CG020 Genomika Přednáška 1 Úvod do bioinformatiky Jan Hejátko Funkční genomika a proteomika rostlin, Středoevropský technologický institut (CEITEC) a Národní centrum pro výzkum biomolekul, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu 2  Schéma předmětu  Definice  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Spektrum „on-line“ zdrojů  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  GENOMOVÉ zdroje  Analytické nástroje  Vyhledávání homologií  Vyhledávání sekvenčních motivů, otevřených čtecích rámců, restrikčních míst….  Další www genomové nástroje Osnova 3 Schéma předmětu  Kapitola 01  Úvod do bioinformatiky  Kapitola 02  Identifikace genů  Kapitola 03  Přístupy reverzní genetiky  Kapitola 04  Přístupy genetiky přímé 4 Schéma předmětu  Kapitola 05  RNA interference a genomové editování  Kapitola 06  Genová exprese a chemická genetika  Kapitola 07  Protein-proteinové interakce a jejich analýza  Kapitola 08  Současné metody sekvenování DNA 5 Schéma předmětu  Kapitola 09  Struktura genomů  Kapitola 10  Evoluce genomů  Kapitola 11  Genomika a systémová biologie  Kapitola 12  Praktické aspekty funkční genomiky  Modelové organismy  PCR 6  Literární zdroje pro kapitolu 01:  Bioinformatics and Functional Genomics, 3rd Edition, Jonathan Pevsner, Wiley-Blackwell, 2015 http://www.bioinfbook.org/php/?q=book3  Úvod do praktické bioinformatiky, Fatima Cvrčková, 2006, Academia, Praha  Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey Literatura 7  Schéma předmětu  Definice Osnova 8  Sensu lato (v širším pojetí) zkoumá STRUKTURU a FUNKCI genomů  Sensu stricto (v užším pojetí) zkoumá FUNKCI jednotlivých genů - FUNKČNÍ GENOMIKA  používá zejména přístupy REVERZNÍ GENETIKY  Předpokladem je znalost genomu (sekvencí)práce s databázemi GENOMIKA-co to je? 9 3 : 1 Přístupy „klasické“ genetiky „Reverzně genetický“ přístup ? inzerční mutageneze 5‘TTATATATATATATTAAAAAATAAAATAA AAGAACAAAAAAGAAAATAAAATA….3‘ GENOMIKA-co to je? role BIOINFORMATIKY ve FUNKČNÍ GENOMICE BIOINFORMATIKA FUNKČNÍ GENOMIKA 10  Schéma předmětu  Definice  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY Osnova 11  Definice bioinformatiky (podle NIH vědeckého a technologického konsorcia pro biomedicínské informace) Výzkum, vývoj nebo aplikace výpočetních nástrojů a přístupů za účelem zvyšování rozvoje využití biologických, lékařských, dat o chování nebo zdraví, včetně těch, které umožňují taková data získávat, ukládat, organizovat, archivovat, analyzovat nebo vizualizovat. Bioinformatika 12  Interface of biology and computers  Analysis of proteins, genes and genomes using computer algorithms and computer databases  Genomics is the analysis of genomes. The tools of bioinformatics are used to make sense of the billions of base pairs of DNA that are sequenced by genomics projects. What is Bioinformatics? J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 13  Bioinformatika ve funkční genomice  Zpracování a analýza sekvenačních dat  Identifikace referenčních sekvencí  Identifikace genů  Identifikace homologů, ortologů a paralogů  Korelační analýzy mezi genomy a fenotypy (včetně člověka)  Zpracování a analýza transkripčních dat  Transkripční profilování pomocí DNA čipů nebo next-gen sekvenování  Vyhodnocování experimentálních dat a predikce nových regulací v přístupech systémové biologie  Matematické modelování genových regulačních sítí Bioinformatika 14  Every bp= 4 bits  Human genome = ~3 billion bp  = 4×3× 109  =1.2× 1010 bits  =1.5× 109 bytes (1.5 GB)  This amount of information is contained in a cell nucleus with 10μm diameter  There is ~2m of DNA in every somatic human cell  Each human in composed of about 1012 cells  Thus every human contains 2×1 1012 of DNA  =2× 109km of DNA  Distance from the sun to Uranus = 2.8×109km  Each single human contains enough DNA to stretch from the sun to Uranus Množství informace v DNA Bioinformatics, Stellenbosch University 15  Schéma předmětu  Definice  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Spektrum „on-line“ zdrojů Osnova 16 Spektrum on-line zdrojů 17  EBI http://www.ebi.ac.uk/services Spektrum on-line zdrojů 18  NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Spektrum