MUNI SCI GENOVÉ TECHNOLOGIE Základní technologie rekombinantní DNA: Základní technologie rekombinantní DNA - enzymy, vektory, metody transformace, konstrukce genových knihoven. 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Reštrikční enzymy - Bakteriální enzymy vážící se na specifickou sekvenci a štípající obě vlákna - Ochrana bakterií před cizí DNA (viry) Jsou citlivé na metylaci DNA - Rozlišujeme dva základní druhy: Typ I - štípou řetězec DNA 1000 a více bazí od rozpoznávané sekvence Typ II - štípou řetězec DNA v místě rozpoznávané sekvence (tupé, ostré konce) Počet rozpoznávaných bází určuje míru fragmentace cílové DNA - Spojení fragmentů - ligáza (T4 ligáza) sgttmc-s 5 - gUattc-3 3'- C AA[TTG -5' 3'- CTTAAlG -5' CUT BY Hpa\ CUT BY EcoR1 5'-GTT| IaAC-3' AATTC -3' 3'- CAA TTG -5' 5'- G G "5' 3'- CTTAA BLUNT ENDS STICKY ENDS ligase One piece 2 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Clark and Pazdernik, 2016 M U NI SCI Reštrikční enzymy (struktura) «*kv EcoRV Barnm apoenzyme non-specific DNA complex 3 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA specific DNA complex Clu4' - f T Asp 4 Asp'' N.=<||c*' BamW\ Pingoudand Jeltsch, 2001 MUNI SCI Restriction Fragment Length Polymorphism cc CG GG i T i T Parent 1 Homozygous for the C allele [or CC genotype) A T i T A f CC CG GG Electrophoresis to separate by size Parent 2 Homozygous for the G allele [or GG genotype] Baby Heterozygous for the C and G allele [or CG genotype) 4 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Použití mis-match primerů GGAATCG GGAAACGAGTTA GGAATCG GGAAACG TGTTA Taql - TCGA MU NI SCI Fragmentáza - Používaná k fragmentaci DNA u NGS - Směs dvou enzymů (DNasa I a SD (strand-displacement) polymeráza) SD pol DNAse I - + 1 + + - - + + + 5'. Long dsDNA ^ Fragmented dsDNA 3' 5' Nicking by DNAse I Strand displacement DNA polymerization with SD polymerase 0 Disjointed dsDNA fragments with overlapping sequences 1.5 Kb 1.0 Kb 0.5 Kb 0.1 Kb M1 1 2 3 4 5 M2 Ignatov et al. 2019 5 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA M U NI SCI Klonovací vektory Specializované plazmidy (jiné elementy) nesoucí cizorodou DNA za účelem studia/manipulací V současné době používáme rovněž arteficiální chromosomy a viry Základní vlastnosti klonovacích vektorů: - malá velikost (snadná manipulovatelnost a izolace) - snadný přenos mezi buňkami transformací - snadná izolace z hostitelského organismu - snadná detekce a selekce - výskyt ve větším počtu kopií (kontrola ori místem) - mnohočetné klonovací místo pro vložení klonované DNA - Metoda detekce přítomnosti vložené DNA ve vektoru 6 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Recognition site for restriction enzyme 1 Recognition site for restriction enzyme 3 Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI INSERTIONAL INACTIVATION Klonovací vektory - Možnosti kontroly vložení DNA: - inserční inaktivace (gen rezistence na ATB) - cccB gene (gen smrti interferující s aktivitou DNA gyrázy) https://iink.springer.com/articie/10.1007/BF00280310) - alfa komplementace (p-galaktozidáza) Kvasinkové vektory založená na 2ll circle - ori místo dvou organismů, Cen sekvence - selekce na základě syntézy AK TYPICAL BACTERIAL VECTOR MCS Bacterial Bacterial 4 terminator promotec^^^J^^tepJ^ Yeast origin of replication gene