Genové technologie Genová terapie Genová terapie • Nejčastěji se genová terapie používá o monogenních recesivně dědičných onemocnění. Zanesení genu v jedné kopii pak vede k řešení defektu. Říkáme tomu: • Náhradní genová terapie Genová terapie • Ideální dochází k expresi postiženého genu pouze v některých orgánech, takže stačí zanést gen do postižených orgánů a ne do celého těla. Genová terapie • Základními kroky genové terapie jsou: – Identifikace a charakterizace genu – Klonování genu – Výběr vektoru pro přenos genu – Metoda přenosu – Exprese genu Genová terapie • Kopie nemutovaného genu je do těla pacienta vnesena injekčně do krevního oběhu nebo do tkáně, může být také připraven aerosol pro přenos do nosní sliznice nebo plic. Někdy jsou buňky z pacienta odebrány, geneticky upraveny a vráceny zpět do těla – tomu říkáme genová terapie ex vivo. Genová terapie • Nejčastěji se pro přenos genu používá modifikovaný živočišný virus – 70% experimentů s genovou terapií člověka využívá virové vektory pro přenos genu. Tyto používané viry se pak dělí na retroviry a adenoviry. Genová terapie • V malém procentu případů se používá přímo DNA nebo se DNA vpravuje do pacienta v liposomech. Adenovirové vektory v genové terapii • Adenoviry jsou DNA viry s dvojšroubovicovou strukturou DNA • Mají ikosahedrální kapsidu tvořenou 240 hexony • Uvnitř viru je jedno lineární vlákno DNA o délce asi 36000bp • Rozlišujeme asi 50 různých serotypů Adenovirové vektory v genové terapii • Pět stran virové kapsidy se sbíhá do bodu, kde se nachází penton, který se skládá z pentamerové báze a výběžku z trimeru. Výběžek se délkou liší mezi různými skupinami adenovirů a jeho hrot se váže na receptory na povrchu hostitelské buňky. • Receptory nazýváme CAR (coxsackievirus adenovirový receptor) Copyright © 2016 by Elsevier Inc. All rights 10 Adenovirové vektory v genové terapii • Receptory CAR se nacházejí v mnoha živočišných tkáních. Poté co se konec pentonového výběžku naváže na receptor, samotný penton se naváže na integriny hostitelské buňky. Integriny jsou transmembránové proteiny na živočišných buňkách a slouží k adhezi. Poté cytoplasmatická membrána se vchlípí a vytvoří váček. 12 Adenovirové vektory v genové terapii • Váček je poté přenesen do cytosolu a prostřednictvím cytoskeletu putuje k jádru buňky. Před vstupem do jádra je virion rozložen a do jádra vstupuje pouze DNA. • Adenoviry mohou způsobovat závažná zánětlivá onemocnění. Proto jsou před genovou terapií zbavena schopnosti se pomnožovat v hostitelských buňkách. Adenovirové vektory v genové terapii • Delecí genu pro E1A protein dochází k této úpravě adenoviru. Tento protein spouští transkripci tzv. časných virových genů a váže se zároveň na Rb protein hostitelské buňky, čímž odblokuje jeho preventivní působení před vstupem buňky do S fáze. 15 Adenovirové vektory v genové terapii • Takto upravený virus je produkován v laboratoři na buňkách, které ve svém genomu obsahují E1A gen. Takto vytvořený virus se nemůže v hostitelských buňkách při genové terapii replikovat. Adenovirové vektory v genové terapii • Pokud do viru vkládáme nový gen, nesmí být celková délka DNA adenoviru delší ani kratší než o 5%, jinak se neposkládá do kapsidy. To omezuje použití tohoto vektoru na krátké geny. Adenovirové vektory v genové terapii • Problémem adenovirových genových terapií je, že exprese vydrží pouze několik týdnů, dokud imunitní systém nezlikviduje buňky. Pacient si vytváří imunitní odpověď na daný adenovirus a ten nemůže být použit 2x. Nejedná se tedy o dlouhodobou genovou terapii dědičných onemocnění. Používá se spíše na genovou terapii nádorů. Cystická fibróza • Cystická fibróza je nejčastější genetické onemocnění i v české populaci. Přibližně jedno ze dvou tisíc dětí bělošské populace je nositelem homozygotní varianty recesivní mutace. • Gen kóduje takzvaný CFTR protein, který se nachází buněčných membránách jako chloridový kanál. Cystická fibróza • U pacientů s cystickou fibrózou je chloridový kanál defektní a ovlivňuje mnoho tkání, především plicní tkáň. Vede to k nedostatku vody na sliznicích, což vede k častým infekcím způsobeným patogenními mikroorganizmy. Buňky plicní tkáně jsou pak postupně nahrazovány nefunkční vazivovou tkání – vzniká fibróza. Cystická fibróza • Gen CFTR je dlouhý 250 tisíc bazí a obsahuje 24 exonů, které kódují protein o 1480 aminokyselinách. Pouze 2% celého genu je kódující DNA, zbytek jsou intronové sekvence. Např. v USA se nachází v 70% mutace delta 508 (delece 3 bazí pro fenylalanin), v Holandsku způsobuje 90% onemocnění, na Blízkém východu pouze 30% onemocnění. 