FRET
Förster resonance energy transfer
Fluorescence Resonance Energy Transfer
FRET
• FRET je Förster Resonance Energy Transfer
• Transfer – Försterův rezonanční energetický
transfér (Theodor Förster, 1910-1974)
• Někdy nazýván také Fluorescence Resonance
Energy Transfer (hlavně v chemické analýze a
biologii, kde je sledována výsledná luminiscence)
• přenos energie mezi dvěma fluorofory vzdálenými
10-100 Å
1. první fluorofor (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou
2. místo fluorescence je energie přenesena na druhý fluorofor
(akceptor)
3. Akceptor vyzáří přijatou energii ve formě světla
Podmínky:
a) vzdálenost mezi molekulami je menší, než 100 Å
b) emisní spektrum donoru se překrývá se absorpčním (excitačním)
spektrem akceptoru
c) molekuly mají stejně orientovány dipólové momenty
Využití FRET: schéma
M 1
M 2
molekula 1
F1
F2
F1
F2molekula 2 F2
FRET
Základní vztahy
• účinnost FRET E je definována:
• kde τ'D a τD jsou fluorescenční časy vyhasínání v
přítomnosti a bez přítomnosti akceptoru
• F´D a F jsou intensity fluorescence v přítomnosti a bez
přítomnosti akceptoru
Základní vztahy
• účinnost (E) závisí na vzdálenosti mezi donorem a akceptorem (r)
• R0 je Försterova vzdálenost při které je účinnost přenosu 50%
• R0 závisí na integrálu překryvu emisního spektra donoru a
absorpčního spektra akceptoru (J)
• κ2 je faktor zahrnující dipólové orientace, pro volně rotující molekuly
je většinou 2/3
• n je refrakční index, Q0 je kvantový výtěžek samotného donoru
FRET
www.anaspec.com
FRET
www.anaspec.com
Aplikace
• sledování strukturních a konformačních změn (dvě molekuly
(případně dvě části molekuly) jsou označeny donorem a
akceptorem a sledujeme zda dochází k výměně energie
• sledujeme: studium struktury proteinů, polynukleotidů, DNA,
protein-protein interakce, DNA-protein interakce, atd.
• analytické aplikace
Sledováni změn konformace
molekuly
• např. sledování změn struktury proteinu, případně jiných
biopolymerů
• nevýhoda: ovlivnění struktury navázáním fluoroforů
F1F1
F1
F1
FRET
KONFORMACE 1
KONFORMACE 2
Sledování interakcí mezi vlákny
DNA
• vzdálenost mezi vlákny DNA spojenými vodíkovými můstky je 30-60 Å
• na větší vzdálenosti: donor obsahuje Ln3+
Analytické aplikace FRET
www.invitrogen.com
Analytické aplikace FRET
BRET
• BRET: Bioluminescence Resonance Energy Transfer
• Využití metody FRET je při analýze někdy limitováno potřebou
excitace „vnějším“ světelným zdrojem („photobleaching“, excitace
jiného fluoroforu)
• v případě BRET je zdrojem světla bioluminiscenční reakce
(nejčastěji se využívá luciferasa z renilla reniformis)
• sledování interakcí v živých organismech
Homo-FRET
• Studium interakce dvou prakticky totožných fluoroforů
• Po excitaci může dojít k přenosu energie, ale světlo
emitované akceptorem bude mít stejnou vlnovou délku
jako světlo vyzářené donorem
• Proto se sleduje zda dochází k polarizaci světla (využití
fluorescenční anizotropie)
• Většinou se to týká studia biologických vzorků (např.
proteinů)
Bimolecular fluorescence
complementation
• Alternativou k FRET (nebo BRET) je BiFC
• Pro studium interakce proteinů nebo jiných
biomolekul
• Dvě biomolekuly jsou označeny komponentami,
které při interakci vytvoří fluoreskující komplex
• Fluoreskující komplex je vytvořen po cyklizační
reakci
• Nejčastěji se využívá YFP
Chemiluminiscence
Chemiluminiscence
• zdrojem excitace je chemická reakce
• Základní schéma možné reakce
• z reakce jedné molekuly ~ jeden foton
• při reakci se dále uplatňují katalyzátory, kovy (a
ionty kovů), vnější prostředí (zejména
hydrofobicita)
• téměř vždy se jedná o OXIDACI
A + B → X* → Produkt + světlo
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Chemoluminescent_reaction.jpg
Excitovaný meziprodukt
AB* → AB + foton
AB* + D → AB + D* → AB + D + foton
AB* + C → AC + B
AB* → A + B (disociace)
…a další možnosti de-excitace
Chemiluminiscenční reakce
• zpravidla oxidační, exotermická reakce s přebytkem
energie, kterou je možné využít k excitaci molekuly
(nejlépe bez „zbytečných“ energetických ztrát)
• emise fotonů musí být umožněna při návratu elektronů
do základního energetického stavu
• intenzita chemiluminiscence je dána vztahem:
ICHL= ΦCL(–dA/dt)
Příklad chemiluminiscenční reakce
– oxidace luminolu kyslíkem
Chemiluminiscenční reakce
• reakce luminolu v zásaditém prostředí s kyslíkem
(peroxid, vzdušný kyslík) → modře fluoreskující roztok
• jestliže jsou v roztoku obsažen také Fe2+, nebo Cu2+
(katalýza reakce) dochází k zvýšení intenzity
luminiscence
http://people.howstuffworks.com/luminol.htm
23
Barevná chemiluminiscenční světla
bis(2,4-dinitrophenyl)ethanedioate (DNPO)
Ar-O-C-C-O-Ar + H2O2 → „intermediát“ → 2ArOH + CO2 + světlo
II
O
NO2
NO2
O2N
O2N
OO
O O
II
O
„intermediát“ + fluorofor → 2 ArOH + fluorofor* → fluorofor + světlo
24
Barevná chemiluminiscenční světla
Vhodné fluorofory: rhodamin B (červená barva), rhodamin 6G
(oranžová), rubren (žlutá), 9,10 – bis fenylethinyl atracén (zelená),
9,10 – difenylatracén, další...
Chemiluminiscence v analytické
chemii
1. přímá analýza – chemiluminiscenčí činidlo přímo
reaguje s analytem
2. nepřímá analýza – reakce chemiluminiscenčního
činidla je katalyzována/inhibována nebo jinak
ovlivněna analytem
Přímá analýza
• analyt je oxidován pomocí oxidačního činidla: KMnO4, peroxid, O2, Ce4+,
[Fe(CN)6 ]3-, tris (2,2´-bipyridin)ruthenium(III) komplex, jodistan N-
bromosukcinimid
• analytem mohou být například fenoly, polyfenoly (quercetin, katechin,
atd.), indoly – alkaloidy (brucin, strychnin, atd.), heterocykly (penicilin,
atd.)
• Lze využít zesilovačů: polyfosfáty
Oxidace v plynné fázi
• Jedna z nejstarších známých chemiluminiscenčních reakcí –
„hoření“ bílého fosforu
• Elementární bílý fosfor se na vlhkém vzduchu oxiduje a dochází k
emisi zeleného světla
• Podobnou reakcí je oxidace oxidu dusnatého ozónem
• Využívá se pro stanovení NO ve vzduchu
• Lze stanovovat i NO2 (redukce na NO a následná oxidace)
• LOD mohou být až 1ppb NO
Chemiluminiscenční analýza –
příklady stanovení
Analýza plynů: NO, ozón, po převedení i další
dusíkaté sloučeniny, síra a její sloučeniny
Instrumentace pro
chemiluminiscenční analýzu
Ref: H. Sklenářová, Škola molekulové spektrometrie (2013)
Elektroluminiscence
Elektroluminiscence
• materiál emituje světlo působením
procházejícího proudu, nebo působením
elektrického pole
• většinou se jedná o tzv. radiační
rekombinaci (zánik páru díra-volný
elektron)
• příklady elektroluminiscenčních materiálů:
ZnS dopovaný Ag, nebo Cu
Electroluminiscence
Elektroluminiscence je výsledkem radiační rekombinace elektronů a děr v
materiálu, obvykle v polovodiči. Vzbuzené elektrony uvolňují svou energii jako
fotony – světlo. Před rekombinací mohou být elektrony a díry odděleny buď
dopováním materiálu za vzniku p-n přechodu (v polovodičových
elektroluminiscenčních zařízeních, jako jsou světelné diody), nebo excitací
nárazem vysokoenergetických elektronů urychlených silným elektrickým polem
(např. s fosfory na elektroluminiscenčních displejích).
Electrogenerated
chemiluminescence (ECL)
• je druh luminiscence vznikající během elektrochemických reakcí v roztocích. Při
elektrogenerované chemiluminiscenci podléhají elektrochemicky generované meziprodukty
vysoce exergonické reakci za vzniku elektronicky excitovaného stavu, který poté při relaxaci
emituje světlo do stavu nižší úrovně.
• Tato vlnová délka emitovaného fotonu světla odpovídá energetické mezeře mezi těmito dvěma
stavy Excitace ECL může být způsobena přenosem energetických elektronů (redox) reakcemi
elektrogenerovaných látek. Takové luminiscenční buzení je formou chemiluminiscence, kdy se
jedna nebo všechny reaktanty vytvářejí elektrochemicky na elektrodách.
