GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Modelové organismy: Modelové organismy využívané v biotechnologii – bakterie (E. coli), kvasinky (Pichia, Saccharomyces) a houby (Penicillium), Caenorhabditis elegans (háďátko), Drosophila melanogaster, Danio rerio (Dánio pruhované), myš domácí, živočišné buněčné kultury, Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní), viry (bakteriofágy, retroviry). GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy2 Modelové organismy ̶ DNA se nachází ve všech živých organismech a virech ̶ Detailně je zkoumán pouze zlomek tzv. modelových organismů ̶ U modelových organismů dnes známe kompletní genom ̶ Modelové organismy využíváme: - jako model pro studium podobných organismů - v celé řadě biotechnologických procesů GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy3 Bakterie ̶ Tahoun modelových organismů ̶ Tvoří cca. 50% všech živých organismů (5 x 1030) ̶ Schopnost přežití v extrémních podmínkách –teplota (Thermus aquaticus), pH (Acidothiobacillus) ̶ Nejčastěji využívaná je Escherichia coli: - gram-negativní tyčka - na povrchu má cca. 10 flagel a tisíce pili - většina kmenů je neškodná - E. coli O157:H7 – dva toxiny zodpovědné za krvavé průjmy Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy4 Bakterie Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy5 E. coli ̶ Rychlý nárůst kultury ̶ Může růst pouze v médiu obsahujícím minerální soli a cukr ̶ Tekutá kultura vydrží týdny v lednici ̶ Může být zamražena na -70°C až na 20 let ̶ Může růst jak za aerobních tak anaerobních podmínek ̶ Má jeden kruhový chromosom obsahující asi 4000 genů Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy6 Plasmidy ̶ V rámci strategie přežití nutná kompetice s ostatními organismy ̶ Celá řada bakterií sekretuje toxiny nazývané bakteriociny ̶ E. coli produkuje tzv. koliciny (E1, M) – proděravění plasmatické membrány, degradace DNA/RNA ̶ Imunitní proteiny bakterie neutralizují účinek toxinů ̶ Schopnost produkce kolicinů je dána přítomnosti plazmidů (ori místo) ̶ Tyto plazmidy byly modifikovány pro biotechnologické účely Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy7 Plasmid pET28 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy8 ̶ Bacillus subtillis – produkce proteáz a amyláz ̶ Pseudomonas putida – schopnost degradace celé řady aromatických látek ̶ Streptomyces coelicolor – degraduje celulózu a chitin, produkce celé řady antibiotik ̶ Corynebacterium glutamicum – produkce L-glutamátu a L-lysinu ̶ Streptococcus zooepidemicus – produkce k. hyaluronové Bakterie v biotechnologii GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy9 Eukaryota ̶ Celá řada eukaryot je diploidní (dvě kopie každého chromozomu) ̶ Celá řada rostlin je naopak polyploidní (pšenice = hexaploidní, rajče = tetraploidní) ̶ U zvířat je rozdíl v zárodečných a somatických buňkách - z diploidních zárodečných linií vznikají haploidní gamety (vajíčka a spermie) - somatické buňky jsou diploidní – somatické mutace se přenáší v rámci organismu - somatické mutace se nepřenáší na potomstvo ̶ U většiny rostlin jsou buňky totipotentní ̶ U zvířat tuto vlastnost nesou pouze kmenové buňky 10 iPSC (induced Pluripotent Stem Cell) Abbar et al., 2020 ̶ Metoda prvně popsána v práci Takahashi a Yamanaka (2006) na indukci iPSC z fibroblastů ̶ Nutnost exprese 4 transkripčních faktorů - octamer-binding transcription factor 3/4 (Oct3/4), SRY (sex determining region Y)-box 2 (Sox2), Krüppel-like factor 4 (Klf4) a cellular-Myelocytomatosis (c-Myc) (OSKM). GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy11 Somatické mutace Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy12 Kvasinky a Houby ̶ Houby jsou tradičně používány v biotechnologii – Penicillium roqueforti (Roquefort), P. candidum, caseicolum a camembertri (Camembert), Aspergillus oryzae (sojová omáčka), Penicillium notatum (Penicilin), Aspergillus niger (k. citronová) ̶ Obvykle kultivovány v bioreaktorech ̶ Kvasinky mají výhody bakterií i eukaryot ̶ Nejpoužívanější kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae ̶ Genom kvasinek je oddělen jadernou membránou ̶ S. cerevisiae má 16 chromosómu obsahujcích telomery a centromery ̶ Některé kvasinky mají extrachromozolální