GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese1
GENOVÉ TECHNOLOGIE
Genomika a genová exprese
Rekombinantní proteiny – exprese proteinů v bakteriích, exprese proteinů v eukaryontních buňkách, výhody a nevýhody
jednotlivých expresních systémů
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny2
Rekombinantní proteiny
̶ Proteomika identifikuje relevantních proteiny
̶ Potřeba jejich detailního studia a charakterizace
̶ V případě praktického využití potřeba produkce ve velkých objemech
̶ Přes 100 rekombinantních proteinů je dnes užíváno jako terapeutika
̶ Vyjma protilátek mohou být rozděleny na:
- náhradu za chybějící nebo chybné proteiny
- zvýšení hladiny existujícího proteinu
- inhibici infekčního agens
- přenášení jiných molekul
̶ Exprese genů ve velkokapacitním měřítku přináší celou řadu problémů:
- nestabilita více-kopiových plazmidů, cena antibiotik
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny3
Exprese v bakteriích
̶ Pro zvýšení exprese se používají speciální plazmidy = expresní
vektory
- silný promotor, adekvátní ori místo, selekční marker pro
antibiotikum
̶ Exprese eukaryontních proteinů je více problematická
̶ Nutná záměna promotoru, absence sestřihu, nízká míra
translace
- slabá interakce ribozomu s RBS místem, nestabilita mRNA,
limitní množství tRNA
̶ Nutnost použití speciálně upravených vektorů
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny4
Inzulín
̶ První geneticky upravený (E. coli – 1979) komerčně produkovaný
proteinový hormon (Eli Lilly,1982, https://www.youtube.com/watch?v=3uNsBAbpE-8).
̶ Preproinsulin – Proinsulin - Insulin
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny5
Rekombinantní Inzulín
https://www.youtube.com/watch?v=5eKdZ0dVCCo&t=606s
https://www.youtube.com/watch?v=VKpthcW1llU&t=214s
https://www.youtube.com/watch?v=N7vxq948l-U&t=30s
̶ Epxrese obtížná vzhledem ke komplikovanému
zpracování
̶ E. coli nemůže preproinzulín zpracovat na inzulín
̶ E. coli netvoří správně S-S vazby v cytoplazmě
- možnost využití DsbC - periplazmatické disulfid oxidoreduktázy
̶ Nakonec využit postup dvou arteficiálních
minigenů
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny6
̶ Inzulín má tendenci tvořit hexamery, které jsou neaktivní
̶ Problém v rámci injekčního podání – lokálně vysoká koncentrace
Rekombinantní Inzulín
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny7
Rekombinantní Inzulín
̶ Uvedení „rychlého“ inzulínu (NovoLog) společností Novo - přítomnost mutace ProB28Asp
̶ Později uvedení tzv. „pomalého“ inzulínu (Lantus) společností Sanofi-Aventis - přítomnost mutace
AsnA21Gly + 2 x Arg na konci B-řetězce
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny8
E. Coli OrigamiTM 2
Exprese Oncostatinu M (OSM): A (37°C), B (18°C). C-kontrola bez IPTG,
I-lyzát, P-pelet, S-solubilní frakce (Nguyen et al., 2019, SciRep)
̶ Nesou mutaci v gene thioredoxin reduktázy (trxB) a glutathion reduktázy (gor)
̶ Zvýšení tvorby disulfidických vazeb v cytoplazmě E. coli
̶ Vhodné pro proteiny vyžadující tvorbu S-S můstků pro správné složení
Berkmen, 2012
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny9
Translační expresní vektory
̶ Vytvořené pro expresi proteinů (pET, pRSET)
- maximální inicializace translace
- konsensní RBS místo
- ATG kodón v optimální vzdálenosti 8 bazí od RBS
- klonovací místo přímo v ATG kodónu (Nco I)
̶ Možnost dalších komplikací v rámci skládání proteinu
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny10
Efekt kodónů
̶ Exprese proteinů v jiných organismech (eukaryontní v
bakteriích)
̶ Různé organismy upřednostňují jiné kodóny pro danou AK
- optimalizace použitých kodónů v rámci syntézy genu – až
10ti násobné zvýšení produkce
- dodání tRNA nesoucí vzácné kodóny do organismu
- E. coli ROSETTA – sedm tRNAs pro vzácné kodóny
(AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC, and CGG)