• ECL je obvykle pozorován při aplikaci potenciálu (několik voltů) na elektrody elektrochemického
článku, který obsahuje roztok luminiscenčních látek (polycyklické aromatické uhlovodíky, kovové
komplexy, kvantové tečky nebo nanočástice) v aprotickém organickém rozpouštědle (složení
ECL). V organických rozpouštědlech mohou být jak oxidované, tak redukované formy
luminiscenčních látek produkovány na různých elektrodách současně nebo na jedné elektrodě
tím, že se jejich potenciál rozkládá mezi oxidací a redukcí. Excitační energie se získává
rekombinací oxidovaných a redukovaných látek. Ve vodném médiu, které se většinou používá pro
analytické aplikace, je obtížné dosáhnout současné oxidace a redukce luminiscenčních látek kvůli
elektrochemickému štěpení vody samotné, takže se používá ECL reakce s ko-reaktanty. V
pozdějším případě jsou luminiscenční částice oxidovány na elektrodě spolu s ko-reaktantem,
který po některých chemických přeměnách poskytuje silné redukční činidlo (mechanismus
oxidativní redukce).
• ECL se ukázala jako velmi užitečná v analytických aplikacích jako vysoce citlivá a selektivní metoda. Kombinuje
analytické výhody chemiluminiscenční analýzy (absence optického signálu pozadí) se snadnou kontrolou reakce
aplikací elektrodového potenciálu.
• Jako analytická technika představuje vynikající výhody oproti jiným běžným analytickým metodám díky své
všestrannosti, zjednodušenému optickému nastavení ve srovnání s fotoluminiscencí (PL) a dobré časové
a prostorové kontrole ve srovnání s chemiluminiscencí (CL). Zvýšené selektivity ECL analýzy je dosaženo změnou
potenciálu elektrody, čímž se řídí druhy, které jsou na elektrodě oxidovány/redukovány a účastní se ECL reakce
(viz. elektrochemická analýza). Obecně používají komplexy ruthenia, zejména [Ru (Bpy)3]2+ (který uvolňuje foton při
~620 nm) regenerující se pomocí TPrA (Tripropylamin) v kapalné fázi nebo na rozhraní kapalina-pevná látka. Lze jej
použít jako monovrstvu imobilizovanou na povrchu elektrody nebo jako ko-reaktant nebo běžněji jako značku a
používá se v HPLC, označené Ru imunoanalýzy na bázi protilátek, sondy Ru Tagged DNA pro PCR atd., biosenzory
založené na generování NADH nebo H2O2, detekci oxalátů a organických aminů a mnoho dalších aplikací a lze je
detekovat od pikomolární citlivosti až po dynamický rozsah o více než šesti řádech. Detekce fotonů se provádí
pomocí fotonásobičů nebo křemíkové fotodiody nebo pozlacených optických senzorů. Význam detekce technik ECL
pro biologické aplikace je dobře prokázán. ECL je hojně komerčně využíváno pro mnoho klinických laboratorních
aplikací.
Triboluminiscence
Triboluminiscence
• při škrábání, drcení, nebo tření může dojít
k přerušení asymetrických vazeb krystalu
(cukr, diamant)
• náboj je po přerušení asymetrických
vazeb nerovnoměrně rozložen
• při vyrovnání nábojů v krystalu dochází k
luminiscenci
Triboluminescence
Thermoluminiscence
• přírodní krystalické materiály obsahují poruchy v krystalické mřížce
(např. obsahují volné ionty, které narušují elektrické pole krystalu)
• jestliže se vytvoří tzv. potenciálová díra v elektrickém poli, může se
v ní usadit volný elektron (elektronová past)
• tento volný elektron může být excitován (vesmírné záření,
radioaktivita) a v elektronové pasti může být jeho energie
zachována i stovky, nebo tisíce let
• termoluminiscenční datování: zahříváním, nebo po ozáření silným
světlem získá elektron v tzv. dlouhodobé elektronové pasti dostatek
energie, aby se uvolnil
• uvolněná energie se měří
• vhodné pro datování látek, které byly v minulosti ozářeny
• nutná složitá kalibrace
Thermoluminescence
Thermoluminescence dating
Počet vyzářených fotonů je přímo úměrný době ozáření
https://www.youtube.com/watch?v=tW8q_JfmcbUhttps://www.youtube.co
m/watch?v=hPtCvReouCM
https://www.youtube.com/watch?v=FDAFZuxMdyE
https://www.youtube.com/watch?v=rV4cwUkHXdY
https://www.youtube.com/watch?v=tItOOpyJP5k
https://www.youtube.com/watch?v=lB_g2ddZZYk
https://www.youtube.com/watch?v=LQBjRF9mX1Y
https://www.youtube.com/watch?v=FGzRvYU0e3Q
https://www.youtube.com/watch?v=0BOjTMkyfIA
Luminiscence a struktura látek
Typy přechodů
E
σ
π
n
π *
σ *
hladiny energií molekulových orbitalů
Struktura organických molekul a
luminiscence – základní pravidla
1. luminiscenci většinou nepozorujeme u uhlovodíků bez dvojných
vazeb (σ → σ* přechod)
2. luminscence je vzácná také u nearomatických uhlovodíků s
dvojnými vazbami, někdy pozorujeme slabou fluorescenci
molekul obsahujících karbonylovou skupinu v UV oblasti
(přechod n→π*), nebo u vysoce konjugovaných (ale
nearomatických) molekul (vitamín A)
3. většina aromatických uhlovodíku jeví dobrou luminiscenci (π→π*
přechod)
Základní pravidla
4. Aromatické systémy s přechody n→π* zvyšují intensitu fluorescence
(molekuly obsahují atomy s nevazebnými elektrony – N, O, S). U
jednoduchých molekul obsahujících karbonylovou skupinu (např.
benzofenony), nebo heteroatomy (pyrimidin, pyrazin) je často
pozorována i fosforescence.
5. Skupiny připojené na aromatické jádro často silně ovlivňují
fluorescenční vlastnosti molekuly. Tyto skupiny mohou měnit
polohu nejnižší vibrační hladiny excitovaného stavu (týká se to jak
n→π*, tak i π→π* přechodů) – viz. tabulka.
skupina vliv na ΦF vliv na ΦP
alkyl nepatrný zvýšení
hydroxo, methoxo zvýšení zvýšení
Karboxylová, keto velké snížení velké zvýšení
Nitro, nitroso snížení zvýšení
amino zvýšení zvýšení
sulfhyrylová snížení sulfonová
nepatrný kyano
zvýšení X
snížení zvýšení
O OO-
COO-
OO-
COOFluorescein
(výborné
fluorescenční vlastnosti)
Fenolftalein (barevný, ale
nefluoreskující indikátor)
6. molekuly s planární a rigidní strukturou mají vyšší kvantový
výtěžek, než molekuly s velkým stupněm volnosti (konjugace
takových systémů je vyšší, interakce se solventem je nižší
(fluorescein x fenolftalein, různá fluorescence isomerů též
molekuly).
6. jestliže je na aromatickém jádře halový prvek můžeme
pozorovat tzv. efekt těžkého atomu: přítomnost
těžkého prvku zvyšuje pravděpodobnost přechodu na
S0 → T1, což má vliv na zvýšení ΦP.
7. jestliže jsou aromatická jádra téže molekuly oddělena
alkyovou skupinou je systém slabě, nebo vůbec
konjugován (menší kvantový výtěžek, nižší vlnová
délka emise).
Vzorec Název λex λem ΦF ΦP
Benzén 205 278 0.11 0.26
Nafatlén 286 321 0.29 0.1
Antracén 365 400 0.46 0.01
Naftacén 390 480 0.60 Luminiscence
a struktura
přechod π→ π* čím více je v molekule konjugovaných vazeb, tím
vyšší má emitované záření vlnovou délku
Luminiscence organických
molekul: ukázky
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
6,50
7,00
270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470
l [nm]
IF[a.u.]
Trp
Tyr
Phe
0
7.0
Absorpce Fluorescence
Aminokyselina Vln.délka
(nm)
Abs.
koeficient
Vln.délka
(nm)
Kvantový
výtěžek
Tryptofán (Trp) 280 5,600 348 0.20
Tyrosin (Tyr) 274 1,400 303 0.14
Fenylalanin (Phe) 257 200 282 0.04
1. P. Pekárková, Bakalářská práce, 2005
2. www.biotek.com
Chinin
emisní maximum: 446 nm
excitační maximum: 349 nm
Stokesův posun: 97 nm
Deriváty fluoresceinu
excitační maximum: 494 nm
emisní maximum: 520 nm
Syntéza fluoresceinu
Kondenzační reakce ftalanhydridu (půl lžičky) s resorcinolem (půl
lžičky)
Aplikace fluorescenční
spektroskopie v hydrogeologii
Migrace podzemních vod
• sledování a objasnění systému
podzemních řek a potoků v
krasových oblastech (propadání a
vývěry...)
• sledování toku vody z
kontaminovaných míst (např.