CLONING PLASMID Gene tor antibiotic resistance YEAST SHUTTLE VECTOR Origin and replication genes lor bacteria^^^ Antibiotic J^T^ resistance gene SHUTTLE VECTOR M yeast Leucine biosynthesis VAy gene lor I selection in Origin ol replication (bacterial) / c Multiple cloning site Yeast centromere sequence 7 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Antibiotic resistance gene #1 LIGATE *■< INSERT INTO Vector , ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE #2 ~~ f Cut site Antibiotic resistance gene #2 CELLS CARRYING VECTOR ARE RESISTANT TO BOTH ANTIBIOTICS Insert CELLS CARRYING VECTOR WITH INSERT ARE RESISTANT TO FIRST ANTIBIOTIC ONLY ALPHA COMPLEMENTATION Clark and Pazdernik, 2016 Plasmid Chromosome Plasmid m Chromosome ■ * - lacZ gene lacZ ge^ Mrs SP"1 MCS TRANSCRIPTION AND TRANSLATION TRANSCRIPTION AND TRANSLATION a fragment combines with rest of LacZ protein to form active p-galactoside IS-gal metabolizes X-gal to form blue dye No «fragment so |l-gal is inactive |)-gal cannot metabolize X-gal and bacteria stay white MUNI SCI Virové vektory - Bakteriofágové vektory - upraveny, tak že mohou nést ne-virovou DNA v kapsidě - spojení cos sekvencí = tvorba replikační formy (RF) replikované valivou kružnicí - může být vložen insert o velikosti 37 až 52 kb - využití pomocných virů pro sbalení DNA do virových částic - Cosmidy - vysoce modifikovaný lambda vektor mající pouze cos místa - nutnost sbalení pomocí pomocného fága 8 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA LAMBDA REPLACEMENT VECTOR Integration and recombination 0 kb COSMID 10 Head and tail proteins ONA insert S 20 30 Nonessential region 40 Regulation and cos 48 kb (rr|ay be replaced by cloned DNA) DNA synthesis 50 kl IN VITRO PACKAGING - cos end Linear form -Tail Head INFECTION Bacterial Circular Jjtij^Q^g^ilcfvo^osowe form- Clark and Pazdernik, 2016 Induce k lysis Tails Tails Assembly proteins Assembly proteins Protein D Protein E No pre-heads No pre-heads (due to lack of E) (due to lack of D) (mix) Lambda dna with insert Successful packaging MUNI SCI ARS1 Arteficialni chromozomy - Slouží pro manipulace s velkými částmi DNA (150 - 2000 kb) - Zahrnují: - kvasinkové arteficiální chromozomy (YACs) - bakteriální arteficiální chromozomy (BACs) - P1 bakteriofágové arteficiální chromozomy (PACs) - YACs obsahují centromeru a telomery pro trvalé udržení v kvasince - BACs jsou cirkularizovány a množeny v bakteriích (ori místo a gen rezistence) 9 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA LEU2 CEN3 TEL TEL Transform into yeast spheroplasts TEL LEU2 ARS1 CEN3 TEL trends in Biotechnology Trends in Biotechnology 2000, DOI: (10.1016/S0167-7799(00)01438-4) Escherichia coli MUNI SCI Transformace DNA - Transformace je proces, kterým se cizí DNA zavádí do buňky. - Kompetentní buňky E. coli: - použití vápenatých iontů a teplotního šoku pro zvýšení permeability buněčné stěny a membrány - použití elektroporace pro otevření buněčné stěny a membrány - Kompetentní kvasinky: - kombinace octanu litného, jednovláknové nosné DNA a polyethylenglykolu (PEG) 10 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Before Pulse During E-field Cell membrane Introduce genes/drugs After Pulse Cell "heals" with gene/drug inside + Electric field induces a voltage across cell membrane Chemical