MUNI SCI GENOVÉ TECHNOLOGIE Technologie založené na RNA rozdělení RNA, význam ne-kódujících RNA, antisense RNA a umlčování genů, ribozymy 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Technologie založené na RNA Role nekódujících RNA - RNA hrají celou řadu rolí, které jsou široce využívané v biotechnologiích - Nejvíce pochopenou rolí je jejich účast na syntéze proteinů (mRNA, tRNA, rRNA) - Celá řada malých RNA hraje roli v sestřihu mRNA (snRNA, snoRNA, gRNA) - Ribozymy mají enzymatickou aktivitu - štěpení a ligace celé řady substrátů - V posledních letech popsána celá řada nových rolí (ncRNAs) - Některé třídy RNA regulují úroveň translace (antisense RNA) - vazba na komplementární mRNA - RNA hrají rovněž důležitou roli v obraně před RNA viry (RNAi) - Bakterie postrádají RNAi - mají CRISPR systém využívající crRNA 2 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese Role nekódujících RNA Class Abbreviation Size in Nucleotides Role Distribution Transcription Antisense RNA aRNA 19-25 Genetic regulation All organisms Genomic integrity and Protection Piwi interacting RNA piRNA Eukaryotes 25-32 Transposon silencing in germline cells Enhancer RNAs eRNAs 200-500 Genetic regulation Eukaryotes Small-interfering RNA siRNA 22 Defense against foreign RNA Eukaryotes 6S RNA 6S RNA 184 (£ coli) Regulating transcription Bacteria Micro RNA miRNA 22 Regulating mRNA degradation Eukaryotes Telomerase RNA TERC 451 Synthesis of telomeres Eukaryotes CRISPR RNA crRNA 24-48 Defense Bacteria and translation against foreign RNA plus Archaea Circular RNA circRNA 1000 or Regulation Eukaryotes and DNA more of miRNA abundance Xist RNA 17,000 X Eukaryotes chromosome inactivation Long noncoding RNA IncRNA Wide range Various regulatory Eukaryotes Transcription Antisense RNA aRNA 19-25 Genetic All roles regulation organisms Small RNA regulators sRNA <300 Gene Bacteria Enhancer RNAs eRNAs 200-500 Genetic regulation Eukaryotes regulators (various 6S RNA 6S RNA 184(E coli) Regulating Bacteria mechanisms) transcription RNA Guide RNA gRNA Editing of mRNA Protozoa Micro RNA miRNA 22 Regulating mRNA degradation and translation Eukaryotes Processing Small nuclear RNA snRNA 100-300 Splicing of RNA Eukaryotes plus Archaea Circular RNA circRNA 1000 or more Regulation of miRNA abundance Eukaryotes Small nucleolar RNA snoRNA 60-300 RNA nucleotide modification Eukaryotes plus Archaea Long noncoding RNA IncRNA Wide range Various regulatory roles Eukaryotes 3 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese SCI Role nekódujících RNA Size in Class Abbreviation Nucleotides Role Distribution Protein Translation Messenger RNA mRNA Wide range Protein synthesis All organisms Transfer RNA tRNA 70-90 Protein synthesis All organisms Ribosomal RNA rRNA 120, 160, 1868, 5025 Protein synthesis All organisms (sizes shown are for higher animals) Transfer-messenger RNA tmRNA Rescues stalled ribosomes Bacteria Riboswitch 40-140 Controls translation, transcription, or splicing of attached mRNA All organisms (very rare in eukaryotes) Dual-function RNA — Protein coding plus various regulatory roles All organisms Enzymatic Function Ribozymes — >250 Function as enzymes All organisms Signal recognition particle RNA 7SL RNA or SRP RNA 300 Membrane insertion of proteins All