úložiště odpadů, skládek, atd.)
Fluorescenční „značkovače“
podzemních vod
• fluorescenční „značkovače“ (tracer) jsou obvykle ve vodě rozpustné,
silně fluoreskující látky (fluorescein, rhodamin, eosin, erythrosin,
atd.)
• jestliže dochází k velikému zředění barviva, lze použít např.
hydrofobní sběrné patrony
• k detekci lze použít jak LIF, tak spektrofluorimetr vybavený lampou (i
detekce několika barviv zároveň)
• lze sledovat i časový průběh průchodu barviva potokem/řekou. Z
rychlosti průtoku, zředění značkovače, vzdálenosti a dalších faktorů
lze usuzovat na charakter, délku, případně členitost podzemního
systému.
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20
intensity(a.u.)
time (hours)
Mapování podzemních vod
P. Taborsky, analýza, 2007.
59
„Mapování“ podzemních vod
60
Fluorescein na Den svatého
Patrika
Deriváty rhodaminu
0
1
2
3
4
5
550 600 650 700 750
Vlnová délka [nm]
IF
Fluorofory s emisním maximem v
oblasti kolem 600nm
Luminiscence anorganických
„species“ v roztoku
1. slabě fluoreskující ligand má komplexaci lepší
fluorescenční vlastnosti (nebo obráceně...)
2. ionty kovů (zejména f-prvky), nebo jejich
„species“ jeví fluorescenci (někdy také
fosforescenci) v roztoku i bez komplexace
3. „anorganická“ luminiscence pochází z
komplexů z nefluoreskujícími ligandy
Zlepšení luminiscečních vlastností
po komlexaci (1)
• kov nijak neovlivňuje fluorescenční vlastnosti, jen
stabilizuje organické ligandy tak, aby byl upřednostněn
zářivý proces deexcitace
• kov může také v některých případech zhášet luminiscenci
• obou jevů lze využít pro analytické stanovení, nejedná se
však o příliš selektivní metodu
Luminiscence anorganických „species“ –
luminiscence nekomplexovaných iontů v
roztoku (2)
• lanthanité ionty (např. Eu3+, Tb3+, Gd3+, a další)
• některé aktinoidy (např. UO2
+, Th(I))
• závisí i na okolí „species“ – pH, komplexace, teplota, atd.
• jedná se o přechody mezi f-f, případně d-f elektronovými přechody
• pro emisní spektra jsou obvyklé ostré píky, čas vyhasínání
luminiscence je extrémně dlouhý (až ms)
Luminiscnce Lanthanoidů(III)
Některé komplexy Ln(III) mají velmi neobvyklé spektrální vlastnosti:
• dlouhý čas vyhasínání luminiscence
• Stokesův posun může být i více než 100 nm
• emisní spektrum obsahuje ostré píky
Anténový efekt (antenna effect)
Koordinace molekuly vody do
vnitřní sféry Ln3+
q = 1.05 x (H2O
-1 - D2O
-1)
q = 1.05 x (H2O
-1 – 0.7)
q = 1.11 x (H2O
-1 - D2O
-1 - kXH)
OH2
OH2
OH2
OH2OH2
OH2
OH2
OH2
OH2
OH2
Eu
3+
N
N O
OH
O
OH
O
OH
O
OH
OH2
OH2
OH2
N
N O
O
-
O
O
-
O
O
-
O
O
-
Eu
3+
EDTA+ [Eu(H2O)9]3+, pH = 1.5, q = 9, CN = 0
Eu(EDTA)-, pH = 10.0, q = 3, CN = 6
Komplexy s nefluoreskujícími
ligandy (3)
Většinou jde o tzv. C-T (charge-transfer)
přechody: přenos náboje mezi ligandem a
iontem kovu, dochází k přechodu elektronu z
orbitalu atomu s výrazně vyšší elektronovou
hustotou do orbitalu jiného atomu s menší
elektronovou hustotou (buď přechod M-L,
nebo L-M), tyto přechody mají vysokou
intenzitu v porovnání s přechody d-d.
Komplexy s nefluoreskujícími
ligandy
• jde o poměrně specifické chelatční reakce
• iontem je často diamagnetický kov
• vznik fluoreskujících komplexů je často
používán v analytické chemii pro svoji
specifitu
Komplexy s nefluoreskujícími
ligandy – příklady
Komplexující činidlo Iont kovu
8-hydroxychinolin Al3+, Be2+, Zn2+ , Li+, Mg2+
a další
Flavonal Zr2+, Sn4+
2-(o-hydroxyfenyl)
benzoaxazol
Cd2+
1,10 - fenntrolin Ln3+
Různá azobarviva Al3+, Be2+, In3+, Hf(IV),
Th(IV), Sc3+, Ca2+, Mg2+,
Sn(IV), Y3+
Benzoin B4O7
2-, Zn2+
Luminiscence pevných látek
• luminiscence většiny molekul v pevném stavu je
podobná luminiscenci v roztoku
• vibrační přechody jsou omezeny, proto není
luminiscence pevných vzorků tolik závislá na
teplotě a píky emisního spektra jsou zpravidla
ostřejší
• zvláštním příkladem „inorganic condensed
matters“ (fosfory)
Anorganické luminiscenční
materiály
„fosfory“
Luminescence of localized centers and semiconductors
Localized centers
Transitions between ion levels (f-f transitions, charge
transfer, etc.). Excitation and emission can be both localized
to the same center
Princip
Anorganický fosfor obsahuje:
Aktivátor (activator)– zpravidla iont kovu, např. Cr3+, Eu3+, Nd3+, a další
Aktivátor absorbuje energii (např. UV záření), dojde k excitaci a následné
luminiscenční emisi, ionty aktivátoru jsou rozptýlené v matici
Matice/matrice (host lattice) – většinou průzračná krystalická látka, např. Al2O3,
Y2O3, atd.
Pro luminiscenční vlastnosti je klíčový
aktivátor, matice ovlivňuje hlavně
účinnost celého procesu (dobrý „host“
neodebírá aktivátoru energii)
Nezářivý
přechod
Zářivý
přechod
Ca2(PO4)3F: Sb3+, Mn2+
Matrice může obsahovat dva i více iontů (např. „lampový
fosfor“ Ca2(PO4)3F: Sb3+, Mn2+)
Ultrafialové záření je absorbováno pouze Sb3+ a přijatá
energie je pak vyzářená ve formě světla (emise modrého
světla) nebo předána na Mn2+ (energetický přenos) a
pak vyzářena ve formě žlutého světla. Sb3+ tedy funguje
jako zesilovač pro Mn2+.
Sb3+ + foton → (Sb3+)*
(Sb3+)* → Sb3+ + foton
nebo (Sb3+)* + Mn2+ → Sb3+ + (Mn2+)*
(Mn2+ )* → (Mn2+)* + foton
S*
S
A1*
A2*
A
YVO4:Eu 3+
• Matrice také může někdy sloužit jako
„zesilovač“ (sensitizer)
• Ultrafialové záření excituje vanadyl (host
lattice), ale energie je předána na Eu3+
• Podobným příkladem je ZnS:Ag+
Solid luminescent materials
Examples of the most important
„phosphors“
Jihlavské podzemí
http://www.youtube.com/watch?v=mQWh8Oc0kDU
86
Místnost s fosforeskujícím nátěrem na hradě Špilberk
Excimery a exciplexy
• excimer (excitovaný dimer) se tvoří,
jestliže spolu reagují dvě excitované
částice
• jestliže se jedná o dvě různé excitované
„species“, tak vzniká exciplex
Excimery a exciplexy
• zářivá deexcitace excimeru (fluorescence)
• nezářivá deexcitace
• excimer reaguje s jinou molekulou (např.
Diels-Alderova reakce)
Excimery a exciplexy
Kvantové tečky (quantum dots)
• agregovaný shluk stovek až tisíců atomů
• jejich vodivostní a spektrální vlastnosti jsou
velmi odlišné od chování samotných atomů –
tvorba nových degenerovaných orbitalů
• polovodičové nanokrystaly
• „laditelná“ fluorescence
• nejčastěji jde o kovové atomy (např. Cd, Au,
Zn) rozptýlené v přebytku jiných atomů (S,
Se, As, atd.)
- délka vazeb:
Cd-S = 0,2 nm
Cd-Te = 0,24 nm
- velikost částice: 3,5 nm
- CdTe – kubická krystalová
mřížka
- počet krystalových jednotek
v jedné nanočástici:
~ 203
- přibližná molekulová hmotnost:
~ 200 000 g/mol
Struktura kvantových teček
Fluorescenční vlastnosti
kvantových teček
• podle složení atomů a postupu přípravy lze ovlivnit jejich emisní a
excitační spektra
Evaluation of the Suitability of Quantum Dots as Fluorescence Standards, A.
Knight, J. Gaunt, T. Davidson, V. Chechik a S. Windsor, REPORT 2004
Fluorescenční vlastnosti
kvantových teček
• „laditelná“ fluorescence
• úzké emisní pásy
• široké pásmo absorpce
• špatná rozpustnost
• použití: fluorescenční
standardy, optické prvky,
značení biomolekul...