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny11
Toxický efekt nadprodukce
Laktózový operon Operon pro arabinózu
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny12
Autoindukční médium
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny13
Inkluzní tělíska
̶ Špatně poskládané proteiny se hromadí v
inkluzních tělíscích
̶ Molekulární šaperony – napomáhají správnému
sbalení
̶ Možná sekrece proteinů do periplasmy nebo
média
̶ Proteiny lze solubilizovat z inkluzních tělísek
chaotropním činidlem a zpětně poskládat
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny14
Sekrece proteinů
̶ Možná exprese do periplasmy nebo média
̶ Sekrece řízena hydorfobní sekvencí na N-konci štěpenou signální peptidázou
- možné přidání signální sekvence k proteinu (riziko inkluzních tělísek)
- možná fúze s přirozeně sekretovaným proteinem (maltóza-vázající protein v E. coli)
- možná sekrece v gram-pozitivní bakterii (Bacillus)
- využití speciálního sekrečního systému Typu I (sekrece hemolyzinu, E. coli) nebo Typu II (Endotoxin
A, Pseudomonas)
- použití autotransportních proteinů
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny15
Sekrece proteinů
Clark and Pazdernik, 2016
Sekreční systémy typu I a II
Auto-transportní proteiny
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny16
Proteinové glykosylace
̶ Celá řada proteinů u vyšších organismů je glykosylovaná
̶ Glykosylace je nutná pro správnou funkci – např. membránové proteiny
̶ Bakterie provádí O-glykosylaci (u rodu Campylobacter objevena i N-glykosylace)
̶ Eukaryotní organismy mají většinou N-glykosylace
̶ Řešením pro expresi glykosylovaných proteinů jsou hmyzí buňky
- jiný vzor glykosylace oproti savcům
- řešením jsou upravené hmyzí buňky se savčí glykosylační drahou
̶ Změna v glykosylačním vzoru může ovlivnit vlastnosti proteinu
- rekombinantní lidsky erytropoetin obsahuje extra N-glykosylační místo (Asn-Xxx-Ser/Thr)
- nižší afinita k receptoru, avšak delší poločas rozpadu prodlužuje celkově klinickou aktivitu
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny17
Proteinové glykosylace
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny18
Exprese proteinů v eukaryotických buňkách
̶ Celou řadu eukaryotických proteinů je efektivnější
exprimovat v eukaryotických buňkách
̶ Možnost posttranslačních modifikací:
- chemické modifikace tvořící nové aminokyseliny
- tvorba disulfidických můstků
- glykosylace
- přidání funkčních skupin (mastné kyseliny, acetylace,
fosforylace, metylace, sulfurylace)
- odštěpení pre-kurzorových proteinů potřebných pro
sekreci, složení a/nebo aktivaci
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny19
Kvasinky
̶ Pro biotechnologii celá řada výhod:
- snadná kultivace v malém i velkém měřítku
- kvasinka S. cerevisiae považována za bezpečný organismus
- kvasinky sekretují velmi málo vlastních proteinů – výhoda při
sekreci exprimovaného proteinu
- DNA může být snadno transformována (chemicky, enzymaticky,
elektroporací)
- charakterizace celé řady promotorů pro cílenou expresi
- umí celou řadu post-translačních modifikací charakteristických pro
eukaryontní organismy
- glykosylace probíhá pouze u sekretovaných proteinů
̶ Častá sekrece rekombinantních proteinů pomocí signální
sekvence genu pro pářicí faktor a
̶ Signální peptidáza rozpoznává sekvenci Lys-Arg
Clark and Pazdernik, 2016
GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny20
Kvasinky
̶ V současné době exprimovány v kvasince S. cerevisiae a P. pastoris:
- insulin
- srážecí faktor VIIIa
- různé růstové faktory
- virové proteiny pro výrobu vakcín nebo diagnostiky (HIV, HBV,
HCV)
̶ Nejčastější problémy exprese v kvasinkách:
- ztráta expresních plazmidů v rámci velkoobjemových kultivací
- sekretované proteiny zůstávají mezi PM a buněčnou stěnou
- dochází k hyper-glykosylaci sekretovaných proteinů (řešení úpravou
kmenů) Sheng et al. 2017