organisms TERC RNA 4 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese https://www.youtube.com/watch?v=2NS0jBPurWQ Xist umlčení X-chromozómu Mouse X Chromosome III! I ----Xic -800 Kb (Nora et al. 2012) Xite Cdx4 Chid Tsx \ Tsix Jpx Cnbp2 í ® - moderate DMS reactivity (0.4% < P..,.,(/) < 0.8%) 0 - high reactivity (PM5(/) > 0.8%) - conserved tip (rodents) - conserved bp (mammals) A - consistent mutation [A| - compensatory millation repeat 3 (451 -478) iir .'in' repeat 6 (611 - 639) repeat 7 (665 - 692) w\\\ repeat 2 (379 - 406) %m ,'«/// 1/2 repeat a"' \ '""ri, (709 ■ 727) repeat 1 (333 - 362) 5 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MUNI SCI Piwi- interagujici RNA (piRNA) - 24-30 nukleotidů dlouhé - monofosfátová skupina na 5'konci (U) a 2'0-methylová skupina na 3'konci - Kódovány v genomu v rámci klastrů nebo intronů jiných genů - Sekvence komplementární k endogením transpozónům - Jsou rozpoznávány rodinou Argonaut proteinů, štěpený na malé kousky vázající se na komplementární RNA transpozónů = štěpení zabraňující jejich posunu |>j piRNA gene cluster TRANSCRIPTION 6 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese CUTTING LOADING ONTO PIWI 3' TRIMMING 5' TERMINAL METHYLATION RNA precursor PIWI 3' SAH SAM 2'-OCH, Mature PIWI complex MUNI SCI IncRNA (long non-coding) B Scaffold A Ribonucleoprotein complex r Guide .A u Decoy ^ro enzyme ^ ^ IncRNA IncRNA mechanisms of action r ^^^^^^ /ľ r" F D Chromatin looping E IncRNA sponging miRNA IncRNA as miRNA precursor IncRNA miRNA IncRNA j lncRNA UiUi LiilU uiiu mm miRNAs 7 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MUNI SCI CRISPR - Hlavní ochranný systém před RNA viry u p roka ry ot - Nenachází se u eukaryot, pouze u prokaryot a archaea - Chrání před RNA i DNA viry, cizími plazmidy nebo transpozony - Je založen na paměťové stopě ve formě ^ krátkých DNA sekvencí uložených mezi palindromickými repeticemi - CAS proteiny tvoří RNasy i DNasy - velmi variabilní mezi bakteriemi Virus DNA O Plasmid DNA Acquisition >CD-£H —T«HG»|OGO0íiO» Leader 10 987654321 cos locus CRISPR array (2) Expression ■ 1 Op, TLÍi TL51 íi TI Ti TI Q_J \J Pre-crRNA Cas proteins _ <~) crRNA Plasmid DNA cleaved t (5) Interference Virus DNA cleaved Bhaya et al. 201 8 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MU SC RNA ovlivňuje transkripci - Genová exprese je modulována rovněž RNA - U bakterií se sRNA váží na mRNA a brání transkripci, některé ji naopak aktivují, některé se váží na proteiny (TFs) - U euakryot zabraňují translaci nebo spouští degradaci mRNA microRNA (antisense mechanismus) V lidském genomu přibližně 20-40% protein kódujících genů má antisense partnery (promotor, introny, exony, 3'UTR) - Antisense geny: - cis = vedle nebo uvnitř vlastního genu - trans = jiná lokace v rámci genomu Sense TRANSCRIBE TRANSCRIBE ANTISENSE SENSE NORMAL & ANTISENSE RNA CAN ANNEAL A U G C C G U A A U U C G G .. UACGGCAUUAAGCC _, 9 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MU MI SCI Antisense mechanismy Antisense mRNA >TTTTTT„, 3' Afitsense mRNA S-M?fíSSSAS8S5S8!