1.stupeň:
4 NaBH4 + 2 Te + 7 H20 → 2 NaHTe + Na2B4O7 + 14 H2
2.stupeň:
CdCl2 + NaHTe + HS-CH2-CH2-COOH
CdTe nanočástice se vytvoří
po několikahodinovém zahřívání.
Příprava kvantových teček
rozpustných ve vodě
Zdroje světla
vlastní - za vlastní zdroje označujeme taková tělesa nebo látky, v
jejichž struktuře dochází ke vzniku světla. Za vlastní zdroj světla tedy
můžeme považovat např. Slunce, žárovku, plamen atd.
nevlastní - látky, které samy světlo nevytvářejí, ale
pouze odráží a rozptylují dopadající světlo, se označují jako nevlastní
zdroje. Mezi nevlastní zdroje lze zařadit např. Měsíc, mraky, všechny
osvětlené předměty apod. Tyto zdroje lze dále rozlišovat jako:
reflektory - odražeče, neprůhledné, pro dané záření
refraktory - "ohýbače" / "lamače", čiré,
stínítka / matnice, poloprůhledné difuzéry.
Přírodní zdroje
• K přírodním zdrojům patří například:
• Kosmická tělesa
– Primární zdroje - Slunce, hvězdy: Skutečně světlo vytvářejí.
– Sekundární zdroje - Měsíc: Pouze odráží světlo z jiných zdrojů,
samy nesvítí.
• Chemické reakce - oheň, chemiluminiscence
• Biologické zdroje
– Primární zdroje - bioluminiscence: světlušky, různí mořští
živočichové, houby
– Sekundární zdroje - odrazy očí viditelné ve tmě nebo při
záblesku: nebo iridescence i obecně
• Elektrické výboje - elektrický proud v plynech (oblouk,
výboj, blesk)
• Tektonické jevy - žhnoucí láva
Záření černého tělesa
• Absolutně černé těleso, černé těleso a nebo černý zářič je ideální těleso, které pohlcuje
veškeré záření všech vlnových délek, dopadající na jeho povrch. Absolutně černé těleso je současně ideální zářič,
ze všech možných těles o stejné teplotě vysílá největší možné množství zářivé energie. Celkové
množství energie, které se vyzáří z povrchu absolutně černého tělesa za jednotku času a rozložení intenzity
záření podle vlnových délek závisí jen na jeho teplotě. Záření Slunce se poměrně dobře blíží záření absolutně
černého tělesa s teplotou přibližně 5800 Kelvinů, reliktní záření odpovídá záření absolutně černého tělesa s
teplotou 2,7 K. Tento fyzikální pojem zavedl Gustav Kirchhoff v roce 1862.
Slunce
Teplotní zdroje světla
Inkandescence je jev
vyzařování světla,
způsobeného tepelným
buzením. V těchto zdrojích
vzniká světlo jako jedna ze
složek elektromagnetického
záření vyvolaného vysokou
teplotou povrchu nějakého
tělesa.
Patří sem oheň (svíčka, lampa),
v němž září:
rozžhavené částice
(nejčastěji uhlíku),
slabě i žhavé plyny.
Elektroinkandescence
• Vzniká průchodem elektrického proudu pevnou vodivou látkou s vysokou
teplotou tání např. platina, wolfram, atd. Pevná látka se rozžhaví na
požadovanou teplotu, při které dochází k emisi viditelného záření
• Klasická žárovka svítí díky rozžhavenému (obvykle wolframovému)
vláknu, v němž jsou elektrony vázané v atomech vlákna tepelně
excitovány z nižších orbitálních hladin na vyšší; fotony zde vznikají při
přeskocích elektronů mezi hladinami.
• Společnou vlastností teplotních zdrojů je:
• velmi nízká účinnost přeměny jiného druhu energie na světlo (8%)
• velký podíl energie vyzářené v podobě tepla (hlavní část – 92%)
• spojité rozložení světla ve spektru podle fyzikální křivky teplotního zářiče
• subjektivně příjemné vnímání světla lidským okem
• závislost barvy světla na teplotě zářiče
• závislost účinnosti zdroje na teplotě zářiče.
Elektrické zdroje světla s
nespojitým spektrem
• Na rozdíl od teplotních zdrojů zde vzniká
světlo jinými mechanismy. Obvykle jde o
proud fotonů jednotlivě vyzářených při
návratu elektronů z nestabilních poloh ve
vyšších hladinách do stabilní polohy v nižší
hladině v elektronovém obalu nějakého
atomu. Protože energie uvolňovaná
vracejícími se elektrony je kvantovaná
velikostí „skoku“ mezi hladinami, mají i
energie fotonů nespojitý průběh, rozdělený
do tzv. emisních spektrálních čar nebo pásů.
LASER
Princip laseru
Princip laseru
LED
Na rozdíl od žárovky fungují LED a LD na principu elektroluminiscence polovodičových
materiálů. Zde vzniká světlo v důsledku přeskoků elektronů z vyšších energetických pásů do
nižších. Rozdíl energie mezi dnem vodivostního a vrchem valenčního pásu pak odpovídá energii
vyzářené ve formě fotonu. K tomuto jevu obecně dochází u všech diod, ale pouze v některých
případech dojde ke vzniku světelného záření, jinak se elektrická energie mění na tepelnou nebo
naopak vzniká neviditelné ultrafialové záření.
Při průchodu elektrického proudu diodou v propustném směru se energie elektronu při
mezipásové rekombinaci může uvolnit ve formě fotonu o energii W = h · ν, kde h je Planckova
konstanta a ν je frekvence fotonu. K přechodu může dojít také prostřednictvím příměsových
hladin v zakázaném pásu. Emitované záření má pak o něco menší energii h·ν‘, resp. větší
vlnovou délku
Halogenové žárovky
• Halogenové žárovky jsou zdokonalené klasické žárovky. V prostředí
baňky jsou halogeny, které pomáhají snižovat odpařování vlákna, a
dosahuje se tak vyšší účinnosti. Halogenové žárovky mají světlo
podobné klasickým žárovkám.
• O 25-30 % nižší spotřeba energie oproti normální žárovce
• Rychlý start, delší životnost
Zářivky
• Zářivka je tvořena především dlouhou trubicí, která je naplněna směsí rtuťových par a argonu. Na
koncích trubice jsou elektrody, které jsou pokryty bariem. Z katody, která je rozžhavena asi na
900 °C emitují elektrony a směřují k opačně nabité anodě. Elektrické pole je urychluje. Díky tomu,
že je trubice vakuovaná (tlak uvnitř je asi 400 Pa), je dráha elektronů, než narazí do nějakého
atomu, dostatečně dlouhá, aby elektron získal dostatečnou energii k vyražení dalšího elektronu z
atomu. Takto dochází k lavinovité ionizaci a vzniká tzv. doutnavý výboj.
• Někdy energie elektronu nestačí na ionizaci, ale dojde k excitaci – elektron se dostane na vyšší
hladinu a posléze zase sestoupí na základní hladinu a následuje emise fotonu
• Emitované fotony mají vln. délku 254 nm (UV světlo)
• Stěny zářivky jsou pokryty luminiscenčním materiálem, který je exctitován fotony a emitovány jsou
fotony s vyšší vlnovou délkou (viditelné záření)
Zdroj http://www.earch.cz/
Zářivky - luminifory
Úsporné kompaktní zářivky, tzv.
„úsporky“
• Fungují jako zářivky
• Úspora 80 % energie, volba barvy světla
• (údajně) delší výdrž
• Pomalý náběh, obsahuje rtuť a lanthanoidy (nutnost recyklace)
• Neekologická výroba!
Svíčka
Použití luminiscenční
spektroskopie v analytické
chemii
Luminiscenční analýza
Kvantitativní analýza:
F = k φ Φo 2.3 c l ε
Vysoká citlivost metody:
• použití laserů
• odezva na relativně malé změny v okolí
Luminiscenční stanovení
• nativní luminiscence
• tvorba luminiscenčních komplexů
• luminiscenční značky
• luminiscenční sondy
• propojení s dalšími metodami
Vnitřní a vnější luminiscence
• vnitřní/intrinsic (nativní luminiscence) – molekuly
lze stanovit bez výrazného zásahu do
sledovaného systému, zpravidla aromatické
látké
• vnější/extrinsic luminiscence – do sledovaného
systému přidáme fluoreskující činidlo(barvivo),
jehož fluorescence bude závislá na koncentraci
analytu, případně se na něj naváže
Nativní luminiscence
sloučenina λex
max (nm) λem
max (nm)
indole group 270-290 330-350
LSD 325 365
quinine 347 448
papaverine 315 347
berberine 352 a 432 548
caffeine 270 303
purine 265 380
adenosine 272 390
cytosine 267 313
uracil 258 309
3-hydroxocoumarin 316 372
riboflavin 370 a 440 565
GFP 400 a 475 510
nicotineamids 470 515
cyanocobalamin 275 305
calciferol 348 420
retinol 325 470
Peptidy, proteiny, AK
Stanovení aminokyselin
www.biotek.com
Stanovení aminokyselin
www.biotek.com
Stanovení proteinů
www.biotek.com
Nativní fluorescence proteinů – vliv
polarity okolního prostředí
Stanovení anorganických iontů
Komplexující činidlo Iont kovu
8-hydroxychinolin Al3+, Be2+, Zn2+ ,
Li+, Mg2+ a další
Flavonal Zr2+, Sn4+
2-(o-hydroxyfenyl) benzoaxazol Cd2+
1,10 - fenntrolin Ln3+
Různá azobarviva Al3+, Be2+, In3+,
Hf(IV), Th(IV),
Sc3+, Ca2+, Mg2+,
Sn(IV), Y3+
Benzoin B4O7
2-, Zn2+
Fluorescenční značky a sondy
• fluorescenční značky (fluorescent labels) jsou vnější (extrinsic
fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám
(proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou
kovalentní vazbou
• fluorescenční sondy (fluorescent probes) jsou vnější fluorofory,
které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom
mění své fluorescenční vlastnosti.