transformation Chemical calions ci- HO oil C Electroporation Electroporation Physical transformation N anq-particles lilj (*) U SC I I DNA knihovny - Používané pro: - nalezení nových genů - sekvenaci genomů - porovnání genů z různých organizmů - Základní kroky v rámci tvorby knihovny: - izolace chromozomální DNA - naštěpení DNA restrikčním enzymem - linearizace příslušného vektoru - vložení fragmentů do vektoru - transformace do E. coli Cul site 11 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA PARTIAL DIGESTION WITH 4-BASE SPECIFIC RESTRICTION ENZYME Mixture of fragments, some still with cut sites CLONE FRAGMENTS INTO VECTOR r, O O O TRANSFORM PLASMIDS INTO BACTERIA Plasmid vector Bacterial colonies each carrying different cloned fragment of DNA Bacterial colonies on agar each carry a cloned fragment of DNA TRANSFER TO MEMBRANE OR FILTER LYSIS OF BACTERIAL CELLS AND DENATURATION OF DNA ADD LABELED DNA PROBE Clark and Pazdernik, 2016 Probe binds to DNA from colonies with matching sequences MUNI SCI Eukaryotické expresní khihovny Vektor obsahuje sekvenci nutnou pro transkripci a translaci Konstruovány z komplementární DNA (cDNA) Identifikace nových genů, sestřihových variant LYSE CELLS EXTRACT & PURIFY mRNA Eukaryotic cells mRNA mixture REVERSE TRANSCRIPTASE USING OLISOtdT) PRIMER giT.T.T.T.TJ 3 mRNA cDNA TTTTTT 5 Heteroduplex RIBONUCLEASE H , Single-Stranded 1) DNA POLYMERASE I 2) St NUCLEASE A A A A A A 3 Double-stranded TTTTTT 5 cDNA LIGATE LINKERS WITH CUT SITE Protein ' 5\ bound to membrane ADD ANTIBODY SPECIFIC FOR TARGET PROTEIN ADD SECOND ANTIBODY THAT BINDS FIRST ANTIBODY 12 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA A A A A A A~ TTTTTT. DIGEST WITH RESTRICTION ENZYME Cut site /r- Sticky end LIGATE INTO VECTOR Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI Klonovací strategie - TOPO klonování (Thermo) - využití topoizomerázy I - Vaccinia virus topoizomeráza I specificky rozpoznává sekvenci 5'-(C/T)CCTT-3' - topoizomeráza je kovalentně přichycena na 3'konci vektoru Perform PCR with Taq or a proofreading polymerase. 1. Add 1 ul_ of PCR reaction to 1 uL of TOPO cloning vector. 2. Incubate 5 min at room temperature. 3. Transform the competent E. coli provided. pr ■ na iitc S3 : < / a 1^5 Ž - '.T-.^.^ mum T7 Figure 3. The pCR2.1-TOPO TA Vector. Topoisomerase I recognition sites ífflj \ AGGG I - * TTCCC I 3' phosphate I CCCTT I | GGGA I TOPO TA cloning vector Tatj-amplified PCR product 5 min at room temperatu re 4/ Topoisomerase I is released Ligation complete 13 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA MU NI SCI Klonovací strategie - TA klonování - využití vlastnosti Taq DNA polymerázy přidat na 3'konec A - pMiniT 2.0 (toxic mini-genes) (NEB) - pGEM-Teasy (modrobílá selekce) (Promega) Sapl 2526 Pcll - MIM 2409 Drill 2307 BsaJI 2249 I^Galadosidase X-Gal fco Xmnl 2009 Seal 1890 14 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA Sspl 716 Bani 1568 Ahdl 1521 8mrl 1481 Bpml 1452 BscFI 1436 Bgll 1403 NmeAlll 1373 Xmnl 921 Bcgl 1017 Scal-Rsal 1040 1152 Features within Sequence Flanking the Toxic Mlnigene/Clonlng Site Cloning Analysis Forward Pnmtr PspXĽXhol EUinW Ecc-Rt I t ACT All ATI... Met lie |lntemi[iled) • • • Two Amino Aod Tome Mimgene with Cloning Sila Shown f As diagrammed minigene iwtivatrd if insert