ř ANTISENSE GENE IN VECTOR 12 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese ANTISENSE & SENSE mRNA ANNEAL 5' i^^^^^^^^^—3 AAGAUGCGCCAAUUGCCGUAGUAA UUCUACGCGGUUAACGGCAUCAUU 3' ^i S' M U NI SCI Modifikace syntetických oligonukleotidů - Zavádění chemických modifikací bazí pro zvýšení stability Použití různých strategií: - fosfor-thio oligonukleotid (rezistentní k degradaci DNasou) - morpholin-antisense nukeotid (rezistentní k DNase a RNase H) - přidání O-alkylu na 2'OH skupinu ribózy (rezistentní k DNase a RNase H) - použití PNAs (rezistentní k DNase a RNase H) - použití chimérických oligonukletidů (rezistentní k DNase) PHOSPHOROTHIOATE V? RNA 2-OMETHYL X O CH3 NORMAL PHOSPHOOIESTER CHIMERIC ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE Morpholino backbone Morpholino backbone (RNaseHR) Phosphorothioate backbone (RNaseHR) (RNaseHs) 13 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese I Bas i / 0= P- 0^,0 3 MORPHOLINO o=> NH C PEPTIDE NUCLEIC ACIDS N-~0 MUNI SCI Antisense terapie - Dostání oligonukleotidů do buňky vyžaduje speciální přístupy - Existuje přirozený neznámý mechanismus vstupu oligonukleotidů do buňky = malá efektivita Možné použití několika technik: - použití liposomů (neutrální, kladně nabité) - kationické polymery (poly-L-lysinem polyethylenimin) - přichycení na bazické peptidy (Tat protein, HA2 podjednotka viry chřipky)^ - použití streptolysinu O = tvorba pórů - mikroinjekce přímo do buňku - seškrábnutí buněk (poškození membrány) LIPOSOMES BASIC PEPTIDES í í I ■ Streptolysin O C J. 14 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MU MI SCI RNA interference - RNA interference (RNAi) - dráha pro genovou regulaci, kde je krátký dvou řetězcový úsek RNA stimuluje enzymatickým komplex degradující mRNA RNAi je popsán u savců, rostlin, hub, červů, hmyzu - RNAi rovněž zabraňuje přesunu transpozonů a je to ochrana před viry u rostlin - RNAi má dvě stádia: - iniciační fáze = tvorba zkrácené dsRNA z virové dsRNA, gDNA, aberantního transkriptu = štěpení endonukleasou Dicer (RNasa z rodiny III, 21-23 nukleotidů) na siRNAs - efektorová fáze = přenos siRNA na RISC (RNA-induce silensing complex) a tvorba ssRNA = po rozpoznání cílové sekvence vazba proteinu z Argonaut (AGO) rodiny = štěpení mRNA - Zesílení celého procesu pomocí RNA-dependentní RNA polymerázy (RdRP) - méně než 50 kopí siRNA vede k úplné degradaci cílové mRNA 15 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MU MI SCI RNA interference SOURCES OF dsRNA RNA viruses have dsRNA intermediates during replication dsRNA region MicroRNAs are iranscnbed Irom genes m tne genome RNA INTERFERENCE dsRNA lllllllllllllllllll lllllllllllllllllllllllll p, RISC lllllllllll ......" RISC CLEAVES TARGET mRNA RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE BINDS TO RNA FRAGMENT RdRP ^IX. Jk 3' MORE dsRNA IS SYNTHESIZED I I I I I I I ....... DICER MAKES MORE siRNAS r RdRP SYNTHESIZES SECOND STRAND i' I I I I I I I ......1 DICER MAKES siRNA P p RISC BINOS REPETITIVE DNA HISTONE MODIFYING ENZYME & SILENCING PROTEINS HISTONE METHYL TRANSFERASE FORM HETEROCHROMATIN RISC UNWINDS siRNAS RISC BINDS TO COMPLEMENTARY MESSAGE AND DEGRADES IT 16 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese ACTIVATES MORE RISC TO DEGRADE TARGET mRNA P RISC "'"t Repetitive DNA MUNI SCI Technologie RNAi u háďátka ctená dsRNA vector C. elegans dsRNA C. elegans dsRNA Ne?dle Gonad C. elegans eggs GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese Gene to be