elementy, tzv. 2.micron circle. GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy13 Kvasinky ̶ Kvasinky se množí pučením ̶ Pučení vytváří identické buňky – dělení mitózou ̶ Kvasinky mají diploidní a haploidní fáze v rámci životního cyklu ̶ Za kritických podmínek kvasinky podstupují meiózu – tvorba haploidních spor, tzv. askospor v asku) ̶ Za příznivých podmínek spory klíčí a vzájemně konjugují za tvorby diploidních buněk ̶ U kvasinek může dojít ke konjugaci pouze mezi dvěma různými pářícími typy (a, a) Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy14 Pichia pastoris GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy15 Caenorhabditis elegans (Háďátko obecné) ̶ Malá nematoda (hlístice) žijící v převážně v půdě s kořenovou zeleninou ̶ Má dvě pohlaví – 99.9% hermafrodit (samooplodnění) a 0.1% sameček ̶ Tělo tvoří jednoduchá trubice pokrytá kutikulou ̶ Uvnitř těla – 959 somatických buněk zahrnujících cca. 300 neuronů ̶ Hlavička má celou řadu senzorických orgánů (chuť, čich, teplota, hmat) ̶ Tělo je průsvitné = snadné použití fluorescenčních technik, generační cyklus 3 dny ̶ Poprvé u něj provedena RNA interference – ideální nástroj pro reverzní genetiku ̶ První známý úplný genom mnohobuněčného organismu (100 MBp) https://www.hsph.harvard.edu/mair-lab/c-elegans/ GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy16 Drosophila melanogaster (octomilka) ̶ Hojně požívaný organismus v genetických studiích ̶ Snadné pěstování , 2-týdenní životní cyklus ̶ Z vajíčka se líhne larva (24h), několik larválních stádií po dospělce ̶ Dostupná celá řada mutantů – identifikace genů podílejících se na vývoji (homologie s člověkem) ̶ Genom má 165 Mb – 3 páry autosomů a X/Y chromosomy ̶ Během rychlého larválního vývoje vznik polyténích chromozómů Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy17 Danio rerio (Dánio pruhované) ̶ Jednoduchý modelový obratlovec využívaný v molekulární biologii ̶ Jednoduché pěstování a množení v akváriích, dostupnost celé řady mutantů ̶ Embryonální vývoj mimo tělo matky, vývoj z jedné buňky po jedince trvá 24 hodin ̶ Embryo je průsvitné – snadné sledování efektu mutací na vývoj ̶ Genom obsahuje 25 párů chromozómů (1700 Mb), 70% genů kódujících proteiny u člověka má ortology u Dánia ̶ Model studia celá řady lidských onemocnění ̶ Embrya jsou často používána pro skríning nových léčiv https://theconversation.com/animals-in-research-zebrafish-13804 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy18 Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní) ̶ Nejpoužívanější modelový organismus v rostlinné genetice a molekulární biologii ̶ Podobná odpověď na stresové faktory a choroby jako hospodářské plodiny ̶ Mnoho genů zodpovědných za vývoj a množení je shodných s hospodářskými plodinami ̶ Snadné pěstování, nenáročnost na prostor, generační doba 6-10 týdnů, mnoho semen ̶ Může být udržována v haploidním stavu ̶ Malý genom – pět chromosomů (125 Mb), 25 000 genů - rýže (430 Mb), 40 – 50 tis. genů - pšenice (17 Gb), rajče (950 Mb), tabák (4.5 Gb) GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy19 Viry ̶ Entity na hraně definice života, patogeny napadající hostitelské buňky ̶ Skládají se z proteinové obálky nazývané kapsida obalující DNA/RNA genom ̶ Nachází se u všech živých organismů (bakterie, rostliny, živočichové) ̶ Bakteriální viry = bakteriofágy (fágy) - přichycení na hostitele - vstup virového genomu - replikace virového genomu - výroba nových virových proteinů - složení nové virové částice - uvolnění virionů z hostitele ̶ Mnoho virů prochází latentní fází – lysogenie u bakterií ̶ Často dochází k integraci voru do genomu hostitele – tvorba proviru (profágu) Clark and Pazdernik, 2016 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy20 Viry ̶ Můžeme rozdělit na základě tvaru kapsidy (sférické, komplexní, vláknité) ̶ Komplexní = bakteriofágy (T4, P1, Mu) ̶ ssRNA viry mají pozitivní (+) nebo negativní (-) genom ̶ Retroviry obsahují reverzní transkriptázu (přepis RNA do DNA), pomocí long terminal repeats (LTRs) se integrují do genomu Clark and Pazdernik, 2016 Zápatí prezentace21 Životní cyklus RNA virů Mechanismus replikace SARS-CoV-2 (+RNA) Mechanismus replikace retrovirů Dubois et al. 2018 V’kovski et al. 2021