Osnova 3. přednášky
METODY
• Diagnostické metody
• Analytické metody
• Kvasinkové modelové organismy
Určení (nových) kmenů v nových lokalitách
Určení kmene v klinických izolátech (odlišení patogenních kmenů Candida…)
Kontrola čistoty kmene pro biotechnologické procesy (Saccharomyces
cerevisiae – pivo)
zpracování vzorků:
z půdy: promývání v destilované vodě → homogenizace → třepačka
…
klinické vzorky: tělní tekutiny, stěr nebo pomocí lepivé pásky …
a pak vysetí na Sabouraudův agar nebo bohaté médium → kultivace
2-7 dní při teplotách 22-42°C (37°C)
identifikace/analýza:
- fenotypové metody – morfologie kolonií, morfologie buněk (…spor)
- biochemické vlastnosti (fermentace cukrů, asimilace uhlíkatých nebo
dusíkatých substrátů … růst na chromogenních plotnách)
moderní metody
- PCR (nested, multiplex, RFLP),
- sekvenační (NGS technologie),
- hmotnostní spektrometrie
Lékařská mykologie – Bi3390
V klinické praxi je důležitější rychlost než přesnost (při zachování správné léčby)
http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych-
moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847
doc. P. Hamal, UP Olomouc
Campanhaetal.,2005,OralDIseases
Mikromorfologie - spory
C. dubliniensis:
nadbytek
chlamydospor na
koncích krátkých
pseudohyf
C. albicans: na delších
hyfách či pseudohyfách
jen jedna terminální
chlamydospora
- test klíčních hyf, C. albicans přímo z pozitivních hemokultur na
kaseinový agar nebo kukuřičný agar (různý výsledek)
Mikromorfologie - kolonie
Staibův agar (37°C)
C. dubliniensis C.albicans
- souprava Iatron Serological Candida Check
Kit (Iatron Laboratories) nebo Bichro-latex
Albicans (Fumouze Diagnostics)
Sérologické testy
Latexová aglutinace
C. dubliniensis C. albicans
Teplotní test
Totéž platí pro kvasinky
Specifické protilátky proti antigenům buněčné stěny
kvasinky
latexové částice
Chromogenní testy
- test enzymových aktivit - chromogenní substráty – např. tetrazoliové soli
Cakr Cagl
Caal Catr
tetrazoliová sůl
redukce
Výše uvedené metody se používají běžně v klinických laboratořích
Jsou k dispozici kompletní sady souprav
Chromogenní testy
http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych-
moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847
doc. P. Hamal, UP Olomouc
* **
*
*
Příklad analýzy:
CANDIchrom – chromogenni metoda
(enzymatická přeměna tetrazoliové
soli) 1-2 dny
*ELITex – latexové aglutinační metody
(protilátky) 5 minut
*ELIchrom – biochemický test (aktivita
trehalasy) 20 minut
ELIchromFUNGI – biochemické testy
1-2 dny
Candida, Saccharomyces, Rhodotorula, Cryptococcus,
Trichosporon, Geotrichum, Kloeckera, Pichia
Biochemické testy
- Biochemické parametry – založeny na schopnosti utilizace uhlíkatých
látek (cukrů), přeměnit dusíkaté látky (hydrolýza močoviny - ureasa)
- Tato schopnost se odvíjí od metabolických schopností daného druhu –
přítomnosti specifických enzymů (především dehydrogenas, fosfatás, βglukosidáza,
β-N-acetylhexosaminidázy)
(např. C. dubliniensis není schopna utilizovat D-xylózu, D-trehalózu,
methyl-α-D-glukosid –chybí β-D-glukosidázová aktivita; C. albicans
není schopna utilizovat glycerol)
hundreds
A.J. Kluyver – počátek 20. stol.
