Protoplasty kvasinek jako
modelový objekt
Historie objevu modelu protoplastů
Metody přípravy protoplastů
Metody regenerace buněčné stěny u protoplastů
Fúze protoplastů
Sexuální hybridizace u protoplastů
Genetická transformace kvasinek na modelu
protoplastů
Lýza buňkové
stěny/mechanické
protržení
Rostlinná buňka
Protržení buňkové
stěny
Protoplasty jsou buňky s
odstraněnou buňkovou stěnou,
cytoplasmatická membrána je
vnější vrstva buňky
Historie objevu
• Protoplasty rostlinných buněk (Klebs 1887,Townsend 1897)
• Sféroplasty, L-formy a protoplasty bakterií (Weibull
1953, Dienes 1939, Kandler, 1954)
• O.Nečas a plasmatické koule kvasinek (Nečas,
Chekhoslovatskaia Biol 1954)
• Autolytické protoplasty (O. Nečas, Nature 1956)
• Protoplasty kvasinek připravené lýzou b. stěny,
Helix pomatia – šnekáza (Eddy a Williamson,1959)
• Regenerace protoplastů v gelech (Nečas, 1962, A.
Svoboda 1966)
Metody přípravy protoplastů
• Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém
roztoku
• Autolýza buněčné stěny
• Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu
– Výběr osmotika - sorbitol, manitol, KCl, MgSO4 a koncentrace
– Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně –
merkaptoetanol, dithiothreitol
Buňky kvasinky Saccharomyces
cerevisiae a čerstvě vytvořené protoplasty
Trigonopsis variabilis
Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v
destilované vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3)
Růst protoplastů v tekutém mediu nebo na povrchu agarových bločků: jádra se
dělí, cytoplasma vytváří vakuolizované útvary.
Regenerace buněčné stěny na povrchu protoplastů při kultivaci v
tekutém mediu a v gelu
Morfologie regenerace protoplastů v 2% agarovém gelu
Tvar rostoucího protoplastu je není určován regenerující buněčnou stěnou, ta jen
modifikuje morfologii rozpínající se cytoplasmy
Regenerace protoplastů v polyethylenglykolovém mediu
Fúze protoplastů je fyzikální fenomén, při kterém dochází k fúzi dvou a
vícero protoplastů během jejich vzájemném blízkém kontaktu (náhodném
nebo indukovaném)
Indukovaná fúze:
Mechanická fúze – mikromanipulátor
Chemofúze:
dusičnan sodný, PEG, Ca2+ ionty,
způsobují adherenci protoplastů
nespecifická, levná, ale cytotoxická
může vytvářet masivní fúzní produkty
Elektrofúze
elektrická stimulace
elektrické pole se slabou sílou (1-5 kV/cm)
kontrolovatelná, reprodukovatelná
méňe toxická, ale drahá
Optimalizace fúze protoplastů
(a) Nízká koncentrace PEG způsobuje prasknutí protoplastů
(b) Vysoká koncentrace způsobuje nadměrné shlukování
Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu a vytváření polyprotoplastů po
zředění živným mediem
Elektrofúze
Povrchy agregovaných
protoplastů ve 40% PEG
Lokální poruchy struktury
plasmatické membrány po
inkubaci protoplastů ve
40% PEG 30 min při 370 C
Aplikace protoplastů kvasinek v
buněčné biologii a genetice
• Studium funkce buněčné stěny
mechanická bariéra
signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj
regenerační schopnosti buňky
syntéza komponent buněčné stěny
• Studium struktury plasmatické membrány
• Studium nepohlavní hybridizace kvasinek
vnitrodruhová a mezidruhová hybridizace
• Transformace kvasinek
Protoplasty S.c.
α + a, pouze
neorientovaný
růst, žádná fuze
α protoplasty +
a buňky:
párovací
výběžky tvoří
pouze buňky
Orientovaný růst
buněk směrem k
rostoucímu
protoplastu –
žádná fuze
Protoplasty opačných
párovacích typů fúzují
teprve tehdy, zregenerují-li
svoji buněčnou stěnu
Využití fúze protoplastů
Fúze protoplastů mezi Saccharomyces cerevisiae var. Diastaticus a S.
bayanus/uvarum vedla k vzniku klonů produkujících pivo s nízkým
obsahem cukru a zajímavé vůně. (Saccharo (cukr) myces (houby)
cerevisiae (pivo))
Hybridní klony – produkce glycerolu (kvalita vína), tolerance nízkých
teplot (řízená fermentace – lepší macerace vín), osmotolerance,
metabolizmus kyseliny jablečné, produkce vonných esterů
Torulaspora delbrueckii diploidní kmen byl vytvořen pro průmyslové
fermentační aplikace.
Polyploidní kvasinky – tolerance vyšší teploty, robustní fermentace,
tolerance vyššího obsahu alkoholu
Produkce cybridů – přenos dsRNA plazmidu nesoucího killer toxin do
kvasinek pro řízenou fermentaci => omezení růstu divokých kvasinek
Mezidruhová fuze S.cerevisiae his- x S.pombe trp- :tyto druhy jsou
fylogeneticky vzdálené, S. cerevisiae má 16 chromosomů, S. pombe pouze 3.
Protoplasty mohou fúzovat, v minimálním agaru i rostou, na hybridní buňky však
nerevertují
Produkce mezidruhových cybridů
Fluoroorotová kyselina
Selekce ura- genu
ura- gen Ura+ gen
Fylogenetický strom -D1/D2 doména 26S rRNA genu
MtDNA donorů mitochondrií a cybridů
štěpen EcoRV restrikčním enzymem
donor cybrid akceptor
Pulzní elektroforéza chromozomů
akceptor
donory cybridy
Cybridy s mtDNA blízkých
druhů
Cybridy s mtDNA vzdálených druhů
Růst v médiu s nefermentovatelným
substrátem
Protoplasty zprostředkovaná transformace
Příprava protoplastů, odstranění buňkové steny (polysacharidy - glukan,
manan, chitin), složení je dynamické, různé složení u odlišných kvasinek =>
optimální výběr enzymů (šnekáza, Zymolyáza, Lyticase, beta-glucanase a
pectinase z Trichoderma sp. a Aspergillus niger), lýza probíhá v pufru
obsahujícím osmotický stabilizátor (např. 0,8-1,2 M sorbitol)
Transformační roztok dále obsahuje DNA, Ca2+ ionty (otvírá kanály v
cytomembráně a PEG (fúze protoplastů), inkubace na lede 30 minut
regenerace protoplastů na miskách bez selekčního tlaku
Alternativně DNA může být vnesena do lipozomú (Dioleoylphosphatidyl
ethanolamine (DOPE) or dioleoylphosphatidyl choline (DOPC))