Derivatizace fluoroforem
Rhodamine B
(c =1x10-12 mol.l-1)
Rhodamin B (c =1x10-12 mol.l-1)
Vnitřní (nativní) x vnější luminiscence
luminiscenční značky a sondy
Molekuly bez vlastní (vnitřní, nativní,
přirozené) luminiscence lze derivatizovat
luminiscenčními značkami
Omezení: lze detekovat i
jednotlivé molekuly („single
molecule detection“) obsahující
silné luminofory, problém je
jejich navázání na analyt...
Výběr fluorescenčních značek
kritéria pro výběr:
spektrální vlastnosti (excitace, emise, kvantový výtěžek atd.)
vazebné místo (-NH2, -SH skupina a další)
podmínky reakce (pH, koncentrace...)
hydrofobicita
Výběr luminiscenčního barviva
– spektrální vlastnosti
Výběr luminiscenčního barviva
– spektrální vlastnosti
RBITC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
450 500 550 600 650
λ [nm]
IF[a.u.]
Emise
Excitace
O
OH
O
N
+
NCH3
CH3
CH3
CH3
N
S
N
S
Cl
-
Výběr fluorescenčních barviv
Fluorescenční značky – vazebná místa
amino-reaktivní značky
sukcinimidyl estery (Rh6GSE)
sulfonyl chloridy
isothiokyanáty (FITC, RBITC)
Fluorescenční značky – vazebná místa
thiol-reaktivní značky
Fluorescenční metody v
imunoanalýze
Imunoanalytické metody:
• dříve hlavně tvorba precipitátu
• dnes značené hlavně různým způsobem značené
reaktanty (antigeny a protilátky)
• radiometricky, enzymaticky, fluorescenčně
(luminiscenčně) značené reaktanty
• enzymové metody mohou mít luminiscenční detekci
Fluorescenční imunoanalýza (FIA)
• poprvé použity v roce 1964
• často ovlivněna fluorescencí matrice a samotného
vzorku
• může být použita i TR-FIA (Time Resolved Fluorescence
Immuno Assay). Tato metoda využívá jako značek
chelátů s lanthanitých kationtů (Eu3+, Tb3+, Sm3+ a
dalších)
• FIA lze provádět v homogenním i heterogenním
prostředí, v kompetitivním i nekompetitivním uspořádání
Ab + Ab + Ab-F Ab-Ab Ab-Ab-F
ukázka kompetitivní FIA v heterogenním prostředí
Fluorogenní substráty – stanovení
enzymatické aktivity
Princip: volný fluorofor má jiné luminiscenční
vlastnosti, než když je navázaný na biomolekulu.
Fluorofor je na biomolekulu navázán vazbou,
kterou štěpí stanovovaný enzym.
enzym značený
substrát
Fluorimetrická EIA
• Enyzmoimunoanalýza v homogenním
(EIA) a heterogenním prostředí (ELISA)
enzym
Existuje několik možností:
• antigen je značen enzymem
• antigen značený enzymem se sráží s protilátkou
• nesražený antigen s enzymem lze stanovit takto:
4-metyl-umbelliferyl-D-galaktosid beta-D-galaktosa + 4-metyl-umbelliferyl
Dělení fluorescenční
imunoanalytických metod
• Fluorescence Immuno Assay (FIA)
• Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA)
• Time Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA)
• Elektroluminiscenční, chemiluminiscence a další
• Enzymatické metody s luminiscenční detekcí
Radiometrická vs. fluorescenční
detekce v imunoanalýze
• dříve byla nejcitlivější metodou RIA, ale s
příchodem levných laserů je rozšířenější
luminiscenční detekce
• detekční limity obou metod jsou
srovnatelné (až 10-12 g.l-1), ale
luminiscenční detekce je bezpečnější a
levnější
L-Alanine 7-amido-4-methylcoumarin: fluorogenní substrát
pro stanovení Aminopeptidáz
2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside: fluorogenní substrát
pro stanovení b -Glucosidase
Fluorescein dibutyrate: fluorogenní substrát pro stanovení esteráz a lipáz
4-Methylumbelliferyl phosphate: fluorogenní substrát pro stanovení fosfatázy
Fluorogenní substráty
Použití luminiscenční
spektroskopie v analytické
chemii
Luminiscenční analýza
Kvantitativní analýza:
F = k φ Φo 2.3 c l ε
Vysoká citlivost metody:
• použití laserů
• odezva na relativně malé změny v okolí
Luminiscenční stanovení
• nativní luminiscence
• tvorba luminiscenčních komplexů
• luminiscenční značky
• luminiscenční sondy
• propojení s dalšími metodami
Vnitřní a vnější luminiscence
• vnitřní/intrinsic (nativní luminiscence) – molekuly
lze stanovit bez výrazného zásahu do
sledovaného systému, zpravidla aromatické
látké
• vnější/extrinsic luminiscence – do sledovaného
systému přidáme fluoreskující činidlo(barvivo),
jehož fluorescence bude závislá na koncentraci
analytu, případně se na něj naváže
Nativní luminiscence
sloučenina λex
max (nm) λem
max (nm)
indole group 270-290 330-350
LSD 325 365
quinine 347 448
papaverine 315 347
berberine 352 a 432 548
caffeine 270 303
purine 265 380
adenosine 272 390
cytosine 267 313
uracil 258 309
3-hydroxocoumarin 316 372
riboflavin 370 a 440 565
GFP 400 a 475 510
nicotineamids 470 515
cyanocobalamin 275 305
calciferol 348 420
retinol 325 470
Peptidy, proteiny, AK
Stanovení aminokyselin
www.biotek.com
Stanovení aminokyselin
www.biotek.com
Stanovení proteinů
www.biotek.com
Nativní fluorescence proteinů – vliv
polarity okolního prostředí
Stanovení anorganických iontů
Komplexující činidlo Iont kovu
8-hydroxychinolin Al3+, Be2+, Zn2+ ,
Li+, Mg2+ a další
Flavonal Zr2+, Sn4+
2-(o-hydroxyfenyl) benzoaxazol Cd2+
1,10 - fenntrolin Ln3+
Různá azobarviva Al3+, Be2+, In3+,
Hf(IV), Th(IV),
Sc3+, Ca2+, Mg2+,
Sn(IV), Y3+
Benzoin B4O7
2-, Zn2+
Fluorescenční značky a sondy
• fluorescenční značky (fluorescent labels) jsou vnější (extrinsic
fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám
(proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou
kovalentní vazbou
• fluorescenční sondy (fluorescent probes) jsou vnější fluorofory,
které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom
mění své fluorescenční vlastnosti.
Derivatizace fluoroforem
Rhodamine B
(c =1x10-12 mol.l-1)
Rhodamin B (c =1x10-12 mol.l-1)
Vnitřní (nativní) x vnější luminiscence
luminiscenční značky a sondy
Molekuly bez vlastní (vnitřní, nativní,
přirozené) luminiscence lze derivatizovat
luminiscenčními značkami
Omezení: lze detekovat i
jednotlivé molekuly („single
molecule detection“) obsahující
silné luminofory, problém je
jejich navázání na analyt...
Výběr fluorescenčních značek
kritéria pro výběr:
spektrální vlastnosti (excitace, emise, kvantový výtěžek atd.)
vazebné místo (-NH2, -SH skupina a další)
podmínky reakce (pH, koncentrace...)
hydrofobicita
Výběr luminiscenčního barviva
– spektrální vlastnosti
Výběr luminiscenčního barviva
– spektrální vlastnosti
RBITC
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
450 500 550 600 650
λ [nm]
IF[a.u.]
