GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Editace genomu ZFNs, CRISPR/Cas, TALLENs GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu2 Editace genomu • Všechny techniky pracují na základě tvorby dvou-řetězcových zlomů • Tyto zlomy jsou následně opraveny nehomologním párováním konců (NHEJ) nebo homologní rekombinací (HR) • V rámci procesu může dojít k začlenění nového genu nebo vnesení krátké inzerce/delece inaktivujích daný gen • Dvě základní metody pro tvorby dvou-řetězcových zlomů: - endonukleázy nebo restrikční enzymy s dlouhou rozpoznávací sekvencí (až 40 bp) - použití CRISPR/Cas9 systému • ZFNs (Zinc Finger Nucleases) – doména zinkového prstu rozpoznává sekvenci, DNA je štěpena FokI restriktázou. • TALE nukleázy (TALENs) – rozpoznávací doména pochází z TALE (Transcription Activator-Like Effector) proteinu, DNA je štěpena FokI restriktázou GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu3 Editace genomu GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu4 Zinc Finger Nucleases ̶ ZFN je umělá endonukleáza, poprvé úspěšně použita pro editaci genomu v roce 2003 ̶ Skládá se z navržených proteinů majících DNA vazný motiv zinkového prstu (ZFP) spojeného se štěpnou doménou restrikčního enzymu FokI. ̶ ZFN může být přeprogramována tak, aby štěpila nové cíle, a to návrhem ZFPs s novou sekvenční specifitou. GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu5 CRISPR/Cas9 ̶ The Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) ̶ Začleňuje fragmenty cizí DNA (spacery) do CRISPR kazety a poté jsou zpracovány na gRNA ̶ Proteiny Cas zajišťují enzymatický mechanismus potřebný k získání nových spacerů zaměřených na invazivní elementy. ̶ Proteiny Cas (Cas9,Cas12, Cas13 a Cas14) byly využity k vývoji nových nástrojů pro genomové inženýrství. tracr – trans-activating crRNA PAM - Adjacent Protospacer Motif GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu6 Klasifikace CRISPR/Cas9 ̶ V současné době je klasifikováno šest typů CRISPR systémů ve dvou třídách ̶ Třída 1 obsahuje velké multi-Cas komplexy, třída 2 používá jednu DNA endonukleázu Cas9, 12 nebo 13 ̶ V současné době je nejpoužívanější Cas9 z bakterie Streptococcus pyogenes https://doi.org/10.1007/s12033-022-00567-0 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu7 Mechanismus Cas9 proteinu ̶ Cas9 protein má 6 domén ̶ bez gRNA je protein neaktivní ̶ arginine-rich bridge helix iniciuje vlastní štěpení ̶ Po aktivaci Cas9 hledá PAM sekvenci (5´-NGG-3´) ̶ Cas9 štípe dsDNA 3 bp před PAM pomocí HNH a RuvC domén na základě komplemntarity 20nukleotidů na 5´konci gRNA s dsDNA ̶ Výhodou je možnost vícenásobné editace a jednoduchost návrhu ̶ Nevýhodou je vysoký off-target = nCas9 šípající pouze jedno vlákno je částečným řešením https://doi.org/10.1007/s12033-022-00567-0 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu8 Mechanismus Cas9 proteinu GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu9 Mechanismus Cas12 proteinu ̶ větší přesnost než Cas9 ̶ dokáže sám zpracovat crRNA – výhoda při multi- editaci ̶ Obsahuje RuvC a NUC (nuclease lobe) doménu, spacer má 17 bp ̶ Štípe ssDNA i dsDNA ̶ Vuživá se v DETECTR systému pro identifikaci patogenů ̶ Díky dvouvláknovým zlomům je preferovaná oprava HDR a ne NHEJ = snažší provádění inzercí ̶ Málo efektivní u nedělících se buněk GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu10 Mechanismus Cas13 proteinu ̶ Cas13 systém je proti RNA virům ̶ Cas13a obsahuje crRNA, NUC a HEPN (nucleotide binding) doménu, cílová sekvence 22-28 nt, PFS za cílovou sekvencí ̶ 13b štípe jen ssRNA, je přesnější (PFS a PAM) ̶ Kromě editace je používaný pro analýzu SNPs ̶ Využívaný v SHERLOCK systému ̶ Umožňuje specificky zasáhnout pouze vybrané alelické variant v rámci onemocnění ̶ Výhody oproti RNAi strategii, stále však jistý OFF-target GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu11 DETECTR/SHERLOCK GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu12 TALLENs ̶ Proteiny TALE byly poprvé popsány v roce 2009 a pocházejí z fytopatogenních bakterií rodu Xanthomonas. ̶ TALE je zvláštní třída proteinů, které mohou vázat DNA. ̶ Typická jednotka TALEN se skládá z centrální DNA vazebné domény o 12-28 opakováních, jaderného lokalizačního signálu (NLS), domény pro aktivaci transkripce cílového genu a nukleázy Fok1. ̶ Interakční oblast s DNA má 33-35 aminokyselin s polymorfními 12 a 13 opakujícími se variabilními diresidiu (RVD). ̶ Každá repetice se jedinečně váže na jeden nukleotid v orientaci 5′ až 3′ na cílové DNA. ̶ Čtyři nejčastější RVD jsou NN, NG, HD a NI s přednostní afinitou ke G/A, T, C, a A ̶ Pokud seřadíme opakující se RVD v určitém pořadí, je možné vytvořit TALENS s požadovanou sekvenční specifitou. GENOVÉ TECHNOLOGIE – Editace genomu13 TALLENs https://www.youtube.com/watch?app=desktop&v=JArLDYv0Qw4 (ZFNs) https://www.youtube.com/watch?v=YkVVkzA7QpA (TALLENs) https://www.youtube.com/watch?v=MzMsgmeEOhI (CRISPR) https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8 (CRISPR)