Biochemická charakteristika
• Rhodotorula
• Ureáza +
• KNO3 utilizace •
Fermentace
– Mal, Lac, Sac, Glc –
• Asimilace sacharidů
– Mal+ Sac+ Lac–
Raf+ Mlz+
– Xyl+ Ara+
– Inl- Aml–
Cel+ Tre+
• Sporidiobolus
• Ureáza +
• KNO3 utilizace –
• Fermentace
– Mal, Lac, Sac, Glc –
• Asimilace sacharidů
– Mal- Sac+ Lac+
– Raf+ Mlz+
– Xyl+ Ara–
Inl- Aml+
– Cel+ Tre+
Mal – maltosa, Lac – laktosa, Ara – arabinosa, Aml - amylosa
Je možné určit až 267 druhů kvasinek z 53 rodů
(ale pouze 50% spolehlivost)
nárust kvasinek
http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/identifikace-kvasinek-z-klinickeho-materialu-prehled-soucasnych-
moznosti-se-zamerenim-na-fenotypove-metody-a-komercni-produkty-455847
doc. P. Hamal, UP Olomouc
Postup klinického vyšetření
Molekulární taxonomie
- konvenční taxonomie je problematická :
- morfologie kvasinek není stabilní→ roztěr a nárůst trvá několik
dní (prodlužuje se včasná diagnóza …) –
- molekulární taxonomie (komerční účely - odlišit kmeny S.c.)
- pulsní gelová elektroforéza (PFGE), FISH (karyotyp)
- PCR, restrikční polymorfismus (odlišení druhů)
- nejnověji MALDI-TOF (taxonomie)
- většinu morfologických nebo enzymatických … charakteristik lze
zvrátit mutací (v jediném genu)
- obtížná izolace DNA, proteinů … z kvasinek
- je třeba nejdříve narušit silnou buněčnou stěnu … pomocí enzymů
nebo mechanicky
- poté PFGE nebo dále extrahovat DNA (např. fenol-chloroform, poté
srážení etanolem)
- specifické sekvence lze identifikovat pomocí Southern blotu nebo PCR
- izolace DNA a štěpení restrikční endonukleázou -> agarozový
gel -> přesátí na membránu -> sonda značená digoxigeninem (většinou
se využívá sekvencí rDNA)
Identifikace založená na odlišnosti typických
sekvencí DNA
• 1. sada primerů je universální kvasinková (pozitivní kontrola, vyšší
proužky) a 2. sada primerů je druhově specifická (méně konzervovaný
úsek DNA) - separace gelovou elektroforézou (barvení ethidium bromidem,
UV transiluminátor)
• po PCR může následovat štěpení restrikční endonukleasou a odlišení druhů
na základě odlišné délky štěpných produktů (tzv. RFLP – restriction
fragment length polymorfism)
x
xx
PCR
Nested („zahnízděná“) PCR
• amplifikace probíhá dvoufázově
• v 1. fázi je pomocí jedné sady primerů (kvasinkové) namnožena delší
sekvence nukleové kyseliny
• takto získané amplikony jsou pak přeneseny do jiné amplifikační zkumavky
obsahující druhou dvojici primerů (druhová), specifických k vnitřní oblasti
úseku amplikonů
• konzervovaná intergenová oblast rDNA
• detekce gelovou elektroforézou
• eventuálně sekvenace
Romeo et al., J. Microbiol Met 79 (2009)
univerzální
primer (konzervativní oblast 5.8S rDNA)
Candida glabrata
397bp
Candida nivariensis
293bp
Candida bracarensis
223bp
Multiplex PCR
• amplifikace se směsí primerů (jeden univerzální, další specifické)
Klasická elektroforéza dokáže rozlišit fragmenty pouze do velikosti 40-50kb
(větší molekuly se pohybují stejnou rychlostí nezávisle na velikosti)
PFGE = pulse field gel electrophoresis (elektroforéza s měnícím se elektrickým
polem, při změně směru elektrického pole trvá větším molekulám DNA déle,
než se přeorientují - umožňuje separovat molekuly velké několik Mbp)
• contoured clamped homogeneous electric field (CHEF)
• gel obsahuje vzorky DNA uvnitř agarózových bločků (minimalizace
náhodných zlomů velkých molekul DNA)
PFGE
Karyotypizace
• S.c. kmeny mají podobný karyotyp – většinou se liší délkou chromosomu
XII (podle počtu rDNA genů)
• Průmyslové (pivní) kvasinky jsou většinou polyploidní – homologní
chromosomy mají odlišné velikosti
• Srovnání kmenů pro fylogenetické účely (intaktní nebo RE naštěpené
chromosomy)
• Určení příbuznosti izolátů jednoho druhu pro epidemiologické účely např.