Emise
Excitace
O
OH
O
N
+
NCH3
CH3
CH3
CH3
N
S
N
S
Cl
-
Výběr fluorescenčních barviv
Fluorescenční značky – vazebná místa
amino-reaktivní značky
sukcinimidyl estery (Rh6GSE)
sulfonyl chloridy
isothiokyanáty (FITC, RBITC)
Fluorescenční značky – vazebná místa
thiol-reaktivní značky
Fluorescenční metody v
imunoanalýze
Imunoanalytické metody:
• dříve hlavně tvorba precipitátu
• dnes značené hlavně různým způsobem značené
reaktanty (antigeny a protilátky)
• radiometricky, enzymaticky, fluorescenčně
(luminiscenčně) značené reaktanty
• enzymové metody mohou mít luminiscenční detekci
Fluorescenční imunoanalýza (FIA)
• poprvé použity v roce 1964
• často ovlivněna fluorescencí matrice a samotného
vzorku
• může být použita i TR-FIA (Time Resolved Fluorescence
Immuno Assay). Tato metoda využívá jako značek
chelátů s lanthanitých kationtů (Eu3+, Tb3+, Sm3+ a
dalších)
• FIA lze provádět v homogenním i heterogenním
prostředí, v kompetitivním i nekompetitivním uspořádání
Ab + Ab + Ab-F Ab-Ab Ab-Ab-F
ukázka kompetitivní FIA v heterogenním prostředí
Fluorogenní substráty – stanovení
enzymatické aktivity
Princip: volný fluorofor má jiné luminiscenční
vlastnosti, než když je navázaný na biomolekulu.
Fluorofor je na biomolekulu navázán vazbou,
kterou štěpí stanovovaný enzym.
enzym značený
substrát
Fluorimetrická EIA
• Enyzmoimunoanalýza v homogenním
(EIA) a heterogenním prostředí (ELISA)
enzym
Existuje několik možností:
• antigen je značen enzymem
• antigen značený enzymem se sráží s protilátkou
• nesražený antigen s enzymem lze stanovit takto:
4-metyl-umbelliferyl-D-galaktosid beta-D-galaktosa + 4-metyl-umbelliferyl
Dělení fluorescenční
imunoanalytických metod
• Fluorescence Immuno Assay (FIA)
• Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA)
• Time Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA)
• Elektroluminiscenční, chemiluminiscence a další
• Enzymatické metody s luminiscenční detekcí
Radiometrická vs. fluorescenční
detekce v imunoanalýze
• dříve byla nejcitlivější metodou RIA, ale s
příchodem levných laserů je rozšířenější
luminiscenční detekce
• detekční limity obou metod jsou
srovnatelné (až 10-12 g.l-1), ale
luminiscenční detekce je bezpečnější a
levnější
L-Alanine 7-amido-4-methylcoumarin: fluorogenní substrát
pro stanovení Aminopeptidáz
2-Chloro-4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside: fluorogenní substrát
pro stanovení b -Glucosidase
Fluorescein dibutyrate: fluorogenní substrát pro stanovení esteráz a lipáz
4-Methylumbelliferyl phosphate: fluorogenní substrát pro stanovení fosfatázy
Fluorogenní substráty
Fluorescenční sondy
Fluorescenční sondy
• vnější fluorofory, které se ke sledovaným
molekulám, iontům, atd. váží nekovalentní
vazbou
• změna fluorescenční vlastností (intenzita
emise, posun emisního maxima, změna
času vyhasínání)
• Princip: různý vliv na Franck-Condonův
excitovaný stav
Fluorescenční sondy pro využití v
analytické chemii, medicíně a biologii
• kromě měření emisních spekter se využívá zejména
fluorescenční mikroskopie, zhášení (emise i času
vyhasínání)
• fluorescenční indikátory: sondy citlivé na určitou látku
(většinou anion, či kation)
• sondy pro polaritu prostředí
• membránové sondy
• fluorescenční sondy pro nukleové kys.
• další
• www.molecularprobes.com
• disociační konstanta – musí být srovnatelná s měřenou koncentrací
kationu (koncentrace menší než desetina nebo věší než desetinásobek
disociační konstanty způsobují příliš malé změny v pozorovaném
signálu)
• pro sondy, u kterých dochází k nárustu intenzity fluorescence platí
vztah:
ca = Kd (I-Imin)/(Imax-I)
Indikátory pro anorganické ionty
pro sondy, které vykazují spektrální posun
se používá:
ca = Kd (SF(l2)/SB(l2)) (R – Rmin)/(Rmax – R)
kde R = I(l1)/I(l2) je poměr intenzit pro dvě
excitační vlnové délky l1 a l2, Rmin a Rmax
jsou poměry pro sondu volnou a plně
obsazenou analytem,
SF(l2)/SB(l2)=FF/BB,  - extinkční
koeficienty,  - kvantové výtěžky sondy
excitované při l2.
Indikátory pro anorganické ionty
Indikátory pro anorganické ionty
• nejčastěji indikátory Ca2+, Mg2+, Zn2+, Na+
nebo K+
• indikátory jsou zpravidla chelatační činidla
• různé obchodní názvy (např. Fura-2,
Calcium Green, Indo, atd.)
• stanovení Ca2+ pomocí fluorexonu (calceinu)
• analytické stanovení Ca2+ (i v přítomnosti Mg2+) –
vymizení fluoreskujícího komplexu Ca2+-fluorexon při
titraci pomocí EDTA v zásaditém prostředí
Stanovení Ca2+
Calceinem značený losos...
Indikátory pH
• použití pH indikátorů: kam nemůžeme dát
pH elektrodu – např. buňky, živé tkáně,
atd.
• buněčné pH se pohybuje mezi 6.8 – 7.4
• možnost měřit pH na dvě desetinná místa
Indikátory pH
fluorofor rozsah pH způsob měření
SNAFL indikátory 7,2-8,2
Ex 490/540 nebo Em
540/630
SNARF indikátory 6,0-8,0 Em 580/640
HPTS (pyranin) 7,0-8,0 Ex 450/405
BCECF 6,5-7,5 Ex 490/440
Fluoresceiny a karboxyfluoresceiny 6,0-7,2 Ex 490/450
LysoSensor Green DND-189 4,5-6,0 Em 520
Oregon Green indikátory 4,2-5,7
Ex 510/450 nebo Ex
490/440
LysoSensor Yellow/Blue DND-160 3,5-6,0 Em 450/510
„lifetime“ pH indikátory
• čas vyhasínání ovlivněn hodnotou pH
• výhoda: při měření tau nezáleží na koncentraci indikátoru
Sondy pro detekci plynů rozpuštěných v
biologických kapalinách
• nejčastěji detekce O2, nebo NO
• „lifetime“ sondy
• nejčastěji na principu oxidace centrálního iontu
obsaženého v sondě, nebo dynamickém
zhášení kyslíkem
• luficerin, luminol...
Rutheniové sondy
Ukázka: kyslíkové sondy používané k detekci
kyslíku v kůži (www.molecularprobes.com)
Tris(4,7-diphenyl-1,10phenanthroline)ruthenium(II)
dichloride (abs.
λmax 455 nm, luminescence λmax 613 nm)
Sondy pro měření polarity prostředí
• Často se mění i kvantový výtěžek a doba
vyhasínání fluorescence
• Polarita prostředí ovlivňuje většinu fluoroforů
(např. tryptofánu)
• Polarita blízkého okolí fluoroforu může být dána
konformací biomolekuly
Příklad sondy pro studium polarity
prostředí
rozpouštědl
o
lem
max
(nm)
kvantový
výtěžek
doba dohasínání
(ns)
oktanol 464 0,646 12,3
propanol 466 0,476 10,2
metanol 476 0,216 6,05
voda 515 0,004 0,55
Typickými sondami pro dynamickou polaritu jsou
1-anilinonaftalén-8-sulfonát (ANS) a
2-p-toluidinonaftalén-6-sulfonát (TNS). S
rostoucí polaritou prostředí se emisní spektrum
posouvá k vyšším vlnovým délkám.
Fluoresceční vlastnosti ANS v různých prostředích
Membránové fluorescenční sondy
• membránové struktury obvykle neobsahují fluorofory
(většinou se jedná o nepolární uhlovodíkové řetězce –
zbytky mastných kyselin), proto se jejich vlastnosti
zkoumají pomocí sond
• transport a metabolismus lipidů v živých buňkách
• recyklace synaptosomů
• přenos signálu zprostředkovaný lipidy
• membránový potenciál
• interakce léčiv s membránou
• transport membránou
• mikroviskozita membrán a teplotní fázové přechody
Rozdělení membránových sond
1. fluorescenčně značené lipidy
2. malé lipofilní organické fluorofory
Fluorescenčně značené lipidy
• mastná kyselina je označena vhodným
fluoroforem (nitrobenzoxadiazol (NBD),
BODIPY, pyrén nebo dansyl)
• fosfolipid jsou značený buď v oblasti polárních
hlaviček (dansyl, NBD, BODIPY, fluorescein,
tetrametylrhodamin, Oregon blue, Oregon
green, Texas red a dalšími), nebo v oblasti
zbytků mastných kyselin (DPH, NBD, pyrén,
BODIPY)
• značení sfingolipidů, steroidů, triglyceridů,
lipopolysacharidů
Malé lipofilní, nebo amfifilní
organické fluorofory
• malé molekuly, které podávají informaci o
charakteristikách svého mikrookolí, jako je
polarita, viskozita a uspořádání lipidů.