22 Cystická fibróza • Onemocnění může být způsobeno až 500 různými mutacemi tohoto genu, takže genetický skríning není jednoduchý. Cystická fibróza • K rozšíření mutace došlo zřejmě v Evropě před přibližně 2000 lety v souvislosti s epidemiemi tyfu a moru, kdy mutace bránila dehydrataci při úporných průjmech. Cystická fibróza – genová terapie • Plíce jsou přístupné genové terapii formou aerosolu. Adenovirová terapie s nemutantním CFTR genem byla úspěšná, ale jen 30 dnů, dokud nedošlo k zastavení exprese. V současnosti lze použít pro pacienty s mutací G551D Ivacaftor (Kalydeco), kdy roční léčba se blíží milionu Kč. Retrovirová genová terapie • Využívá se retrovirů. Před vložením genu do retroviru musí být odstraněny introny. • Základní genom retrovirů se skládá ze tří genů – gag, pol a env. • Z vektorů pro genovou terapii se používá například myší leukemický virus (MuLV). Vektor má geny odstraněny, takže nedochází k jeho replikaci. Copyright © 2016 by Elsevier Inc. All rights 27 Retrovirová genová terapie • Vzhledem k tomu, že jsou odstraněny geny retrovirových genomů, nevznikají na retrovirové vektory imunitní reakce ani zánětlivé reakce. Retrovirové vektory začleňují geny do hostitelské DNA. Retrovirové vektory mohou nést jen malé geny (max 8 kb) a nemohou infikovat nedělící se buňky Adeno-asociovaná genová terapie • Genová terapie pomocí adenovirů a retrovirů má svá omezení a z tohoto hlediska se jeví jako slibné adenoasociované viry (AAV). AAV jsou defektní samy o sobě a lze je nazvat satelitními – je třeba, aby buňka byla napadena adenoviry a pak teprve AAV mají nějakou funkci. Adeno-asociovaná genová terapie • Přednostmi AAV jsou: – Nestimulují imunitní odpověď hostitele – Mohou být použity opakovaně – Mohou být kultivovány na mnoha typech buněk – Napadají i nedělící se buňky Adeno-asociovaná genová terapie • Přednostmi AAV jsou: – Integrují se pouze do jednoho místa v genomové DNA – Různé serotypy mohou napadat různé typy tkání Adeno-asociovaná genová terapie • Genom AAV je malý – 4681 nukleotidů • Virus obsahuje ssDNA, polovina virových částic pak obsahuje + a polovina – vlákno. • Při absenci helprového viru se AAV jen integruje do hostitelského genomu a nic nedělá – zůstává latentní. • Funkci helprového viru dělá samotný druhý konstrukt AAV. Adeno-asociovaná genová terapie • Tato genová terapie se zkoumá pro léčbu hemofilie B, muskulární dystrofie, věkem podmíněné makulární degeneraci, Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby atd. Nevirová genová terapie • Nahá DNA nebo RNA • Nukleové kyseliny uzavřené ve fosfolipidových váčcích • Bombardování částicemi – DNA je vázána na kovové částice • Receptorem řízené vychytávání – DNA vázána na protein, ten se naváže na receptor a spolu s proteinem do buňky vstoupí DNA Nevirová genová terapie • Komplexy polymeru s DNA – DNA se váže na pozitivně nabitý polymer, který chrání negativně nabitou DNA. Tyto komplexy jsou pak přijímány buňkou. Toto se používá při ex- vivo genové terapii. • Enkapsulované buňky – celé upravené buňky jsou vloženy do porézního polymerního obalu a injikovány do těla Liposomová genová terapie • 10% genových terapií se provádí pomocí liposomů • Mikroskopické váčky mohou být naplněny DNA nebo jinými molekulami • Liposomy splývají s cytoplasmatickou membránou buněk a jejich obsah se dostává do cytosolu. Je to nespecifické. Copyright © 2016 by Elsevier Inc. All rights 37 RNA v genové terapii • Lze využít anti-sense RNA v potlačení genové exprese, mnohem více se uvažuje o ribozymech, RNA interferenci, miRNA a umělých aptamerech. • Aptamery mohou být oligonukleotidy, které jsou poskládány tak, že se vážou netypicky na specifické proteiny – např. na trombin RNA v genové terapii • Aptamery se používají v léčbě VPMD – Macugen • RNA aptamer se váže na VEGF a brání abnormální vaskularizaci sítnice. Genová terapie umělými nukleázami • Někdy nemusí být gen nahrazen, ale stačí jeho editace. Například lze sestavit dvě FokI restriktázy, které se nacházejí z obou stran místa, které bude štěpeno, tím dochází k lepší specifitě. Pokud se sejdou naproti sobě, vznikne dimer, který provede rozštěpení DNA a buňka má opravné mechanizmy, které štěpenou DNA opraví a zároveň opraví sekvenci Copyright © 2016 by Elsevier Inc. All rights 41 Copyright © 2016 by Elsevier Inc. All rights 42