Sequencing of DNA and proteins
Dávid Tužinčin
460988@mail.muni.cz
C9531 Strukturní Biochemie –seminář
DNA sequencing
Sanger sequencing
▶ Frederik Sanger britský
biochemik v
roce 1977 vyvinul
metodu pro sekvenaci
DNA - Nobelova cena
za chemii
▶ metoda se využívá
dodnes pro kratší
sekvence
PCR - Polymerase Chain Reaction
NTPs
DNA polymerase
Primers
(Dahal, 2022)
Sanger sequencing - ddNTPs
Sanger sequencing
DNA Sequencing | MolecularCloud
Sanger sequencing - original method
Genetic code
Exercise 1
1. zapište úsek sekvence vlákna DNA obsahujícího vaši cDNA, který odpovídá
uvedenému fragmentu výstupu sekvenátoru:
2. zapište příslušný úsek sekvence mRNA, kódující náš protein:
3. zapište úsek sekvence proteinu, který je kódován tím úsekem vašeho genu, jehož
sekvenci čteme ve výstupu sekvenátoru. Uveďte všechny aminokyseliny, které
můžeme jednoznačně určit:
Postup: v úloze sekvenujeme
komplementární vlákno ke kódujícímu
vláknu
1. Přepíšeme si výstup ze
sekvenátoru –>
5'ACTGAGTAACGAGGT 3'
A C T G A G T A A C G A G G T5' 3'
2. Výstup ze sekvenátoru je komplementární sekvence k sekvenci, která
byla sekvenována pomocí Sangerovi metody
–> 3' TGACTCATTGCTCCA 5'
3. Přepíšeme sekvenci z bodu 2. tak aby byla 5’ –> 3’
–> 5' ACCTCGTTACTCAGT 3'
Tohle je sekvence, kterou sme posílali osekvenovat, a tudíž
řešením první úlohy 1
4. Úloha 2 . sekvence kódujícího vlákna je tedy komplementární k
nekódujícímu vláknu z úlohy 1 . zároveň ho chceme zapsat od 5’
–> 3’ . Je to tedy vlastne prěsne sekvence, kterou sme získali ze
sekvenátoru, akorát v RNA je místo T –> U
–> 5'ACUGAGUAACGAGGU 3'
5. Úloha 3 . Sekvenci mRNA z úlohy 2 přeložíme pomocí
genetického kódu na sekvenci aminokyselin.
–> TE-RG
Protein sequencing
Mass Spectrometry
▶ 1. ionization (electrospray, MALDI)
▶ 2. fragmentation (collision induced fragmentation)
▶ 3. detection
Peptide fragmentation
N
Cα
C
R1
O
Ni+1
Cα
i+1
Ci+1
H O
R2H
C
H
Peptide fragmentation
N
Cα
C
R1
O
Ni+1
Cα
i+1
Ci+1
H O
R2H
C
H
b,y
Peptide fragmentation
N
Cα
C
R1
O
Ni+1
Cα
i+1
Ci+1
H O
R2H
C
H
b,ya,x
Peptide fragmentation
N
Cα
C
R1
O
Ni+1
Cα
i+1
Ci+1
H O
R2H
C
H
b,ya,x c,z
Peptide fragmentation
MS example of real spectrum
Peptide MH+ = 1826.98
AADFFVVPTGSHFYLR
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
165
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
186 = W
W
y4
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
57 = G 186 = W
W
y4y3
G
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
57 = G78 186 = W
W
y4y3
G
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
57 = G163 = Y 186 = W
W
y4y3y2
G Y
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
57 = G163 = Y156 = R 186 = W
W
y4y3y2y1
G Y R
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
57 = G163 = Y156 = R166 ? 186 = W
W
y4y3y2y1
G Y R
166
-18
- 1
147 = F
F
Exercise 2
Určete sekvenci pentapeptidu z hmotnostního spektra, ve kterém jsou přítomny
signály celého peptidu a všech y a b fragmentu (krom fragmentu b1, který v
praxi nevzniká).
b3 b4b2