• typickým příkladem je nepolární sonda
DPH (1,6-difenyl-1,3,5-hexatrien) – je ve
vodě nerozpustná, fluoreskuje jen v
nepolárním prostředí biologických
membrán
Ukázky nepolárních malých sond
DPH
• Vizualizace a identifikace RNA a DNA
(nukleové báze jeví jen slabou luminiscenci)
Fluorescenční sondy pro NK
a) Duplex-dvoušroubovice (antiparalelní, intermolekulární), b) hairpin-vlásenka (antiparalelní, intramolekulární), c) triplex
(paralelní, intermolekulární), d) G-kvadruplex (antipalarelní, intramolekulární), e) i-motiv (intramolekulární)
Dvoušroubovicová DNA (helix, duplex, B-DNA, atd.)
Vazebné možnosti
„vnější vazba“ – atmosféra +
iontů kolem – nabité DNA „vazba ve žlábku“ – van der
Waalsovský kontakt s léčivem
ve žlábku
„interkalace“ – vmezeření
planárního aromat. systému
mezi páry bazí
Interakce ve žlábcích
Velký žlábek:
interaguje s  helixy. Helix se orientuje podél
osy žlábku, postranní řetězce tvoří H-vazby s
bázemi, event. kontakty s fosfát. skupinami.
Malý žlábek:
interaguje s  skládanými listy. List leží podél
osy žlábky, tvoří H-vazby k dusíkům amino
skupin a k fosfátum.
Interkalace
= interakce s DNA – léčivo (planární aromatická molekula) se váže
mezi 2 sousední páry bazí, aniž přeruší W-C páry  deformace cukr
fosfátové páteře
Př. interkalátory
daunomycin
(skupina
antracyklinů)
aktinomycin D
(peptidové antibiotikum s
phenoxazonovým aromat.
systémem)
ethidium bromid
Ethidium bromid interkalovaný mezi pár adenin-uracil
- ethidium bromid: ve vodě fluoreskuje jen slabě, při interakci s
DNA se intenzita fluorescence zvýší 30x a čas vyhasínání se
zvýší z 1.7 ns na 20 ns.
Propidium iodid
- Interkalační DNA sonda (493/636 nm)
- Neprochází membránou
DAPI
- 4',6-diamidin-2-fenylindol
- váže se na AT bohaté oblasti v DNA (poměru 1 molekula
DAPI na 3 AT-páry)
- schopnost procházet buněčnou membránou a vázat se do
jádra
- po vazbě DAPI na DNA se až 20× zesiluje intenzita
fluorescence
- vazba do malého žlábku
- exctiační / emisní - 358 nm / 461 nm
- váže se i na RNA (slabší fluorescence, emise – 500 nm
Hoechst Dyes
- strukturně podobná barviva Hoechst 33258, Hoechst
33342 a Hoechst 34580
- 350/460 nm (s DNA), bez DNA kolem 510-540 nm
- intenzita je závislá i na pH
- vazba do malého žlábku dsDNA mezi A-T
- buněšný cyklus (nízká toxicita)
PicGreen dyes
- ultracitlivé stanovení DNA
Příklady sond pro NK
fluorofor lex
max (nm) lem
max (nm) použití
Akridinová oranž
(DNA)
500 526
prostupuje; RNA/DNA; průtoková cytometrie
Akridinová oranž
(RNA)
460 650
Ethidium bromid 518 605
neprostupuje; vmezeřování do dsDNA; barvení mrtvých
buněk; elektroforéza; průtoková cytometrie; …
Propidium jodid 535 617 neprostupuje; barvení mrtvých buněk
DAPI 358 461 částečně prostupuje; buněčný cyklus; AT-selektivní; …
Hoechst 33342 350 461
prostupuje; AT-selektivní; selektivní vazba k dsDNA;
buněčný cyklus; …
PicoGreen 502 523 ultracitlivá kvantifikace roztoků dsDNA
OliGreen 498 518 ultracitlivá kvantifikace roztoků ssDNA a oligonukleotidů
RiboGreen 500 520 ultracitlivá kvantifikace roztoků RNA
TOTO-1 514 533
neprostupuje membránu; vysoká afinita pro nukleové
kyseliny
SYTO 85 orange 567 583 prostupuje membránou
Studium vazných míst biomolekul
• „calcium binding sites“ – místa v proteinech, kde se váže
Ca2+
• při studiu interakcí je možné nahradit vápenaté ionty Ln3+
(nejčastěji Eu3+, nebo Tb3+)
• Ln3+ mají podobné vlastnosti jako Ca2+, ale mají výborné
luminiscenční vlastnosti
• podobný iontový poloměr
• koordinační číslo Ca2+ (až 8) je podobné kordinačnímu
číslu Ln3+ (až 9)
• preference koordinace „tvrdými donory“
• Ln3+ váže 105 silněji než Ca2+
• Ln3+ ligandová výměna je 100x pomalejší, než výměna
Ca2+
• jestliže Ln3+ nahradí Ca2+ v katalytickém místě, rychlost
reakcí poklesne
Studium vazebných míst Ca2+
• protein thermolysin
• z luminiscenčních spekter
a časů vyhasínání lze určit
polohu Eu3+ (resp. Ca2+) v
biomolekule
Vnější fluorofory: shrnutí
Vnější fluorofory
• značky (derivatizace, „labells“, „tags“) –
kovalentní vazba
• sondy (indikátory, „probes“) – různé typy
nekovalentních interakcí
značka
značka
Důvody pro použití značek a sond
• zvýšení citlivosti
• získání informace o koncentraci analytu, o
struktuře látky, o funkci molekuly v
systému...
• odvozené metody (FRET, FIA, EIA, atd.)
• kombinace značek a sond (FISH,
fluorescenční mikroskopie)
Značky
• značení molekul: „steady state“ luminiscenční
spektroskopie, časově rozlišená luminiscence,
luminiscenční detekce ve spojení se
separačními technikami, fluorescenční
mikroskopie, fluorescenční anizotropie...
• značení peptidů, proteinů, protilátek, antigenů,
enzymů, NK, membrán, buněk, tkání, celých
organismů...
• použití také „in vivo“
• využití: chemie, fyzika, biologie, medicína...
Ukázka derivatizačního činidla pro LIF – HPLC (CE)
převzato z http://www.fluorescence-microscopy.com
převzato z http://www.fluorescence-microscopy.com
Myší játra značená různými fluorofory...
Sondy
• využití: analytická chemie – detekce
menších částic (ionty, malé molekuly),
biologie a medicína (snadnější přístup
např. do buněk)
• různé detekční systémy (mikroskopie,
spektroskopie, „steady state“, časově
rozlišena, atd.)
• použití „in vivo“
• membrány opticky aktivních senzorů
Axialní, nebo ekvatoriální inkluze
Fluorescence-based optical
sensors
Fluorescenční optické senzory
Fluorescenční optické senzory
• alternativa k optickým senzorům s
chromofory
• pasivní a aktivní optické senzory
• senzory iontů, molekul
• různé typy interakcí...
Pasivní senzory
• pasivní senzory excitují a sbírají světlo s
roztoku, nebo povrchu, se kterým jsou v
kontaktu
Aktivní senzory
• v koncové části senzoru je polopropustná, nebo propustná
membrána, za kterou se nachází fluorofor, který může
reagovat s analytem v roztoku
• např. v senzoru se mohou nacházet např. značené
protilátky
Odvozené techniky
• FRET
• BRET
• FISH
• FIA
• EIA
• a další
BRET
• podobně jako u FRET záleží na vzdálenosti mezi
fluorofory – jestliže je dostatečně krátká, probíhá
výměna energie (dojde k vyzáření světla druhým
fluoroforem)
• u metody BRET je donorem energie luciferázou
katalyzovaná oxidace coelenterazinu (z mořského
koníka Renilla
• jestliže je v blízkosti GFP, dojde k přenosu a
následnému vyzáření zelného světla
• možné i použití jiných molekul, např. derivátu
coelenterazinu DeepBlueC (Packar Bioscience, USA)
není Fish jako FISH...
Fluorescence In Situ Hybridization (FISH)
FISH
• Fluorescence In Situ Hybridization je
cytogenetická metoda, která umožňuje
detekci a lokalizaci konkrétních sekvencí
DNA v chromosomech
• tato metoda je určená k mapování genů a
sledování chromosomálních abnomalit,
atd.
• pro detekci se využívá fluorescenční
mikroskopie
FISH
• krátký jednovláknový (single stranded)
úsek DNA, který je komplementární k
hledané sekvenci, je označen
fluorescenční značkou
• v rozpletených úsecích DNA dochází k
navázání na komplementární části
• dochází k nalezení a označení části
sekvence, která kóduje zkoumaný úsek
Typy FISH
• Locus specific probes: jestliže isolujeme malý
kousek genu a chceme vědět v kterém
chromosomu se nachází
• Centrometric repeat probes: chromosomy
obsahují opakující se sekvence. Jedním typem
sondy lze obarvit velkou část chromosomu.
Každý chromosom může mít jinou barvu...
• Whole chromosome probes: soubor více sond,
které hybridizují chromosom po celé jeho délce.