on-line zdrojů 19  Schéma předmětu  Definice  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Spektrum „on-line“ zdrojů  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze Osnova 20  EMBL  http://www.ebi.ac.uk/embl/  GenBank,  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/  DDBJ,  http://www.ddbj.nig.ac.jp  zahrnují soubory primárních dat – sekvencí DNA a proteinů  Sekvence v databázích tzv. „Velké trojky“:  denně vzájemná výměna a zálohování dat  velká datová náročnost (kapacita i software) Primární databáze 21 Growth of GenBank Year BasepairsofDNA(millions) Sequences(millions) 1982 1986 1990 1994 1998 2002 J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 22 Growth of GenBank + Whole Genome Shotgun (1982-November 2008): we reached 0.2 terabasesNumberofsequences inGenBank(millions) BasepairsofDNAinGenBank(billions) BasepairsinGenBank+WGS(billions) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1982 1992 2002 2008 J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 23 Growth of GenBank Aug 2016  Prosinec 1982 680 338 bp, 606 sekvencí  Duben 2002 19 x 109 bp, 17 x 106 sekvencí + WGS 692 x 106 bp, 172 768 sekvencí  Srpen 2016 218 x 109 bp, 196 x 106 sekvencí + WGS 1,6 1012 bp, 360 x 106 sekvencí 24 WGS Interactive concepts in biochemistry, Rodney Boyer, Wiley, 2002, http://www.wiley.com//college/boyer/0470003790/ 25 Growth of DNA Sequence in Repositories Year J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 26 Growth of DNA Sequence in Repositories Year A vast amount of sequence data has been generated using next-generation sequencing. 27 Growth of DNA Sequence in Repositories B&FG 3e Fig. 2-3 Page 22 Year Perhaps 40 petabases (corresponding to 10 mil. human genomes) of DNA were generated in calendar year 2014 at major sequencing centers. 28  zahrnují soubory primárních dat – sekvencí DNA a proteinů  Proteinové sekvence:  PIR, http://pir.georgetown.edu/  MIPS, http://www.mips.biochem.mpg.de  SWISS-PROT, http://www.expasy.org/sprot/ Primární databáze 29  Standardní nukleotidové sekvence získané kvalitním sekvencováním  Typy sekvencí v primárních databázích  ESTs (Expressed Sequence Tags)  HGTS (High Throughput Genome Sequencing) - neanotované „surové“ výsledky sekvenačních projektů  Referenční sekvence anotovaných genomů  TPAs (Third Party Annotation) - sekvence anotované jinými než původními autory Primární databáze 30 GenBank (NCBI) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Primární databáze 31 Primární databáze 32 Primární databáze 33 Přístupový kód Primární databáze 34 Primární databáze 35 What is an Accession Number? An accession number is label that used to identify a sequence. It is a string of letters and/or numbers that corresponds to a molecular sequence. Examples (all for retinol-binding protein, RBP4): X02775 GenBank genomic DNA sequence NT_030059 Genomic contig Rs7079946 dbSNP (single nucleotide polymorphism) N91759.1An expressed sequence tag (1 of 170) NM_006744 RefSeq DNA sequence (from a transcript) NP_007635 RefSeq protein AAC02945 GenBank protein Q28369 SwissProt protein 1KT7 Protein Data Bank structure record Protein DNA RNA J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 36 NCBI’s important RefSeq project: best representative sequences RefSeq (accessible via the main page of NCBI) provides an expertly curated accession number that corresponds to the most stable, agreed-upon “reference” version of a sequence. RefSeq identifiers include the following formats: Complete genome NC_###### Complete chromosome NC_###### Genomic contig NT_###### mRNA (DNA format) NM_###### e.g. NM_006744 Protein NP_###### e.g. NP_006735 Page 27 J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 37 RefSeq 38 Accession Molecule Method Note AC_123456 Genomic Mixed Alternate complete genomic AP_123456 ProteinMixed Protein products; alternate NC_123456 Genomic Mixed Complete genomic molecules NG_123456 Genomic Mixed Incomplete genomic regions NM_123456 mRNA Mixed Transcript products; mRNA NM_123456789 mRNA Mixed Transcript products; 9-digit NP_123456 ProteinMixed Protein products; NP_123456789 ProteinCuration Protein products; 9-digit NR_123456 RNA Mixed