OPTICKÁ MIKROSKOPIE D.Pavliňák - 2018 výuka C2690 1 OPTICKÁ MIKROSKOPIE – LIDSKÉ OKO Oblast vidění: • Fotopické (denní) • Barevné vidění • Zajištěno čípky • Vnímaný jas min. 102 cd/m2 • Vjem vlnové délky 400-750 nm • Max. citlivost 555 nm • Plná adaptace 20-60 s. • Skotopické (noční vidění) • Vnímání pouze jasu • Zajištěno tyčinkami • Vnímaný jas min. 10-3 cd/m2 • Max. citlivost 555 nm • Plná adaptace 40-60 min. 2 OPTICKÁ MIKROSKOPIE – LIDSKÉ OKO ▪Čočka může prostřednictvím ciliárního aparátu měnit zakřivení (akomodaci) a tím i optickou mohutnost. (Akomodace zajišťuje ostření na různou vzdálenost) ▪Blízký bod - (maximální akomodace čočky) je nejbližší bod, při kterém lidské oko vidí ostře. U zdravého dospělého člověka je cca 25 cm. ▪Vzdálený bod – největší vzdálenost, od které oko vidí ostře bez akomodace tzn. zaostřeno na nekonečno. U dospělého člověka od 5 m. ▪Rozlišovací schopnost lidského oka je cca 0,2 mm (při vzdálenosti předmětu od oka 25 cm). ▪Oko tvoří spojnou optickou soustavu s měnitelnou ohniskovou vzdáleností. Vzniklý oraz je zmenšený, převrácený a skutečný. 3 OPTICKÁ MIKROSKOPIE •Mikroskop – zařízení, které používáme k pozorování předmětů, které nejsme schopni spatřit pouhým okem. Optická soustava mikroskopu: • Objektiv – soustava čoček s velmi krátkou ohniskovou vzdáleností. Zobrazuje předmět převrácený, skutečný a zvětšený. • Okulár- soustava čoček. Vytváří obraz zdánlivý, přímý a zvětšený. • Kondenzor – je zjednodušeně osvětlovací soustava mikroskopu. (Ve skutečnosti má konstrukce kondenzoru významný vliv na kvalitu zvětšení a zobrazení zkoumaného předmětu.) 4 OPTICKÁ MIKROSKOPIE •Rozlišovací schopnost mikroskopu – schopnost odlišit od sebe dva body. Je dáno především vlnovou délkou záření, které prochází mikroskopem. U světelné mikroskopie je přibližně 0,25 µm. (cca 1000x více než u lidského oka) •Zvětšení mikroskopu – Maximální užitečné zvětšení je až 2000x. (Maximální užitečné zvětšení je však silně závislé na konstrukci mikroskopu.) 5 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - OMEZENÍ • Bodová rozlišovací mez oka je cca 0,2 mm • Bodová rozlišovací mez mikroskopu je cca 0,002 mm • Objektiv má tím lepší rozlišovací schopnost, čím bližší dva body dovede rozlišit, neboli čím je vzdálenost „d“ mezi nimi menší. • Mez rozlišení mikroskopu (ovlivňuje): • Ohyb a interference světla • Numerická apertura • Kondenzor • Vady čoček • Ohyb a interference - d = λ / NA • je dáno vlnovou délkou světla a numerickou aperturou • Numerická apertura (NA) - NA = n*sinα • Bezrozměrné číslo; dáno kvalitou objektivu a indexem lomu prostředí. Nejlepší objektivy mají NA cca 1,3) 6 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - OMEZENÍ •Kondenzor - d = λ/(NAobj + NAkon) • Má za úkol efektivně koncentrovat světelný tok do roviny preparátu a do vstupní pupily objektivu. V praxi jde o technický problém konstrukce kondenzoru, jeho nastavení a kvality provedení. •Vady čoček (základní) . Sférická aberace - světelné paprsky na okraji čočky se lámou více, než poblíž její optické osy. Chromatická aberace – ohnisková vzdálenost čočky je závislá na vlnové délce záření. 7 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - OMEZENÍ • Užitečné zvětšení mikroskopu – Zužitečné= dRLO/dmin. • dRLO (rozlišovací schopnost lidského oka (200µm; 25 cm) • dmin. (rozlišovací schopnost objektivu; pro nejlepší apertury je to cca 0,17 µm) • Celkové užitečné zvětšení mikroskopu (zjednodušeně) • V praxi se jedná o zvětšení, které ještě vede k pozorování nových podrobností. • V případě, že se vzrůstajícím zvětšením nepozorujeme žádné nové detaily, ale pouze zvětšený obraz, jedná se o prázdné zvětšení. (dá se zjednodušeně připodobnit k digitálnímu zoomu) • Zužitečné celkové= (zvětšení objektivu x zvětšení okuláru) x NA • V praxi platí pro klasické světelné mikroskopy Zužitečné celkové = (500 až 1000) × NA 8 OPTICKÁ MIKROSKOPIE – ZOBRAZOVACÍ METODY •Zobrazovací metody: • Metoda světelného pole (brightfield) – Je metoda procházejícího světla, tedy světlo prochází vzorkem. Vzorek má pak tmavé obrysy a nachází se ve světlém poli. • Metoda tmavého pole (darkfield) - do roviny vzorku vstupují světelné paprsky šikmo. Vzorek je tedy osvětlený ze stran do objektivu vstupuje jen světlo rozptýlené vzorkem. Vzorek se tedy jeví jako „svítící“ na tmavém pozadí. 9 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - METODY •Mikroskopie fázového kontrastu • Metoda slouží ke zvýraznění kontrastu a průhledných struktur. Využívá se například v biologii pro zobrazení buněčné struktury. •Polarizační mikroskopie • Analyzujeme polarizované světlo – tj. vzorky schopné stáčet rovinu polarizovaného světla. (Nachází využití v geologii nebo materiálovém inženýrství pro studium krystalických rovin) 10 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - METODY •Ultrafialová mikroskopie • Zdroj světla je v oblasti UV – zvyšuje rozlišovací schopnost mikroskopu • (často najdeme ve spojení s fluorescenční mikroskopií) •Infračervená mikroskopie • Zdroj světla je v IR oblasti – na principu absorpce IR záření. (Často se používá v kombinaci s termickou analýzou nebo IR spektroskopií.) 11 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - METODY •Fluorescenční mikroskopie • Na principu analýzy emitovaného záření barvivem. Jako zdroj se používá záření o kratší vlnové délce např. UV dioda, laser. Má důležité uplatnění v biologii pro studium buněčných struktur. 12 OPTICKÁ MIKROSKOPIE - METODY •Konfokální laserová mikroskopie • Konfokální mikroskop je využíván při studiu povrchových vlastností materiálů a měření výšky strukturních elementů. Má vyšší rozlišení než klasický světelný mikroskop. • Zdrojem světla je laser. • Konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem označujeme jako CLM (LSCM). Rastrování probíhá posouváním paprsku pomocí clony postupně do všech bodů roviny v ose Z. • Pokud je postupně nasnímáno dostatečné množství rovin, je možné pomocí počítače složit 3D model preparátu. • Lze kombinovat s fluorescenčními technikami pro biologické preparáty. 13