doned into silt) Pad Zrai/Aetll EooRI.Xhol Hotlttgl BsmBI s tia All Mi ac6 k* (•*.» i It ico *oü t. - - - > tr_ < LU GATEWAY® CLONING i ENTRY VECTOR ^ Gene of Interest cccB ENTRY ■ I I VECTOR I I aříRl ---^^aOR2 + DESTINATION VECTOR Gene of Interest ccOB Karfí 15 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA AmpR Lfíclonase BP clonase arrP1 DESTINATION VECTOR excision requires int 8 xis i attL t attR bop p ob' prophage aŕ/P2 AmpR KanR Clark and Pazdernik, 2016 MUNI SCI Expresní vektory - Nejčastěji používaný promotor lacUV (upravený lac promotor) - místo pro vazby RNA polymerázy - místo pro lacl represor - místo počátku transkripce - místo ukončení transkripce - Další často používaný promotor je lambda left promotor (PL) - místo pro vazbu lambda represoru aark and Pazdernik, 2016 - nejčastější aktivace zvýšenou teplotou (42°C) - Expresní systémy rovněž využívají promotor vázající pouze RNA polymerázu T7 bakteriofága - kmeny E. coli nesoucí T7 RNA polymerázu po kontrolou induktoru - Expresní vektory často obsahují sekvence pro různé kotvy (6His, Myc, FLAG, S-tag, MBP) 16 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA MU MI SCI Bakteriální expresní vektory - pET, prSET E. coliJl expresní vektory - exprese v buňkách BL21(DE3)pLysS - pMAL expresní vektory - obsahují maltose-binding protein (MBP) 6His i Bsa 1(4576) Earr.1105 1(4357: BSPLU11 1(3622) Sap 10506) B5M107 1(3393) Tth1)) K3337) PI1FI - Ttllllll 5901 Bslľ.171 5877 Sapl 5766 Pdl 5648 Nael-Ngo.MIV 4763—1 % Dralll 4657-^A' Swal 4434 ' AMI 4260 BpulOI 6547 \ I Jul pMAL-plll 6706 bp Mini 431 IMIII 612 Apal - IN|X>MI 638 , EcoRV 879 lípa) 935 Kasl-Narl-Sfol 1070 Acc6>l - K|)lll 1560 - I .ij 1580 Bsroi 1878 Bglll 1947 \ !lin:j;l 2131 IMn! 2202 Blpl 2373 MYC OR FLAG TAG Binds to 6His Antibody or binds to a nickel column Antibody to Myc used to detect expressed protein Cloned gene TRANSCRIPTION & TRANSLATION SLATION Antibody to FLAG used to detect expressed protein 17 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA r,i u n i SCI Kvasinkové expresní vektory - Inducibilní AOX promotor (methanol) - Možnost intracelulární a extracelulární exprese - Exprese v kvasinkách P. pastoris a S. cerevisiae 2CH,Oh CYTOSOL INITIAL OXIDATION PEROXISOME ENERGY METABOLISM NAO-* .NADH. -CO, HjO 1/20, MITOCHONDRIA Xylulose monophosphate cycle rr ► 1/3GAP- Cell ITl.ltlf.il ANABOLISM 18 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Základní technologie rekombinantní DNA 3' AOX1 (TT) Sa/I Comments for pPICZri A 3593 nucleotides 5' AOX1 promoter region: bases 1-941 5' AOX1 priming site: bases 855-875 ofactor signal sequence: bases 941 -1207 Multiple cloning site: bases 1208-1276 c-mycepitope: bases 1275-1304 Polyhistidine (6xHis) tag; bases 1320-1337 3' AOX1 priming site: bases 1423-1443 AOX1 transcription termination region: bases 1341-1682 TEF1 promoter: bases 1683-2093 EM7 promoter: bases 2095-2162 Sh ble ORR bases 2163-2537 CYC1 transcription termination region: bases 2533-2855 pUC origin: bases 2866-3539 (complementary strand) * Pst i is in Version b only C/a i is in Version C only tThs, two Xho I sites in the vector allow the user to clone their gene in frame with the Kex2 cleavage site, resulting in expression of their native gene without additional amino acids at the N-terminus. MUNI SCI