Tvorba tzv. spektrálního karyotu
Ukázky FISH
Bioanalytické metody
• FIA
• EIA
převzato z http://www.amershambiosciences.com
Polarizovaná fluorescence a
fluorescenční anizotropie
Fluorescenční anizotropie
• je-li roztok fluoroforů excitován lineárně polarizovaným zářením,
potom budou excitovány pouze ty molekuly, které mají nenulový
průmět svého absorpčního přechodového momentu do směru
polarizace (fotoselekce)
• je-li průměrná rotační relaxační doba (charakterizující rotační difúzi
v roztocích) mnohem delší než doba dohasínání fluorescence,
potom také výsledná fluorescence bude polarizována
• bude-li naopak průměrná rotační relaxační doba mnohem kratší než
doba dohasínání fluorescence, potom anizotropie systému klesne
ještě před emisí na limitní hodnotu (v izotropním systému o malé
viskozitě až na nulu)
• pokud jsou doba dohasínání fluorescence a rychlost molekulární
reorientace srovnatelné, potom bude polarizace fluorescence
modulována molekulárním pohybem a analýza časové závislosti
emisní anizotropie bude poskytovat informaci o anizotropii systému,
v němž se fluorofor nachází
Fluorescenční anizotropie
• Měření polarizace fluorescence poskytuje
informace o molekulární orientaci a pohyblivosti
a procesech, které je modulují, např.:
• fluidita membrán
• interakce ligand - receptor
• proteolýza
• interakce protein - DNA
• kontrakce svalů
• aktivita proteinkináz
 % nasycených mastných kys.
 % cholesterolu v membráně
 koncentrace proteinů
anizotropie
fluorescence v
membránách
anizotropie fluorescence:
2
polarizátor
analyzátor
r =
stupeň polarizace p = (III - I)/((III + I)
anizotropie r = (III - I)/((III + 2 I)
Polarizační spektra
Polarizační spektra fluorescence
jsou závislosti stupně polarizace
nebo anizotropie na vlnové délce
při konstantní vlnové délce
excitujícího nebo emitovaného
záření.
Imunoanalýza – polarizace
luminiscence
Polarizace luminiscence - aplikace
Vancomycin – kalibrační křivka
Fluorescenční korelační
spektroskopie
Fluorescenční korelační spektroskopie (FCS) je technika
při níž jsou měřeny spontánní fluktuace intenzity
fluorescence v mikroskopickém objemu (kolem 10-15 l)
určeném fokusovaným excitačním laserovým paprskem.
Malé, rychle difundující fluorofory způsobují rychlé
fluktuace intenzity fluorescence – oproti konvenční
fluorimetrii nedochází ke způměrování těchto difúzně
závislých fluktuací. Časová závislost intenzity
fluorescence je potom analyzována pomocí dočasné
autokorelační funkce, která obsahuje informaci o
rovnovážných koncentracích, reakčních kinetikách a
difúzních rychlostech molekul ve vzorku
Fluorescenční korelační
spektroskopie - aplikace
• fragmentace nukleových kyselin
• hybridizace nukleových kyselin
• tvorba produktů PCR
• laterální oddělení lipidů v dvojvrstvách
• difúze molekul v jádře a cytoplazmě
• interakce protein-protein
• vazebná rovnováha pro léčiva a jiné ligandy
• shlukování (clustering) membránových
receptorů
Aplikace fluorescenční
spektroskopie v hydrogeologii
Migrace podzemních vod
• sledování a objasnění systému
podzemních řek a potoků v
krasových oblastech (propadání a
vývěry...)
• sledování toku vody z
kontaminovaných míst (např.
úložiště odpadů, skládek, atd.)
Fluorescenční „značkovače“
podzemních vod
• fluorescenční „značkovače“ (tracer) jsou obvykle ve vodě rozpustné,
silně fluoreskující látky (fluorescein, rhodamin, eosin, erythrosin,
atd.)
• jestliže dochází k velikému zředění barviva, lze použít např.
hydrofobní sběrné patrony
• k detekci lze použít jak LIF, tak spektrofluorimetr vybavený lampou (i
detekce několika barviv zároveň)
• lze sledovat i časový průběh průchodu barviva potokem/řekou. Z
rychlosti průtoku, zředění značkovače, vzdálenosti a dalších faktorů
lze usuzovat na charakter, délku, případně členitost podzemního
systému.
Příklad
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25
čas (hod.)
Int.
Závislost intenzity fluorescence fluoresceinu na čase ve vzorcích vody
odebraných z potoka v Moravském Krasu - 50g fluoresceinu bylo
rozpuštěno v potoce před propadáním nedaleko jeskyně Byčí skála a
odběrem vody z okolních potoků byla prokázána propojenost systému
podzemních vod.
Stokesův posun
Ramanův a Rayleigho rozptyl
Rayleigho rozptyl
• Rayleighův rozptyl je rozptyl světla na molekulách plynu případně na jiných
částicích podstatně menších než vlnová délka
• při Rayleighově rozptylu se frekvence záření (vlnová délka) nemění
• světlo rozptylují přímo molekuly (vzduchu, plynu, atd.) a intenzita rozptýleného světla
silně závisí na jeho vlnové délce (je nepřímo úměrná její čtvrté mocnině)
• to znamená, že modré světlo s krátkou vlnovou délkou se rozptyluje více než
světlo červené
„Klasický televizor“ - CRT
Cathod Ray Tube - katodová trubice paprsků
princip fungování
vakuová elektronka
elektronové paprsky jsou vystřelovány z elektronového děla (u barevného monitoru tři děla - RGB)
o správné usměrnění svazku paprsků se starají vychylovací cívky
před dopadem na obrazovku procházejí paprsky maskou
maska zajistí, že paprsky dopadnou na správné místo v tzv. luminiscenční vrstvě - nátěru
svíticích bodů (stínítku)
existují různé typy masek i způsobů nanesení luminoforu - Delta, Inline, Trinitron, Flatron, Quntrix,
QuintrixF a další
úhlopříčka - vzdálenost dvou protilehlých vrcholů obrazovky, udává se v palcích (viditelná úhlopříčka je
obvykle menší)
15'', 17'', 19'', 21'' - úhlopříčky běžně používaných monitorů
rozlišení - počet zobrazitelných pixelů, udává se jako počet pixelů na řádku krát počet řádků, většinou je
poměr šířky a výšky obrazovky 4:3
800 × 600, 1024 × 768, 1280 × 1024, 1600 × 1280 - optimální rozlišení pro příslušné délky
úhlopříčky
velikost (rozteč) luminiscenčních bodů - dnes běžně kolem 0,25 mm
obnovovací frekvence (Refresh Rate, V-Sync)
udává jak rychle dokáže monitor překreslit všechny pixely na všech řádcích - paprsek putuje po
řádcích zleva doprava a odshora dolů
dolní ergonomická hranice je 75 Hz, při níž je celá obrazovka překreslena 75-krát za sekundu
CRT
Plazmová televize
Mezi skleněné desky je umístěno velké množství vzájemně
oddělených buněk naplněných plynem. Po přivedení napětí
na elektrody v buňce dojde k výboji a vznikne ultrafialové (okem
neviditelné) záření, které dopadá na vrstvu luminoforu, která
vyzařuje světlo dané barvy. Intenzita (jas) každého bodu se
ovládá množstvím výbojů za jednotku času.
LCD
U LCD (Liquid Crystal Display) obrazovky je každý pixel tvořen trojicí subpixelů.
Zezadu je displej prosvěcován zdrojem bílého světla (zářivka, výbojka, nebo
LED diody). Před každý subpixelem je barevný filtr tvořící základní barvy RGB.
Viz například červený subpixel:
"Elektronický papír"
"Elektronický papír" používá k zobrazování
mikrokapsule obsahující černé a bílé kuličky s
elektrickým nábojem. Přivedením impulzu napětí
na elektrody se opačné póly přitáhnou a kuličky
se přeskupí. Tak zůstanou až do další změny.
Na změnu stavu je zapotřebí jen zanedbatelné
množství energie a zobrazovač nepotřebuje
podsvícení - navíc je dobře čitelný i na přímém
slunci. Změna je ale příliš pomalá (řádově 0,5
s), proto se tyto zobrazovače používají například
v elektronických čtečkách knih nebo v digitálních
hodinkách, kde není potřeba zobrazovat rychlé
změny.
Syntéza fluoresceinu
Kondenzační reakce ftalanhydridu (půl lžičky) s resorcinolem (půl
lžičky)
Fluorescein na Den svatého
Patrika
Jak vzniká polární záře?
Na Slunci vznikají vlivem nerovností v
magnetickém poli sluneční skvrny. U těchto skvrn
vznikne jedna masivní protuberance (erupce).
Mrak částic slunečního větru tvořený protony,
elektrony a alfa částicemi letí vesmírem (rychlostí
řádově 0,1 % rychlosti světla) a pokud se na své
cestě setká s magnetickým polem Země, tak ho
ono pole většinu odrazí dál do vesmíru, ale část
ho zachytí a stáčí po spirálách směrem k
magnetickým pólům Země. Tam sluneční vítr
interaguje s atmosférou a vzniká polární záře.
Urychlené částice narážejí do molekul plynů v
atmosféře a excitují je. Po následné de-excitaci
jsou vyzářeny fotony (kyslík – 557,7 nm).
Děkuji za pozornost...