kmeny z různých míst od jednoho pacienta, kmeny od 2 různých pacientů,
kmeny od zdravotního personálu a pacientů
21
(A) Nekompletní naštěpení RE
(B) Degradace nukleázou
(C) Oprava přidáním 75 mM
thiomočoviny do pufru
Studie populací S. cerevisiae a S. paradoxus
• Sekvenace (+ hybridizace na čipech) > 100 kmenů z různých koutů
světa (především vinné kmeny)
• S. paradoxus – linie izolované podle lokalit
• S.cerevisiae - 3-4 původní linie,
které se díky člověku křížily …
• ukazují na geografickou závislost
Nature 458, (2009), p337
Studie populací S. cerevisiae
• NGS sekvenace > 100 kmenů z různých koutů světa a různých
biotechnologií
• (SNPs) ukazují na geografickou závislost
Gallone et al, Cell, 2016
pivní linie ve VB, US, Belgii … a
další linie č.2
sake v Asii (i bioetanol v Číně)
mixed
- specifické silné belgické ales
(refermentace v lahvích)
- chleba
Gallone et al, Cell, 2016
spirits – netvoří
jednu linii
(nepoužívají se
opakovaně – není
selektivní tlak –
moderní
technologie)
S. paradoxus
outgroup
americké pivo má
kořeny v Británii
•pivo 1 a 2 - nové pivní linie (evolučně izolované –– 2 domestikační události - linie 2
domestikace s vinnými kmeny) - (geny podílející se na C a N metabolismu, flokulaci
… mají nejvíce (CNV – copy number) variací)
Mosaikové kmeny
analýza genomu a fenomu:
průmyslově-specifická selekce na toleranci ke stresu (vyšší obsah etanolu
7-15%), využití cukru, specifické aroma, nižší schopnost reprodukce
„očkováním“ předchozích pivních
kultur do nových kvasných procesů
(ztráta kontaktu s přirodním
prostředím - ~75 000 generací) –
např. ztráta schopnosti sporulovat
(stále bohaté médium), rychlejší
evoluce … nebo naopak zvýšení
resistence vůči sulfátům
(přidávaným kvůli konzervaci)
mutace a duplikace v MAL genech
– zlepšení schopnosti utilizace
maltosy
- nonsense mutace PAD1 a FDC1
(snížení produkce 4-vinyl
guaiacolu odpovídajícího za
nepříjemné aroma piva) …
Gallone et al, Cell, 2016
vznik
klášterních
pivovarů
nejvíce amplifikací v MAL genech (IMA2, IMA3, MAL31, MAL33, MAL32) u
pivních kvasinek (rostou na maltose), zatímco ve vinných kmenech došlo k
mnoha delecím těchto genů (ve vinném moštu maltosa není) – obecně více
delecí než amplifikací (v genomech analyzovaných kvasinek)
Gallone et al, Cell, 2016
analýza genomu
hierarchické členění výsledků analýzy fenotypu (fenomu) – určitá korelace s
genomem … - pivní linie (beer1) nejsou příliš odolné vůči stresu (nejsou mu
vystaveny v pivovarech), zatímco vinné kvasinky jsou velice odolné (kvasné
prostředí je bohaté na cukry a vyšší koncentrace alkoholu – hladina cukrů
se v různých sezónách liší … mimo sezonu přežívají v „přírodním“ prostředí
– musí být adaptabilnější než pivní)
Gallone et al, Cell, 2016
analýza fenomu
víno pivo
hierarchické členění výsledků analýzy fenotypu
(fenomu) – určitá korelace s genomem … - pivní
linie (beer1) nejsou příliš odolné vůči stresu
(nejsou mu vystaveny v pivovarech), zatímco
vinné kvasinky jsou velice odolné … zvýšení
resistence vůči sulfátům (přidávaným kvůli
konzervaci)
analýza fenomu
víno pivo
Gallone et al, Cell, 2016
Gallone et al, Cell, 2016
- divoké typy chrání před rostlinnými toxiny
- při pečení chleba jsou tyto látky zničeny
- pivní kmeny - nonsense mutace PAD1 a FDC1
(snížení produkce 4-vinyl guaiacolu odpovídajícího za
nežádoucí aroma piva)
