody používání indukovatelných systémů ve srovnání s konstitutivními promotory.