Non-coding transcripts NT_123456 Genomic AutomatedGenomic assemblies NW_123456 Genomic AutomatedGenomic assemblies NZ_ABCD12345678 Genomic AutomatedWhole genome shotgun data XM_123456 mRNA AutomatedTranscript products XP_123456 ProteinAutomatedProtein products XR_123456 RNA AutomatedTranscript products YP_123456 ProteinAuto. & Curated Protein products ZP_12345678 ProteinAutomatedProtein products NCBI’s RefSeq project: many accession number formats for genomic, mRNA, protein sequences J. Pevsner, http://www.bioinfbook.org/index.php 39 Primární databáze 40 Primární databáze 41  PROSITE, http://www.expasy.org/prosite/  Databáze funkčních nebo strukturních motivů získaných srovnáváním primárních dat (sekvencí) Sekundární databáze 42  PROSITE, http://www.expasy.org/prosite/ Sekundární databáze  Databáze funkčních nebo strukturních motivů získaných srovnáváním primárních dat (sekvencí) 43  PROSITE, http://www.expasy.org/prosite/ Sekundární databáze  Databáze funkčních nebo strukturních motivů získaných srovnáváním primárních dat (sekvencí) 44  PROSITE, http://www.expasy.org/prosite/ Sekundární databáze  Databáze funkčních nebo strukturních motivů získaných srovnáváním primárních dat (sekvencí) 45  PRINTS, http://www.bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS/ Sekundární databáze  Databáze funkčních nebo strukturních motivů získaných srovnáváním primárních dat (sekvencí) 46  TRANSFAC http://www.gene-regulation.com/ Sekundární databáze Scaffold/Matrix Attached Region transaction Database 47  PDB http://www.rcsb.org/pdb/ Strukturální databáze 48  PDB http://www.rcsb.org/pdb/ Strukturální databáze 49  PDB http://www.rcsb.org/pdb/ Strukturální databáze Pekárová et al., Plant Journal (2011) 50  Schéma předmětu  Definice  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Spektrum „on-line“ zdrojů  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  GENOMOVÉ zdroje Osnova 51  NCBI Genome Data Viewer https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv / Genomové zdroje 52  Genome Browser Gateway https://genome.ucsc.edu/ Genomové zdroje 53 Genomové zdroje  Human Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway 54 Genomové zdroje  Human Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway 55 Genomové zdroje  Human Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway 56 Genomové zdroje  Human Genome Browser http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway 57 Genomové zdroje  The Arabidopsis Information Resource (TAIR) http://www.arabidopsis.org 58 Genomové zdroje  The Arabidopsis Information Resource (TAIR) http://www.arabidopsis.org AHP2 @ TAIR 59  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Vyhledávání homologií  Analytické nástroje  Spektrum „on-line“ zdrojů  GENOMOVÉ zdroje  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  Schéma přednášky Osnova 60  Globální vs. lokální přiřazení  Globální přiřazení pouze u sekvencí, které jsou si podobné a podobné délky (za cenu vnášení mezer do jedné nebo obou sekvencí)  Lokální přiřazení umožní identifikaci a srovnání i v případě porovnávání pouze úseků sekvencí s významnou mírou podobnosti, např. i při záměně pořadí proteinových domén během evoluce Cvrčková, Úvod do praktické bioinformatiky  Globální přiřazení se používá především v případě mnohačetného přiřazování (CLUSTALW, viz dále) Analytické nástroje 61  Volba správného typu přiřazení pomocí bodového diagramu (dotplot)  vynesení sekvencí proti sobě  identifikace shody v okně o dané velikosti (např. 2 bp)  „odfiltrování“ diagonál o délce menší než je mezní hodnota (threshold) Cvrčková, Úvod do praktické bioinformatiky Analytické nástroje 62  příklady srovnání sekvencí pomocí bodového diagramu  globálně lze srovnávat pouze sekvence A, B  ostatní sekvence prošly během evoluce záměnou domén a je nutné je porovnávat lokálně  bodový diagram lze získat pomocí srovnávání programem BLAST2 (viz dále) Cvrčková, Úvod do praktické bioinformatiky Analytické nástroje 63  BLAST http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ Analytické nástroje 64  Velikost vyhledávacího slova (word size): 10-11 bp, resp. 2-3 aa  Hodnocení homologie pomocí matice PAM (Point Accepted