- křížily pivní kmen schopný
produkce 4-vinyl guaiacolu s
kmenem pro výrobu saké (vysoká
produkce alkoholu)
- pivní produkt se specifickým
aroma a vysokým obsahem
alkoholu
-
+
• hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti
matrice s průletovým analyzátorem (matrix-assisted laser
desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry– MALDI-TOF)
• Umožňuje odpaření a ionizaci netěkavých biologických vzorků z
pevné fáze přímo do plynné
• Vzorek je smíchán s tzv. matricí, směs se nanese na speciální
kovovou destičku a nechá zaschnout
• Destička se vloží do iontového zdroje a ve vakuu je ozářena
pulsním laserem (UV)
• Energii laserového pulsu absorbuje matrice a předá ji molekulám
analytu – odpaří se
• ion vstupuje do vakua v trubici detektoru - z jeho pohybu
vakuovaným prostorem lze vypočítat poměr jeho hmotnosti a náboje
(z doby letu částice)
MALDI-TOF
• Charakter spektra závisí na krystalizaci a ionizačních vlastnostech
vzorku  výška píku je rovna relativní koncentraci proteinu v místě
ionizace
• Při srovnávání spekter druhů uvnitř rodu se hledají rodově
charakteristické signály píků
• Identifikace na úroveň kmenů možná díky detekci charakteristických
proteinů a peptidů
Qian a spol, Anal Bioanal Chem, 2008
MALDI-TOF
Konecna a spol, JAFC, 2012
Proteiny v pivu
Stříbrem barvený 2D gel
Opathy, C., Gabaldón, T. (2019). Recent trends in molecular diagnostics of yeast
infections: from PCR to NGS, FEMS Microbiology Reviews, 43 (5), 517–547. doi:
10.1093/femsre/fuz015
kvasinkové modelové organismy
• Rychle se množící EUKARYOTNÍ mikroorganismy
(90 min/dělení, 25-30°C)
• Vytváří kolonie na plotnách - mikrobiologické metody (otiskování
ploten, kapkovací test => toxiny v plotnách – HU, MMS …)
• Stabilní haploidní i diploidní formy
• Haploidní buňky lze křížit na diploidní (heterozygotní mutanty)
• Diploidní buňky lze sporulovat a využít pro genetickou analýzu
(tetrádová analýza)
• Lze transformovat DNA (plasmidy i linearní)
• Centromerické a multicopy plasmidy
• Vysoká frekvence homologní rekombinace
(lineární DNA)
• Lze připravovat deleční a mutantní kmeny
• Vydrží v >15% glycerolu na -70°C „indefinitely“
- Více v dalších přednáškách
kvasinkové modely
• S.c. má kompaktní genom – knihovny s genomovou DNA (ne cDNA)
• Kompletně osekvenovaný genom (genomové aplikace)
• EuroFan projekt – delece všech S.c. genů (+GFP, +2-hybrid)
• Mikročipy, NGS - expresní profily za různých podmínek
• 6. FP – „3D Repertoire“ konsorcium (http://www.3drepertoire.org) strukturu
všech (cca800) komplexů S. cerevisiae
• Techniky synchronizace buněk
• Techniky barvení (např. aktinový cytoskelet = phaloidin,
buněčná stěna = calcofluor)
• Řada životních dějů má analogii v procesech v savčích buňkách
(lidské geny testovány v kvasinkách - nemoci, metabolismus,
regulační mechanismy)
Bellen a spol, Devel., 2021
• Techniky barvení
– FISH – lokalizace spec. sondy
– DNA/jádro – DAPI
(4',6-diamidin-2-fenylindol)
– aktin – phaloidin
– buněčná stěna – calcofluor
– Endocytóza ->vakuoly – FM4-64
– Mitochondrie, ER - DiOC6
(3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide)
– proteiny tagované GFP (in vivo)
… metody studia – fluorescenční …
Matsuyama et al.: Nature Biotech, 2006
Určení lokalizace
Chong et al., Cell, 2015
Koh et al., G3, 2015
http://cyclops.ccbr.utoronto.ca/
Picotti et al., Nature, 2013