suppressed by RNAí PCR AMPLIFY WITH PRIMERS CONTAINING PHAGE PROMOTER SEQUENCES promoter Phage promoter IN VITRO TRANSCRIPTION WITH PHAGE POLYMERASE MAKES DOUBLE-STRANDED RNA 5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTľ3' 3ÜUIUUUIUIIUL 5' ADD PURIFIED DICER 3' 5' 5' 3' 3' 5 5' 3' ADD TO MAMMALIAN CELLS Bacterial origin, etc. Antibiotic for bacteria TRANSCRIPTION shRNA NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGGC °~~ MUNI SCI NUCLEUS Modulace genové exprese - MicroRNAs (miRNAs) mohou modulovat genovou expresi - Popsáno prvně v rámci vývoje háďátka - miRNAs regulují genovou expresi blokací translace - miRNAs jsou dnes popsány u rostlin i člověka - miRNAs blokují začátek translace nebo se váží na 3'UTR oblasti - Prvně dochází k tvorbě prekurzorové pri-miRNAs (cca. 70 nukleotidů) - Endonukleáza Drosha štěpí pri-microRNA na pre-miRNAs - Enzym Dicer rozpoznává stem-loop strukturu a odštěpuje smyčku - RISC komplex separuje řetězce od sebe 18 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese 5' Gene for miRNA I Transcription O pri-miRNA 5' 3' ^ (p Drosha !sQQ pre-miRN/ Nuclear pore •Nuclear membrane sQQ CYTOPLASM l Dicer 3^§; miRNA i (^u^^^1 RISC (Argonaut) Imperfect match — AAAA 80S Ribosome Translational repression MUNI SCI Ribozyme Riboswith B. subtilis Riboswithes LOW UDP-GfcNAc CONCENTRATIONS Riboswitch gimS gene ATTENUATION MECHANISM TRANSLATIONAL INHIBITION Base ^ W pairing^*!—I CONTINUED TRANSCRIPTION 5' end (j) mRNA TRANSLATION PROCEEDS Glutamine lructose-6-P a m I d ol ransle rase Fruclose 6-P gluwmme Signal metabolite Signal metabolite binds Shine-Dalgarno sequence Start codon GteN6P Cell wsl synthesis Terminator Signal metabolite binds HIGH UDP-GlcNAc CONCENTRATIONS PREMATURE TERMINATION uuuu^M 5^ end® mRNA B Shine-Dalgarno sequence TRANSLATION (3) PREVENTED Coding sequence^ glmS gene R bomftch 3el 3° 19 GENOVE TECHNOLOGIE - Genomika a genovä exprese MUNI SCI Ribozymy - RNA molekuly vázající se na specifické místo a katalyzující enzymatickou reakci - Některé jsou asociované s proteiny - V současné době popsáno osm základních tříd - Velké ribozymy (stovky-3000 bp): - samosestřižné introny skupiny I Tetrahymeny (nálevník) - mitochondrie, chloroplasty, viry, jaderné rRNA geny) - samosestřižné introny skupiny II (mitochondrie, chloroplasty, řasy) - nesestřihují se in-vitro - Rnasa P u bakterií - asociace s proteinem, štěpení 5'konce pre-tRNA molekul -Malé ribozymy nV%ptJXjf - hammerhead a hairpin ribozymy (viroidy, virusoidy a satelitní viry) 20 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese MU MI SCI GROUP II SELF-SPLICING ► + Exon 1 Exon 2 21 GENOVÉ TECHNOLOGIE - Genomika a genová exprese GROUP I SELF-SPLICING G - OH MUNI SCI Ribozymy Hammerhead (Viroidy) (-) (-) (-) -1-1- (+) (+) (+) -1-1- SELF-CLEAVAGE BY HAMMERHEAD RIBOZYME MOTIF ( + ) (+) (+) ooo Hairpin ribozym —yuuGut —kkklki /A 'gaa CAGU- éuéÁ1 A-U A C-G C-G A-U „G~CA A Au G U A A Ac UA A«G C-G A-U C-G G U U (CV\ 5» 22 GENOVÉ TECHNOLOGIE - GeHt^rTT^^^^^T^r^^^l^P 5' Target mRNA ANTISENSE RIBOZYME 3'— i 5' 5'. .3' 5' RIBOZYME CAN DEGRADE MORE mRNA AAAA(n) 3' AAAA(n) 3' AAAA(n) 3' ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE 3' 5' 5'. BLOCKS TRANSLATION OR RECRUITS RNASE H OLIGONUCLETIDE NOT REUSABLE AAAA(n) 3' MUNI SCI