Mutation) nebo BLOSUM (BLOcks Substitution Matrix)  Primární podobnosti (seed matches)  Rozšiřování oblasti homologie doprava i doleva  Zobrazení výsledků MRKEV [delece] MRKE [záměna] MRKY [inzerce] MRAKY M R . K E V | | | : M R A K Y Matice PAM 250 Cvrčková, Úvod do praktické bioinformatiky BLAST Basic Local Alignment Search Tool 65 E= expectancy value  „expectancy value“ udává předpokládaný počet sekvencí se stejnou nebo lepší podobnosti při vyhledávání ve stejně velké databázi složené z náhodných sekvencí  výsledek udává frakci totožných a u proteinů i podobných pozic, příp. počet vložených mezer BLAST Basic Local Alignment Search Tool 66 Primární databáze 67 BLAST Basic Local Alignment Search Tool 68  vyhledávání podle zdroje (organismu) sekvencí, např. známých genomů mikroorganismů  V současnosti existuje celá řad specializovaných verzí programu BLAST  BLASTP • vyhledávání podobnosti k proteinu v databázi proteinových sekvencí  BLASTN • vyhledávání podobnosti k nukleotidové sekvenci v databázi nukleotidových sekvencí  BLASTX • vyhledávání podobnosti nukleotidové sekvence přeložené do sekvence aa v proteinové databázi • další varianty jako např. MEGABLAST pro identifikaci totožných nebo velice podobných sekvencí (vyhledává dlouhé podobné úseky nukl. sekvencí) BLAST Specializované verze 69  TBLASTN • vyhledávání podobnosti proteinové sekvence v nukleotidové databázi přeložené do sekvence aa  TBLASTX • vyhledávání k sekvenci nukleotidů přeložené do sekvence aa v databázi nukleotidových sekvencí přeložených do sekvence aa  V současnosti existuje celá řad specializovaných verzí programu BLAST BLAST Specializované verze 70  PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST) • PSI-BLAST vytváří pro každé přiřazení tzv. PSSM (Position Specific Substitution Matrix) • PSSM matice zohledňuje výskyt jedné aminokyseliny ve stejné pozici se zvýšenou frekvencí u sekvencí identifikovaných jako podobné v prvním kole pomocí BLAST, což může znamenat funkční konzervovanost • Prvním krokem je standardní BLAST, při kterém PSIBLAST identifikuje skupinu podobných sekvencí s E hodnotou lepší než minimální hodnota (standardně 0,005)  V současnosti existuje celá řad specializovaných verzí programu BLAST BLAST Specializované verze 71  PHI-BLAST (Pattern-Hit Initiated BLAST) • Sekvenci motivu je třeba vložit pomocí speciálního syntaxu • [LVIMF] znamená buď Leu, Val, Ile, Met nebo Phe • Určen k identifikaci specifické sekvence, např. motivu (pattern) v sekvenci podobných proteinových sekvencí • - je oddělovník (neznamená nic) • x(5) znamená 5 jakýchkoliv aminokyselin • x(3, 5) znamená 3 až 5 jakýchkoliv aminokyselin BLAST Specializované verze  V současnosti existuje celá řada specializovaných verzí programu BLAST 72  Příklad vyhledávání pomocí PHI-BLAST BLAST Specializované verze 73  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Vyhledávání homologií  Analytické nástroje  Spektrum „on-line“ zdrojů  Vyhledávání sekvenčních motivů, otevřených čtecích rámců, restrikčních míst….  GENOMOVÉ zdroje  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  Schéma přednášky Osnova 74 https://blog.addgene.org/free-online-molecular-biology-tools Analytické nástroje 75 SnapGene https://www.snapgene.com/snapgene-viewer/download 76  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Vyhledávání homologií  Analytické nástroje  Spektrum „on-line“ zdrojů  Vyhledávání sekvenčních motivů, otevřených čtecích rámců, restrikčních míst….  GENOMOVÉ zdroje  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  Další www genomové nástroje  Schéma přednášky Osnova 77  TIGR (The Institute for Genomic Research), http://www.tigr.org/software/  Recently part of the J. Craig Venter Institute Další WWW zdroje 78  Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) http://www.omim.org/ Další WWW zdroje 79  Role BIOINFORMATIKY v současném pojetí FUNKČNÍ GENOMIKY  Databáze  Vyhledávání homologií  Analytické nástroje  Spektrum „on-line“ zdrojů  Vyhledávání sekvenčních motivů, otevřených čtecích rámců, restrikčních míst….  GENOMOVÉ zdroje  PRIMÁRNÍ, SEKUNDÁRNÍ a STRUKTURÁLNÍ databáze  Další www genomové nástroje  Schéma přednášky Shrnutí 80 Diskuse