Vygenerování referenční „mass-spectrometric“ mapy pro kvasinkový proteom
Tak jako se sekvenoval kvasinkový genom (první eukar.), tak se „sekvenuje“ proteom
– slouží ke sledování exprese/přítomnosti proteinů v kvasinkové buňce za různých
podmínek/situací (např. změny proteomu v průběhu buněčného cyklu, změny
metabolismu na různých substrátech)
MALDI-TOF
Elektronová mikroskopie
- studium buněčné stěny
… organel (sekrece …)
více Dr. Špirek
- šipky ukazují na jaderné
póry
- vzorek „prosáknut“
epoxypryskyřicí a osmiem
- „focused-ion beam
scanning“ 3nm/pixel
TEM FIB - SEM
Wei, et al., BioTechniques, 2012
cryoEM tomografie
http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00182/Cyzmmek_Supplementa_182027a.mpg
Wei,etal.,BioTechniques,2012
ER
mitochondrie
jádro
cytoplasmatická
membrána s
invaginacemi
http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00182/Cyzmmek_Supplementa_182027a.mpg
Wei, et al., BioTechniques, 2012
Wang, Current Genetics, 2016
Výzkum
- Je třeba kvasinkám rozumět (na molekulární úrovni), aby bylo možné je využít
např. pro biotechnologie, výzkum (od jednoduchých základních mechanismů ke
studiu složitějších … až k objasňování lidských nemocí)
- S. cerevisiae a S.pombe jsou modelovými organismy
- jednoduchá eukaryontní buňka (základní procesy jako u vyšších eukar.)
- 1. osekvenovaný eukaryontní genom, 1. syntetický eukar. chromosom (cca
2300 z 6000 genů má ortology v genomu člověka)
- ½ z 550 esenciálních genů je komplementována lidskými ortology
-Vícevdalšíchpřednáškách
Kim et al., J Microb, 2020
Laurent et al, Brief in Funct Genomics, 2016
Výzkum
- sekrece, endocytóza, buněčná stěna (prof. Schekman …)
- mechanismy opravy poškozené DNA (nádorové syndromy)
- metody využívající kvasinky (např. 2-H, reporterové systémy …
Wood et al, Nature, 2002
Priony – epigenetická informace kvasinek
Adhesivní vlastnosti mohou být ovlivněny přítomností prionů [PSI+] kódovaných
Sup35 genem - jeho PrD doména spouští tvorbu amyloidových agregátů)
Sup35 je translační terminační faktor (zastavuje translaci na STOP kodonu) – pokud
agreguje/nefunguje, dochází k read-through genů tj. vznikají proteiny s delší sekvencí
a novými vlastnostmi (záleží na genomu dané kvasinky jaké) – mohou dát kvasince
nové výhody (např. zvýšenou rezistenci k fluconazolu)
Halfmann a kol., 2012, Nature
GdHCl–inhibitsHsp104
Priony – epigenetická informace kvasinek
Kvasinkový [GAR] prion je indukován některými bakteriálními toxiny – způsobuje
potlačení glukosové represe a „přepnutí“ kvasinkového metabolismu na ostatní cukry
– kvasinky tak získávají schopnost využít větší spektrum substrátů a nemění je
striktně na alkohol – diky nižšímu množství alkoholu uvolněnému do prostředí mohou
lépe přežívat i bakterie (pro něž jsou vyšší koncentrace etanolu toxické) – vzájemně
výhodné pro oba mikroorganismy
Jarosz a kol., 2014, Cell
GLY+GlcN medium
Krobitsch&Lindquist,PNAS,2000
Analýza polyQ (glutaminové repetice) v kvasinkách
- polyglutaminové repetice (CAG triplet slipage) v proteinech (huntingtin - Ht) způsobují
závažné neurodegenerativní onemocnění (Huntigtonovu nemoc)
- Ht-GFP (s různě dlouhými polyQ) byly exprimovány v S. cerevisiae a sledován
vznik agregátů/nerozpustných proteinů – závislost na chaperonech (delece
Hsp104 snižovala agregaci a zvyšovala rozpustnost)
∆hsp104huntingtin